Introduction
Mikroorganismer er allestedsnærværende og spille vigtige roller i Jordens biogeokemiske kredsløb 1. I øjeblikket er der mange molekylære metoder til rådighed til at karakterisere mikrobielle samfunds struktur og funktion. Mest almindelige er analysen af 16S rRNA gensekvenser PCR-amplificeret fra miljømæssig DNA 2-4. En ulempe ved 16S rRNA-genet analyse er, at den kun indeholder oplysninger om fylogenetisk identitet og fællesskab struktur, med lidt information om metabolisk funktion. I modsætning hertil nærmer såsom metagenomet, metatranscriptomics og metaproteomics give oplysninger om samfunds struktur og metabolisme. Metagenomics eller analyse af indholdet af en samling af organismer gen, giver oplysninger om strukturen og funktionelle potentiale af fællesskabet 5-8. Selv kraftige, kan denne funktionelle potentiale ikke svarer til den metaboliskeaktiviteter organismerne. En organismes genotype er repræsenteret ved dets gener, som hver især kan transkriberes til RNA og videre oversat til protein, hvilket resulterer i en fænotype. Således at hjælpe med forståelsen af mikrobiel funktionel aktivitet i et miljø, bør postgenomiske analyse udføres 9. Metatranscriptomics eller analyse af RNA-transkripter er nyttig, fordi den afslører hvilke gener transskriberes i ethvert givet miljø. Men mRNA-niveauer ikke altid matcher deres tilsvarende protein niveauer på grund af translationel regulering, RNA halveringstid, og det faktum at der kan genereres flere protein kopier for hver mRNA 10.
Af disse grunde metaproteomics er nu anerkendt som et vigtigt redskab for miljømæssig mikrobiologi. Fælles metaproteomic analyser bruge et haglgevær proteomisk tilgang, hvor den nærmeste fuldtallige proteiner i en kompleks prøve renses og analyseret samtidigt, som regel gennem enzymatic fordøjelse i peptider og analyser på et massespektrometer. Efterfølgende tandem massespektrometri (MS / MS) "peptid fingeraftryk" anvendes til at bestemme peptidsekvensen og potentielle protein af ved protein databasesøgning (for en gennemgang se 11). Proteomisk arbejde er kommet langt i de seneste 25 år takket være stigningen i genomisk datatilgængelighed og stigningen i følsomheden og nøjagtigheden af massespektrometre giver mulighed for high-throughput protein identifikation og kvantificering 11,12. Da proteiner er slutproduktet af genekspression, kan metaproteomic data til at bestemme hvilke organismer er aktive i en given miljø, og hvilke proteiner de udtrykker. Dette er en fordel, når de forsøger at bestemme, hvordan et bestemt sæt af miljømæssige variabler påvirker fænotypen af en organisme eller samfund. Tidligt blev MS / MS-baserede metaproteomic studier i havet anvendes til at identificere specifikke proteiner i målrettetmikrobielle slægter, med den første undersøgelse med fokus på lys drevne protonpumpe proteorhodopsin i SAR11 marine bakterier 13. For nylig har komparative metaproteomic analyser belyst differentielle protein ekspressionsmønstre mellem komplekse samfund. Eksempler omfatter identifikation af tidsmæssige forskydninger i stofskiftet i de kystnære nordvestlige Atlanterhav 14 eller den antarktiske halvø 5. Andre undersøgelser har beskrevet variationer i protein ekspressionsmønstre på tværs rumlige skalaer, for eksempel langs en geografisk transect fra en lav-næringsstof ocean gyre til en meget produktiv kyst upwelling systemet 15. For yderligere anmeldelser af metaproteomics anbefaler vi Schneider et al. (2010) 9 og Williams et al. (2014) 16. Målrettede proteomics har også været ansat i de seneste år at kvantificere ekspressionen af specifikke metaboliske veje i miljøet 17,18.
There er tre hovedfaser i metaproteomic analyse. Den første fase er prøveforberedelse, som omfatter prøveindsamling, cellelyse og koncentrationen af protein. Indsamling af prøver i marine mikrobiologi ofte indebærer filtrering af havvand gennem et pre-filter for at fjerne større eukaryote celler, partikler og partikel-associerede bakterier, efterfulgt af filtrering til opsamling af frie levende mikrobielle celler, almindeligvis med anvendelse af en 0,22 um patron filterenhed 19,20. Disse filtre er incased i en plastik cylinder og cellelyse og proteinekstraktion protokol, der kan udføres inden for filterenheden ville være et værdifuldt værktøj. Når biomassen stammer, skal cellerne lyseres for at muliggøre protein ekstraktion. Adskillige fremgangsmåder kan anvendes, herunder guanidin-HCI lysis 21 og natriumdodecylsulfat (SDS) -baserede lysis metoder. Selvom rengøringsmidler som SDS er meget effektive til at forstyrre membraner og solubilisering mange protein typer, Concentrations så lav som 0,1% kan forstyrre nedstrøms protein fordøjelse og MS-analyse 22. Af stor bekymring er de negative virkninger af SDS på trypsinfordøjelse effektivitet, opløsningsevne af omvendt fase væskekromatografi og ion suppression eller akkumulering inde i ionkilden 23.
Den anden fase er fraktionering og analyse, hvor proteiner underkastes enzymatisk fordøjelse efterfulgt af LC MS / MS-analyse, hvilket resulterer i am / z fragmentering mønster, der kan anvendes til at fastslå den primære aminosyresekvens af den oprindelige tryptiske peptid. Forskellige fordøjelse metoder kan udføres afhængigt af de typer af rengøringsmidler samt downstream massespektrometri arbejdsgang. I vores protokol, er 1-D PAGE-elektroforese efterfulgt af fjernelse af SDS fra gelen udnyttes for at fjerne enhver forurening detergent. Analysen af proteiner som er vanskelige at solubilisere, såsom membranproteiner, kræver anvendelse af høje koncentioner af SDS eller andre rengøringsmidler. Dette fører til kompatibilitetsproblemer med SDS-gelelektroforese. Hvis formålet med en undersøgelse kræver solubilisering af disse svært at solubilisere proteiner, kan rør-gel-systemet anvendes 22,24. Røret-gel-metoden omfatter proteiner i gelmatrixen uden brug af elektroforese. Efterfølgende nogen rengøringsmidler, der anvendes til opløsning fjernes før protein fordøjelse.
Den tredje fase er den bioinformatiske analyse. I denne fase er søgte MS / MS peptid data mod en database oversatte nukleotidsekvenser at bestemme, hvilke peptider og proteiner er til stede i prøven. Identifikationen af peptider er afhængig af databasen der søges imod. Marine metaproteomic data er almindeligt søges mod databaser består af reference- genomer, metagenomisk data såsom Global Ocean Sampling datasæt 25, såvel som enkelte celle forstærkes genomer fra udyrkede lineages 26,27. Proteinidentifikation kan også øges ved inddragelse af metagenomisk sekvenser fra den samme prøve som metaproteomic data stammer 5.
Her giver vi en protokol til generering af peptider, der er egnede til MS / MS-baseret analyse fra mikrobielle biomasse indsamlet af filtrering og gemt i en RNA stabilisering løsning. Protokollen beskrevet her tillader DNA og protein, der skal isoleres fra den samme prøve, således at alle trin, der fører op til proteinet og DNA-udfældninger er identiske. Fra et praktisk perspektiv er mindre filtrering nødvendig, da kun det ene filter er påkrævet for både protein og DNA-ekstraktion. Vi vil også gerne anerkende, at denne protokol blev skabt gennem en kombination, tilpasning og ændring af to tidligere publicerede protokoller. Cellelysis trin er tilpasset fra Saito et al. (2011) 28 og i-gel trypsinnedbrydningsprodukt komponent er tilpasset fra Shevchenko et al. (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Reagenser
- Forbered SDS-ekstraktionsopløsning: 0,1 M Tris-HCI, pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA og 1% SDS. Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C.
- Der tilberedes nødvendige reagenser til polyacrylamidgel.
- Udarbejde 1.5 M Tris-HCI pH 8,8. Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,22 um filter og opbevares ved stuetemperatur.
- 0,5 M Tris-HCI pH 6,8. Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,22 um filter og opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 10% SDS. Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,22 um filter og opbevares ved stuetemperatur.
- Fremstille opløsninger, der er nødvendige for in-gel trypsinnedbrydningsprodukt og peptid ekstraktion.
- Forbered 100 mM ammoniumbicarbonat. Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered 1 M DTT bestande. Suspenderet i 100 mM ammoniumbicarbonat og opbevares ved -80 ° C.
- Forbered 550 mM iodacetamid bestande. Suspenderet i100 mM ammoniumbicarbonat og opbevares ved -80 ° C.
- Forbered 100 ng / pi trypsin bestande. Portion 60 pi i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
- Forbered ekstraktionsopløsning: 1% myresyre, 2% acetonitril.
- Forbered resuspension opløsning: 5% acetonitril og 0,1% myresyre.
2. Udfør Cell Lysis i patronfilter Enhed med celler bevaret i RNA Stabilization Solution
- Udvise RNA stabilisering opløsning fra patronen filterenhed (1,5 ml) og ind i en 2 ml mikrocentrifugerør ved anvendelse af en 60 ml sprøjte fastgjort ved luer-lock ende af filteret.
- Centrifugeres 2 ml mikrocentrifugerør i 10 minutter ved 17.000 xg for at pelletere eventuelle cellerester. Dette gøres således, at filteret i trin 2.3 ikke tilstopper.
- Overfør supernatanten til et 10 K ultracentrifugal filterenhed at fange eventuelle proteiner fra celler, der har lyserede fra fryse / thaw af prøven. Smid ikke pillen. Det vil blive anvendt i trin 2.5. Udfør centrifugering af ultracentrifugal filterenheden på 3.270 xg i 30 minutter eller indtil volumenet er reduceret til omkring 600 pi.
- Smelt spidsen af en p10 spids og blokere ikke luer-lock side af patronen filterenhed med den åbne ende af spidsen. Dette vil sikre, at ingen udvinding buffer og biomasse undslipper under trin 2,5-2,7.
- Suspender pellet i 1 ml SDS-ekstraktionsopløsning og pipette i den oprindelige patron filterenheden. Den nemmeste måde at pipette ind i patronen filterenheden er at stable en P200 tip på en P1000 tip og bruge denne dobbelte tip til pipettering.
- Der tilsættes 1 ml SDS ekstraktionsopløsning til patronfilter enhed, så det samlede volumen er ca. 2 ml og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur under rotation i en hybridiseringsovn. Placer 3 krøllede lab servietter på bunden af en 50 ml konisk rør. Parafilm begge ender af patronen filterenhed lukketog sætte patronen filterenheden i 50 ml rør. Luk låget og anbringes i ovnen hybridisering.
- Efter 10 min sted Sterivex filtrere på en skum floater og fastgør det på plads med en 5 ml sprøjte på luer-lock ende. Flyde og inkuber i et 95 ° C vandbad i 15 min.
- Lad patronen filterenheden køligt og rotere ved stuetemperatur i 1 time (som i trin 2.6).
- Udvise SDS ekstraktionsopløsning / cellelysat ud af filteret med en 60 ml sprøjte i den samme ultracentrifugal filterenhed som før (trin 2.3). Der tilsættes 1 ml frisk SDS ekstraktionsopløsning til patronen filterenheden og blandes i 30 sekunder i hånden, derefter udvise i ultracentrifugal filterenheden ved hjælp af 60 ml sprøjte. Dette er for at skylle patronen filterenheden at sikre alle proteiner er blevet fjernet.
- Udfør centrifugering på ultracentrifugal filterenhed i 45 min ved 3270 xg, eller indtil den mængde i filterenheden er mindre end 600 pi.
- Kassér gennemstrømning og top op ultracentrifugal filterenhed med frisk SDS-ekstraktionsopløsning.
- Centrifuger filterenheden for en anden 45 minutter ved 3.270 x g.
- Gentag trin 2.11 og 2.12 gange mere. Sørg for endelige volumen i ultracentrifugal filterenhed er højst 600 pi i slutningen af den sidste spin.
- På dette tidspunkt opdeles koncentratet i to. Den ene fraktion vil blive anvendt til DNA udfældning og den anden for proteinudfældelse.
Bemærk: fraktionering beløb afhænger af mængden af biomasse, som blev filtreret og den påtænkte anvendelse af produkterne. I vores tilfælde, vi delt koncentratet med 10% mod DNA nedbør og 90% mod proteinpræcipitation.
3. Protein Precipitation
- Tilføj 4 volumener methanol: acetone (50:50) til et volumen koncentrat og vortex i 10 sek. Inkuber natten over ved -20 ° C.
- Spin ned ved 17.000 xg i 30 min. Dekanteresog lad pillen (kan være usynlig) tør i en speedvac i 1 time (eller indtil tør).
Bemærk: Må ikke over tørre pillen, da dette kan gøre det vanskeligt at resuspendere. - Suspender pellet i 25 pi SDS-ekstraktionsopløsning. Lad det sidde i en time og derefter resuspenderes ved pipettering op og ned.
- Kvantificere protein under anvendelse af et protein assay kit og fabrikantens anvisninger.
4. DNA Nedbør
- Tilføj SDS-ekstraktionsopløsning til fraktionen koncentrat, der skal anvendes til DNA-udfældning indtil 500 pi mærket. Dette trin er simpelthen at øge mængden af opløsningen, hvilket gør det nemmere at arbejde med.
- Tilføj 0,583 volumener af et protein fældningsreagens (såsom MPC proteinudfældelse reagens) og vortex i 10 sek. Du bør se et hvidt bundfald form.
Bemærk: Vi har også anvendt phenol: chloroform DNA ekstraktionsmetoder, men det er vanskeligere på grund af de små mængder. Vi opnåede bedre DNA-udbytter ved hjælp afMPC Protein Udfældningsreagens. - Der centrifugeres ved 17.000 xg og 4 ° C i 10 minutter.
- Overfør supernatanten til et andet 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes 0,95 volumener isopropanol. Vend 30-40 gange.
- Centrifuger i 10 minutter ved 4 ° C ved maksimal hastighed.
- Dekanteres forsigtigt og kassér supernatanten.
- Skyl to gange med 750 pi 70% ethanol.
- Fjern så meget ethanol som muligt ved pipettering, så lad lufttørre.
Bemærk: Må ikke over tørre DNA som det kan gøre det vanskeligt at resuspendere. - Resuspender i 25 pi TE-buffer med lav pH 8 (10 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA).
- Kvantificere DNA'et under anvendelse af et dsDNA assay kit og fabrikantens anvisninger. Udfør agarosegel (1%) elektroforese på 3 pi af DNA for at kontrollere dets kvalitet.
5. SDS-PAGE-gel af proteiner
- Forbered prøvebuffer (950 pi Laemmli prøvepuffer og 50 pi β-mercaptoethanol). </ li>
- Tilføj det tilsvarende volumen for 15 ug protein eller et max på 20 pi til tilsvarende volumen prøvebuffer og koges i 4 min. Prøver kan nu opbevares ved -80 ° C indtil SDS-PAGE kan udføres.
- Forbered 10% acrylamid adskillelsesgelen med en 5% acrylamid stacking gel.
- Læg gelen med prøver og 4 pi af en protein stige. Man lader gelen løbe ved konstant 120 V indtil 250 kDa stigen markering har netop nået adskillelsesgelen.
- Farv gelen under anvendelse af en coomassie baseret plet ifølge producentens anvisninger.
6. In-gel trypsinnedbrydningsprodukt og peptid Extraction
Bemærk: Alle trin fra her indtil 6.10 udføres i et biologisk sikkerhedsskab for at minimere forurening.
- Skær overskydende gel under 10 kDa stigen mærke for hver bane. Hver bane vil blive analyseret på MS / MS separat. Skær hver bane i 1 mm x 1 mm firkanter for at øge overfladearealet og placere alle squares fra banen i en lav-bindende mikro-centrifugerør. Gentag dette for alle baner. (1% eddikesyre kan anvendes til at forhindre gelen i at tørre ud og blive svært at skære).
Bemærk: Minimering forurening er kritisk på dette stadium, så gel udskæring udføres i en biologisk sikkerhedsskab på glasset SDS-PAGE-gel form, der anvendes til at gøre gelen. - De-plet
- Dispensér 50 pi 100 mM ammoniumbicarbonat i hver lav-bindende rør tæt hætte og inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter.
- Dispensér 50 pi acetonitril tæt hætte og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter.
- Aspirer og kassér 150 pi.
- Gentag trin 6.2.1 og 6.2.2.
- Aspirer og kassér 95 pi.
- Dehydrering
- Dispenser 50 pi acetonitril tæt hætte og vente 5 min. Aspirer og kassér 45 pi og vente 10 min.
- Reduktion
- Dispensere 50 pi DTT (10 mM, fortyndet i 100 mM AMMonium bikarbonat), luk kasket og vente 30 minutter ved 37 ° C.
- Alkylering
- Dispenser 50 pi iodacetamid (55 mM, fortyndet i 100 mM ammoniumbicarbonat), luk kasket og vente 20 minutter ved 37 ° C.
- Dispenser 100 pi acetonitril tæt hætte og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Aspirer og kassér 195 pi.
- Vaske
- Dispensere 50 pi ammoniumbicarbonat tæt hætte og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Dispensér 50 pi acetonitril tæt hætte og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter. Aspirer og kassér 120 pi.
- Dehydrering
- Dispenser 50 pi acetonitril tæt hætte og vente 5 min. Aspirer og kassér 45 pi.
- Dispensér 50 pi acetonitril, vent 5 min.
- Aspirer og kassér 75 pi og vente 5 min.
- Fordøjelsen
- Dispensere 25-30 pi 6 ng / pl trypsin (until alle gelfragmenter er dækket). Luk hætte og vente 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber natten over (4,5 timer minimum) ved 37 ° C.
- Lad stå ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Ekstraktion og Peptid Transfer
- Dispensér 30 pi ekstraktionsopløsning og dække med låg i 30 minutter på is.
- Aspirer 30 pi og dispensere udsuget mængde i et nyt mærket med lav bindende rør.
- Dispensér 12 pi ekstraktionsopløsning og 12 pi acetonitril i den oprindelige rør (med gel). Luk hætte og inkuberes i 30 minutter på is.
- Aspirer 15 pi og deponering i det nye rør.
- Gentag trin (6.9.3 og 6.9.4).
- Placer nye rør i en SpeedVac indtil tør.
- Resuspender i 50 pi resuspension opløsning. Vortex på medium i 10 min for at resuspendere.
- Pipette peptidopløsning til enten nano / LC hætteglas eller 96-brønds plader er egnede til nano / LCMS / MS arbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstration, vi udførte protokollen om to havvand prøver indsamlet fra overfladen og den maksimale af det kystnære hav i det nordlige Canada klorofyl. Mens på havet, blev 6-7 liter havvand ledes gennem en 3 um GF / D forfilter, derefter mikrobielle celler blev opsamlet på et 0,22 um patronfilter enhed ifølge protokollen af Walsh et al. 20. Celler blev straks opbevares i en RNA stabilisering opløsning, indtil yderligere bearbejdning. Efter vender tilbage til laboratoriet, vi udførte protokollen, som det er præsenteret her. Den koncentrerede cellelysat blev delt; protein blev udfældet fra 90% af den mængde, mens DNA blev udfældet fra de resterende 10% af volumenet. Vi genvundet 24-26 ug protein og 250 til 308 ng høj kvalitet DNA fra disse prøver (figur 1). Efter i-gel trypsinfordøjelse og peptid ekstraktion, underkastede vi peptiderne til MS / MS-analyse under anvendelse af en nano-LC koblet til Orbitrap Elite massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Fra peptiderne, vi genereret over 23.000 MS / MS-spektre per prøve. Peptider og proteiner blev derefter identificeret ved at søge disse spektre mod en brugerdefineret in-house sekvens database ved hjælp toppene bioinformatik værktøjet (BSI, Waterloo, ON, Canada). Databasen bestod af forudsagte proteiner fra marine referencepunkter genomer og metagenomes. Søgningen resulterede i identifikationen af omkring 1.000 peptider og 700-800 proteiner til hver prøve. Naturligvis disse resultater er afhængige af mikrobiel celle overflod, MS instrumentering og protein søgedatabasen og algoritmer. Ikke desto mindre viser disse resultater, at denne protokol har potentiale til at producere tilstrækkelige tryptiske peptider er egnede til at identificere hundredvis af proteiner i miljøet. Da metagenomisk biblioteker kan konstrueres fra så lidt som 100 ng DNA 30, denne protokol har også potentiale til at levere tilstrækkelige mængder af DNAat generere matchede metagenomisk-metaproteomic datasæt.
Taksonomiske og funktionelle sammensætning af metaproteomes blev analyseret ved anvendelse af en kombination af BLASTP og MEGAN (metagenomet analysator) softwarepakke 31,32 (Figur 2). Proteiner tildelt Alpha-Proteobacteria var de mest repræsenteret i datasættet, langt de fleste, der blev tildelt til SAR11 clade. Den Rhododobacterales clade af Alpha-Proteobacteria blev også stærkt repræsenteret og identificeret oftest i overfladevand. Proteiner tildelt Bacteroidetes var jævnt fordelt mellem den maksimale overflade og klorofyl, men Flavobacteria proteiner blev identificeret i højere grad ved den maksimale klorofyl. Gamma-proteobacterial proteiner blev jævnt fordelt i hele vandsøjlen, mens beta-proteobacterial proteiner blev fundet overvejende i overfladen . Fraet funktionelt perspektiv, blev identificeret en lang række metaboliske veje. Lodret strukturering af disse metaboliske veje var tydelig. For eksempel blev proteiner associeret med aminosyremetabolismen, kulhydratstofskiftet og prokaryote kulstoffiksering veje primært identificeret ved overfladen og nitrogen metabolisme blev udelukkende fundet på overfladen. Fotosyntetiske kulstoffiksering proteiner blev observeret primært ved den maksimale klorofyl, mens proteiner involveret i fotosyntese blev identificeret jævnt mellem overfladen og maksimal klorofyl. Disse resultater viser, at en lang række proteiner fra en mangfoldighed af mikrobiel taxa kan detekteres under anvendelse af protokollen præsenteres her.
Figur 1:. Genomisk DNA fra 2 dybder på Arktisk Station S633 Den første bane indeholder 4 pi af en 1 kb DNA-ladder, bane 2 indeholder 3 pi af genomisk DNA ekstraktion fra S633_2 m, bane 3 indeholder 3 pi af genomisk DNA ekstraktion fra S633_20 m og banerne 4-6 indeholder 0,5 pi (85 ng), 2 pi (333 ng) og 4 pi ( 667 ng) af HindIII-fordøjet lambda DNA.
Figur 2:. Taksonomisk og funktionel analyse af 2 dybder på Arktisk station S633 Taxonomisk mangfoldighed sammenligning af de arktiske station 633 overflade og klorofyl maksimum farvande (A) oprettet ved hjælp MEGAN. Funktionel mangfoldighed sammenligning af de arktiske station 633 overflade og klorofyl maksimum farvande (B), der er oprettet ved hjælp MEGAN at forespørge mod Kegg databasen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prøve bevarelse er nøglen til metaproteomic undersøgelser og tidligere arbejde viste, at et RNA-stabilisering løsning er et nyttigt lagerbuffer til lagring af celler før proteinekstraktion 28. Ideelt set ville prøverne bevaret in situ at negere skift i proteinekspression under håndtering 33,34. Faktisk har in situ blevet udviklet prøvetagning og fiksering teknologier, som gør det muligt for den autonome indsamling og bevaring af prøver med skib-indsat instrumenter. , Adgang til disse teknologier er imidlertid ikke altid muligt. I almindelige tilfælde, at det ikke er tilfældet, bør prøverne bevaret så hurtigt som muligt efter indsamlingen.
Her præsenterer vi en protokol for at udvinde protein fra RNA stabilisering løsning lagrede celler opsamlet på en patron filter enhed, som er almindeligt anvendt i akvatiske mikrobiologi. Protokollen indeholder cellelyse under anvendelse af en SDS-lyseopløsning og opvarmning, efterfulgt af en PRotein koncentreringstrin hjælp ultracentrifugal filteranlæg, som fordoblet som et nødvendigt afsaltningstrin. Det skal bemærkes, at de koncentrerer sig og afsaltning trin ikke kan overses. Vi fandt, at et minimum af tre bufferskift trin var forpligtet til at afsalte vores koncentrat. På grund af den høje saltkoncentration af RNA stabilisering løsning, hvis korrekt afsaltning ikke forekommer, for meget salt vil udfældes under overnight proteinudfældelse trin og afsaltning og præcipitationstrin skal gentages. Desuden, hvis afsaltning ikke er korrekt udført 1D-PAGE vil ikke arbejde og prøverne vil blive tabt.
Dernæst blev den koncentrerede lysat delt op, så både protein nedbør og DNA præcipitation kunne udføres. Dette er nyttigt, da det ofte er ønskeligt, at metagenomisk og metaproteomic data genereres ud fra de samme prøver. Hvis et protein ikke er repræsenteret i proteinsekvensen database så peptidet vilikke identificeres. Herunder de genomiske data fra den samme prøve som proteomiske data reducerer risikoen for ikke at kunne identificere et protein på grund af sit fravær fra databasen.
Selv denne protokol er optimeret til anvendelse med patron filterenheder og valideret til at arbejde på kysten ocean mikrobielle samfund, kan den tilpasses til anvendelse sammen med andre typer af miljøprøver og filtre. Dog bør det klart fremgå, at succesen af denne protokol er afhængig af en tilstrækkelig mængde af start biomasse. Derfor vil der i akvatiske økosystemer, hvor biomassen kan være meget lav, anbefaler vi øge mængden af vand, filtreres i overensstemmelse hermed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al.
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C.
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
