Introduction
Micro-organismen zijn alomtegenwoordig en spelen een essentiële rol in de aarde biogeochemische cycli 1. Momenteel zijn er tal van moleculaire benaderingen beschikbaar voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen structuur en functie. Meestal wordt de analyse van 16S rRNA gensequenties PCR-geamplificeerd van milieu DNA 2 - 4. Een nadeel van 16S rRNA gen analyse is dat het alleen informatie over de identiteit en fylogenetische Gemeenschapsstructuur weinig informatie over metabolische functie. In tegenstelling, benaderingen zoals metagenomica, transcriptoomstudie en MetaProteomics geven informatie over de gemeenschap structuur en de stofwisseling. Metagenomica, of de analyse van het gen inhoud van een verzameling van organismen, geeft informatie over de structuur en de functionele mogelijkheden van de gemeenschap 5-8. Hoewel krachtig kan deze functionele potentie niet overeenstemmen met de metabolischeactiviteiten van organismen. Genotype van een organisme wordt vertegenwoordigd door de genen, die elk kunnen worden getranscribeerd naar RNA en verder vertaald naar eiwit, wat resulteert in een fenotype. Dus, om te helpen bij het begrijpen van microbiële functionele activiteit in een omgeving moet postgenomische analyse uitgevoerd 9. Transcriptoomstudie of de analyse van RNA-transcripten is nuttig omdat het toont welke genen worden getranscribeerd in een bepaalde omgeving. Echter, mRNA niet altijd overeenkomen met hun overeenkomstige proteïne verhogen door translationele regulering, RNA halfwaardetijd, en het feit dat meerdere kopieën eiwit kan worden gegenereerd voor iedere 10 mRNA.
Om deze redenen MetaProteomics wordt nu erkend als een belangrijk instrument voor het milieu microbiologie. Gemeenschappelijke metaproteomic analyseert gebruik een shotgun proteomics aanpak waar de buurt volledige aanvulling van eiwitten in een complex monster worden gezuiverd en tegelijkertijd geanalyseerd, meestal door middel van een eigenzymatic spijsvertering in peptiden en analyses over een massaspectrometer. Daaropvolgende tandem massaspectrometrie (MS / MS) "peptide fingerprinting" wordt gebruikt om de peptidesequentie en potentiële eiwit van oorsprong door proteïne-database zoeken (zie voor een overzicht 11) te bepalen. Proteomics werk heeft een lange weg afgelegd in de afgelopen 25 jaar, dankzij de stijging van de genomische beschikbaarheid van gegevens en de toename van de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van massaspectrometers waardoor high-throughput identificatie en kwantificatie 11,12 eiwit. Aangezien eiwitten zijn het eindproduct van genexpressie, kan metaproteomic gegevens te bepalen welke organismen actief zijn in een bepaalde omgeving en welke eiwitten ze tot expressie zijn. Dit is voordelig wanneer het proberen om te bepalen hoe een bepaalde set van omgevingsvariabelen het fenotype van een organisme of de gemeenschap zal beïnvloeden. Vroeg, MS / MS-gebaseerde metaproteomic studies in de oceaan werden gebruikt om specifieke eiwitten te identificeren in gerichtemicrobiële lineages, eerste studie gericht op het licht aangedreven proton pomp proteorhodopsin in SAR11 mariene bacteriën 13. Recenter zijn vergelijkende analyses metaproteomic differentiële eiwit expressiepatronen tussen gemeenschappen die toegelicht. Voorbeelden zijn onder meer de identificatie van temporele verschuivingen in de stofwisseling in de kust Noordwest-Atlantische Oceaan 14 of het Antarctisch Schiereiland 5. Andere studies hebben veranderingen beschreven in eiwitexpressie patronen in ruimtelijke schalen, bijvoorbeeld langs een geografisch transect een lage nutriënt ocean wervel een hoogproductieve kust opwelling systeem 15. Voor verdere beoordelingen van MetaProteomics raden wij Schneider et al. (2010) 9 en Williams et al. (2014) 16. Gerichte proteomics is ook werkzaam in de afgelopen jaren expressie van specifieke metabole pathways kwantificeren milieu 17,18.
There zijn drie belangrijke fasen in metaproteomic analyse. De eerste fase is monstervoorbereiding die monsterneming, cellysis en concentratie van eiwit bevat. Monsterverzameling in mariene microbiologie leidt vaak filtratie van zeewater door een voorfilter grotere eukaryotische cellen, deeltjes en deeltjes geassocieerde bacteriën te verwijderen, gevolgd door filtreren voor het afvangen van vrij levende microbiële cellen, gewoonlijk met behulp van een 0,22 um cartridge filterinstallatie 19,20. Deze filters zijn ingegoten in een kunststof cilinder en een cellyse en eiwit-extractie protocol dat binnen de filtereenheid kan worden uitgevoerd, kunnen een waardevol instrument zijn. Zodra biomassa wordt verkregen, moeten de cellen worden gelyseerd om voor eiwitextractie. Verschillende werkwijzen kunnen worden toegepast, zoals guanidine-HCl lysis 21 en natriumdodecylsulfaat (SDS) lysis gebaseerde methoden. Hoewel wasmiddelen als SDS zijn zeer efficiënt bij het verstoren van membranen en het oplosbaar maken vele soorten eiwitten, concentratiONS zo laag als 0,1% kunnen interfereren met stroomafwaartse eiwit vertering en MS-analyse 22. Van groot belang is de negatieve effecten van SDS voor trypsinedigestie efficiency, oplossend vermogen van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en ion onderdrukking of accumulatie in de ionenbron 23.
De tweede fase fractionering en analyse, waarbij eiwitten worden onderworpen aan enzymatische digestie gevolgd door LC MS / MS analyse, waardoor am / z fragmentatiepatroon die kunnen worden gebruikt voor de primaire aminozuursequentie van het tryptische peptide initiële bepalen. Verschillende digestiemethoden kunnen worden gebruikt afhankelijk van de soorten reinigingsmiddelen gebruikt, evenals de stroomafwaartse massaspectrometrie workflow. In het protocol wordt 1-D PAGE elektroforese, gevolgd door verwijdering van SDS uit de gel gebruikt om eventuele verontreinigingen te verwijderen detergens. De analyse van eiwitten moeilijk oplosbaar, zoals membraaneiwitten zijn, vereist het gebruik van hoge concentraties van SDS of andere schoonmaakmiddelen. Dit leidt tot compatibiliteitsproblemen met SDS-gelelektroforese. Wanneer het doel van onderzoek vereist het oplossen van deze harde eiwitten oplosbaar te maken, kan de buis-gelsysteem gebruikt 22,24. De buis-gel methode omvat eiwitten in de gel matrix zonder het gebruik van elektroforese. Vervolgens elke reinigingsmiddelen gebruikt voor het oplosbaar zijn voor de vertering van eiwitten verwijderd.
De derde fase is de bio-informatica-analyse. In deze fase worden de MS / MS peptide data doorzocht tegen een databank van vertaald nucleotidesequenties te bepalen welke peptiden en proteïnen in het monster aanwezig zijn. De identificatie van peptiden is afhankelijk van de databank wordt doorzocht tegen. Marine metaproteomic gegevens worden vaak gezocht tegen databases bestaat uit referentie genomen, metagenomic gegevens zoals het Global Ocean Sampling dataset 25, evenals enkele cel versterkt genomen uit onontgonnen lineages 26,27. Eiwit identificatie kan ook worden verhoogd door het opnemen van metagenomic sequenties van hetzelfde monster als metaproteomic data afkomstig 5.
Hier geven we een protocol voor het genereren van peptiden die geschikt zijn voor MS / MS-gebaseerde analyse van microbiële biomassa door filtratie verzameld en opgeslagen in een RNA stabilisatie oplossing. De hier beschreven protocol zorgt voor DNA en eiwitten te worden geïsoleerd van hetzelfde monster, zodat alle stappen in de aanloop naar het eiwit en DNA neerslag zijn identiek. Vanuit praktisch oogpunt, minder filtering nodig omdat slechts één filter is vereist voor zowel eiwit- en DNA-extractie. We willen ook graag om te erkennen dat dit protocol werd gecreëerd door de combinatie, aanpassing en wijziging van de twee eerder gepubliceerde protocollen. De cellysis stappen worden aangepast van Saito et al. (2011) 28 en de in-gel trypsinedigest component wordt aangepast van ShevcheNKO et al. (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid reagentia
- Bereid SDS-extractie-oplossing: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA en 1% SDS. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid voorraad reagentia die nodig zijn voor de polyacrylamidegel.
- Bereid 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
- 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid 10% SDS. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid oplossingen nodig voor in-gel trypsine verteren en peptide extractie.
- Bereid 100 mM ammoniumbicarbonaat. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid 1 M DTT voorraden. Gesuspendeerd in 100 mM ammoniumbicarbonaat en bewaar bij -80 ° C.
- Bereid 550 mm joodacetamide voorraden. Gesuspendeerd in100 mM ammoniumbicarbonaat en bewaar bij -80 ° C.
- Bereid 100 ng / ul trypsine voorraden. Aliquot 60 ul in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C.
- Bereid extractieoplossing: 1% mierezuur, 2% acetonitril.
- Bereid resuspensie oplossing: 5% acetonitril en 0,1% mierenzuur.
2. Voer cellysis in Cartridge Filter Unit met Cellen Bewaarde in RNA Stabilization Solution
- Verdrijf het RNA stabiliseren oplossing uit de cassette filtereenheid (1,5 ml) en in een 2 ml microcentrifugebuis met een 60 ml injectiespuit bevestigd aan de luer-lock uiteinde van het filter.
- Centrifugeer de 2 ml microcentrifugebuis gedurende 10 min bij 17.000 xg één celafval te pelleteren. Dit wordt gedaan zodat het filter in stap 2,3 niet verstoppen.
- Breng supernatant van een 10 K ultracentrifugale filtereenheid één eiwitten afkomstig van cellen die zijn gelyseerd door het bevriezen / tha vangenw van het monster. Laat de pellet niet weg. Het wordt gebruikt in stap 2,5. Voer centrifugeren van de ultracentrifugale filtereenheid bij 3270 g gedurende 30 minuten of totdat het volume teruggebracht tot ongeveer 600 pl.
- Smelt de punt van een p10 tip en blokkeert de niet luer-lock van het patroonfilter eenheid met het open uiteinde van de punt. Dit zal ervoor zorgen dat er geen extractiebuffer en biomassa ontsnapt tijdens stappen 2,5-2,7.
- Hang de pellet in 1 ml SDS-extractie-oplossing en pipet het in de originele cartridge filter. De eenvoudigste manier om pipet in de cartridge filter unit is om een P200 tip stapelen op een P1000 tip en gebruiken deze dubbele tip voor pipetteren.
- Voeg 1 ml van SDS extractieoplossing de cartridge filtereenheid zodat het totale volume ongeveer 2 ml en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder roteren in een hybridisatieoven. Plaats 3 verfrommeld lab doekjes onderin een 50 ml conische buis. Parafilm beide uiteinden van de cartridge filtereenheid geslotenen zet de cartridge filter unit in de 50 ml buis. Sluit het deksel en zet de buis in de hybridisatie oven.
- Na 10 min plaats de Sterivex filteren op een schuim drijver en zet hem op zijn plaats met een 5 ml spuit op de luer-lock end. Zweven en incuberen in een 95 ° C waterbad gedurende 15 minuten.
- Laat de cartridge filtereenheid koel en roteren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (als in stap 2,6).
- Verdrijf de SDS extractieoplossing / cellysaat van het filter met een injectiespuit 60 ml in dezelfde ultracentrifugale filtereenheid zoals hierboven (stap 2,3). Voeg 1 ml vers SDS extractieoplossing de cartridge filtereenheid en meng gedurende 30 seconden met de hand, dan verdrijven in de ultracentrifugale filtereenheid met de injectiespuit 60 ml. Dit is de cartridge filtereenheid spoelen zodat alle eiwitten zijn verwijderd.
- Voer centrifugeren op de ultracentrifugale filtereenheid gedurende 45 min bij 3270 xg of totdat het volume in de filtereenheid is dan 600 pi.
- Discard doorstroming en vul de ultracentrifugale filter unit met verse SDS-extractie-oplossing.
- Centrifugeer de filtereenheid nog eens 45 min bij 3270 x g.
- Herhaal de stappen 2,11 en 2,12 keer meer. Zorg het eindvolume van de ultracentrifugale filtereenheid ten hoogste 600 ul aan het einde van de laatste centrifuge.
- Op dit moment het concentraat verdeeld in twee. Één fractie wordt gebruikt voor DNA precipitatie en een voor proteïneprecipitatie.
Opmerking: De fractionering bedrag is afhankelijk van de hoeveelheid biomassa die werd gefiltreerd en het beoogde gebruik van de producten. In ons geval, we deelden het concentraat met 10% voor DNA precipitatie en 90% aan eiwit neerslag.
3. Eiwit neerslag
- Voeg 4 volumes methanol: aceton (50:50) om een hoeveelheid concentraat en vortex gedurende 10 seconden. Incubeer overnacht bij -20 ° C.
- Spin neer op 17.000 xg gedurende 30 minuten. Schenk de bovenstaande vloeistofen laat de pellet drogen (kan onzichtbaar zijn) in een speedvac gedurende 1 uur (of tot het droog is).
Let op: Niet te droog de korrel, omdat dit het moeilijk te mengen kunnen maken. - Suspendeer de pellet in 25 pl SDS-extractievloeistof. Laat deze een uur daarna mengen door op en neer pipetteren.
- Kwantificeren eiwit met een eiwit assay kit en de fabrikant.
4. DNA Neerslag
- Add SDS-extractieoplossing aan het concentraat fractie wordt gebruikt voor DNA precipitatie tot 500 ul merk. Deze stap is slechts het volume van de oplossing te verhogen, waardoor het makkelijker te verwerken.
- Voeg 0,583 delen van een eiwit precipitatiereagens (zoals MPC eiwit precipitatiereagens) en vortex gedurende 10 seconden. Je moet een witte neerslag vorm zien.
Opmerking: we hebben ook fenol: chloroform DNA-extractie werkwijzen, maar het is moeilijker vanwege de lage volumes. We verkregen DNA betere opbrengst met deMPC Protein precipitatiereagens. - Centrifugeer bij 17.000 xg en 4 ° C gedurende 10 min.
- Breng supernatant naar een andere 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 0,95 volumes isopropanol. Inverteer 30-40 keer.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C met maximale snelheid.
- Voorzichtig decanteren en gooi het supernatant.
- Tweemaal spoelen met 750 pl 70% ethanol.
- Verwijder zoveel ethanol als mogelijk door pipetteren, laat vervolgens aan de lucht drogen.
Let op: Niet te droog het DNA als dit het moeilijk te mengen kunnen maken. - Resuspendeer in 25 ui TE-buffer laag, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
- Kwantificeren DNA met een dsDNA testkit en de fabrikant. Voer agarosegel (1%) elektroforese op 3 gl van het DNA om de kwaliteit te controleren.
5. SDS-PAGE gel van eiwitten
- Bereid monsterbuffer (950 ui Laemmli monsterbuffer en 50 pl β-mercaptoethanol). </ li>
- Voeg de overeenkomstige volume van 15 ug eiwit, of een maximum van 20 gl gelijke volume monsterbuffer en kook 4 min. Monsters kunnen nu worden opgeslagen bij -80 ° C totdat SDS-PAGE worden uitgevoerd.
- Bereid 10% acrylamide oplossen gel met een 5% acrylamide stacking gel.
- Laad de gel met monsters en 4 pi van een proteïneladder. Voer de gel bij constante 120 V tot 250 kDa ladder marker heeft net bereikt het oplossend gel.
- Vlekken op de gel met behulp van een Coomassie beits volgens de instructies van de fabrikant.
6. In-gel trypsine Digest en Peptide Extraction
Opmerking: Alle stappen van hier tot 6.10 worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet om besmetting te minimaliseren.
- Snijd overtollige gel onder de 10 kDa ladder cijfer voor elke baan. Elke baan wordt geanalyseerd op MS / MS apart. Snijd elke baan in 1 mm x 1 mm pleinen oppervlakte te verhogen en zet alle squares van de baan in een lage-bindende micro-centrifugebuis. Herhaal dit voor alle rijstroken. (1% azijnzuur worden toegepast om de gel uitdroogt en steeds moeilijk te snijden).
Opmerking: Het minimaliseren van besmetting is essentieel in dit stadium dus gel snijden wordt uitgevoerd in een bioveiligheidskast op het glas SDS-PAGE gel mal gebruikt om de gel te maken. - De vlek
- Verdeel 50 ul van 100 mM ammoniumbicarbonaat in elk lage bindingsaffiniteit buis, sluit cap en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min.
- Verdeel 50 ul acetonitril nauwe cap en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min.
- Aspireren en gooi 150 pi.
- Herhaal de stappen 6.2.1 en 6.2.2.
- Aspireren en gooi 95 pl.
- Uitdroging
- Verdeel 50 ul acetonitril, dicht cap en wacht 5 min. Aspireren en gooi 45 ui en wacht 10 min.
- Reductie
- Verdeel 50 ul DTT (10 mM, verdund in 100 mM ammonium bicarbonaat), in de buurt cap en wacht 30 minuten bij 37 ° C.
- Alkylering
- Verdeel 50 ul joodaceetamide (55 mM, verdund in 100 mM ammoniumbicarbonaat), sluit kap en wacht 20 minuten bij 37 ° C.
- Pipetteer 100 ul acetonitril sluiten kap en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C. Aspireren en gooi 195 pi.
- Wassen
- Verdeel 50 ul ammoniumbicarbonaat, sluit cap en incubeer 10 minuten bij 37 ° C.
- Verdeel 50 ul acetonitril nauwe cap en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Aspireren en gooi 120 pl.
- Uitdroging
- Verdeel 50 ul acetonitril, dicht cap en wacht 5 min. Aspireren en gooi 45 pl.
- Verdeel 50 ul acetonitril, wacht 5 min.
- Aspireren en gooi 75 ul en wacht 5 min.
- Spijsvertering
- Verdeel 25-30 pl 6 ng / ul trypsine (until alle gel fragmenten zijn bedekt). Sluiten cap en wacht 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer overnacht (ten minste 4,5 uur) bij 37 ° C.
- Laat op kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Extractie en Peptide Transfer
- Verdeel 30 ul van extractie-oplossing en bedek met deksel gedurende 30 minuten op ijs.
- Zuig 30 ul en afzien aangezogen volume in een nieuw label low-bindend buis.
- Verdeel 12 ul extractievloeistof en 12 ul acetonitril in de oorspronkelijke buis (met gel). Sluiten cap en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Zuig 15 ul en storting in de nieuwe buis.
- Herhaal stappen (6.9.3 en 6.9.4).
- Plaats nieuwe buizen in een SpeedVac tot het droog is.
- Resuspendeer in 50 ul resuspensie oplossing. Vortex op medium voor 10 min te mengen.
- Pipetteer peptideoplossing in ofwel nano / LC flesjes of 96-well platen geschikt voor nano / LCMS / MS werk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als een demonstratie, voerden we het protocol over twee zeewater monsters van het oppervlak en de chlorofyl maximum van de kust oceaan in Noord-Canada. Op zee, 6-7 liter zeewater werd door een 3 urn GF / D prefilter, dan microbiële cellen werden verzameld op een 0,22 urn filter cartridge apparaat volgens het protocol van Walsh et al. 20. Cellen werden onmiddellijk opgeslagen in een RNA-stabilisatie oplossing totdat verdere verwerking. Bij terugkeer naar het lab, voerden we het protocol zoals het hier wordt gepresenteerd. De geconcentreerde cellysaat werd verdeeld; eiwit werd geprecipiteerd door 90% van het volume, terwijl DNA werd geprecipiteerd van de resterende 10% van het volume. We teruggewonnen 24-26 ug eiwit en 250-308 ng hoogwaardige DNA uit deze monsters (figuur 1). Na de in-gel trypsine digestie en peptide extractie, onderwierpen wij de peptiden aan MS / MS analyse met nano-LC gekoppeld aan de Orbitrap Elite massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Van de peptiden, genereerden we meer dan 23.000 MS / MS spectra per monster. Peptiden en proteïnen werden vervolgens geïdentificeerd zoekmachine deze spectra met een aangepaste interne sequentie database met behulp van PEAKS bioinformatica gereedschap (BSI, Waterloo, ON, Canada). De database is samengesteld uit voorspelde eiwitten uit mariene referentie genomen en metagenomes. De zoektocht resulteerde in de identificatie van ongeveer 1000 peptiden en proteïnen 700-800 voor elk monster. Uiteraard zijn deze resultaten afhankelijk microbiële cel overvloed, MS instrumentatie en eiwitten zoekdatabase en algoritmen. Niettemin tonen deze resultaten aan dat dit protocol heeft het potentieel om adequate tryptische peptiden geschikt om honderden proteïnen te identificeren in het milieu te verkrijgen. Aangezien metagenomic bibliotheken worden geconstrueerd uit slechts 100 ng DNA 30 Dit protocol ook potentieel om voldoende hoeveelheden DNA te verstrekkenom geëvenaard metagenomic-metaproteomic datasets te genereren.
Taxonomische en functionele samenstelling van de metaproteomes werd geanalyseerd met een combinatie van BLASTP en MEGAN (metagenoom analyzer) softwarepakket 31,32 (Figuur 2). Eiwitten gedefineerd alfa-Proteobacteria waren de meest vertegenwoordigd in de dataset, het overgrote deel toegewezen aan de SAR11 clade. De Rhododobacterales clade van Alpha-proteobacteriën werd ook zeer vertegenwoordigd en die het vaakst in het oppervlaktewater. Eiwitten gedefineerd Bacteroidetes waren gelijkmatig verdeeld tussen de maximale oppervlak en chlorofyl, maar Flavobacteria eiwitten werden geïdentificeerd met een grotere mate van het chlorofyl maximum. Gamma-proteobacterial eiwitten werden gelijkmatig verdeeld over de waterkolom terwijl beta-proteobacterial eiwitten voornamelijk gevonden in het oppervlak . Vanfunctioneel oogpunt uiteenlopende metabole pathways geïdentificeerd. Verticale structurering van deze metabole routes was duidelijk. Zo werden eiwitten geassocieerd met aminozuurmetabolisme, koolhydraatmetabolisme en prokaryote koolstofbevestiging paden hoofdzakelijk geïdentificeerd op het oppervlak en stikstofmetabolisme werd uitsluitend gevonden op het oppervlak. Fotosynthetische koolstof fixatie eiwitten werden voornamelijk waargenomen bij de chlorofyl maximum terwijl eiwitten betrokken bij fotosynthese gelijkmatig tussen het oppervlak en chlorofyl maximum geïdentificeerd. Deze resultaten tonen dat een grote verscheidenheid van eiwitten uit diverse microbiële taxa kan worden gedetecteerd met de hier gepresenteerde protocol.
Figuur 1:. Genomisch DNA van 2 diepten Arctic station S633 De eerste baan bestaat uit 4 ui van een 1 kb DNA ladder, baan 2 bevat 3 pi genomische DNA-extractie van S633_2 m, laan 3 bevat 3 pi genomische DNA-extractie uit S633_20 m en lanen 4-6 bevatten 0,5 ul (85 ng), 2 pi (333 ng) en 4 pi ( 667 ng) van HindIII verteerd lambda DNA.
Figuur 2:. Taxonomische en functionele analyse van 2 dieptes bij Arctic station S633 Taxonomische diversiteit vergelijking van de Arctic station 633 oppervlak en chlorofyl maximale wateren (A) gemaakt met MEGAN. Functionele diversiteit vergelijking van de Arctic station 633 oppervlak en chlorofyl maximale wateren (B) gemaakt met MEGAN te vragen tegen de KEGG databank. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monster behoud is de sleutel tot metaproteomic studies en eerdere werk heeft aangetoond dat een RNA stabilisatie oplossing is een handig opslag buffer voor het opslaan van de cellen voorafgaand aan eiwitextractie 28. Idealiter zouden de monsters worden geconserveerd in situ verschuivingen in eiwitexpressie teniet tijdens hantering 33,34. In feite, in situ sampling en fixatie technologieën ontwikkeld, waarmee de autonome verzamelen en bewaren van monsters per schip ingezet instrumenten. De toegang tot deze technologieën is niet altijd uitvoerbaar. In het voorkomende geval dat niet moeten monsters zo snel mogelijk na afname worden bewaard.
Hier presenteren we een protocol voor het extraheren van eiwitten uit RNA stabilisatie oplossing opgeslagen cellen verzameld op een cartridge filtereenheid, die gewoonlijk wordt gebruikt in aquatische microbiologie. Het protocol omvat cellysis met behulp van een SDS-lysis-oplossing en verwarmen, gevolgd door een protein concentratie stap met ultracentrifugale filter eenheden die verdubbeld als een noodzakelijke ontzoutingsstap. Opgemerkt moet worden dat de concentratie en ontzouten stappen niet kan worden over het hoofd gezien. We vonden dat minimaal drie stappen bufferuitwisseling moest ons concentreren ontzouten. Door de hoge zoutconcentratie van het RNA stabiliseren oplossing, indien de juiste ontzouten niet plaatsvindt, teveel zout wordt neergeslagen tijdens de nachtelijke eiwitten neerslaan en het ontzouten en neerslagtrap moeten worden herhaald. Bovendien, als ontzilting wordt uitgevoerd, wordt de 1D-PAGE zal niet werken en de monsters zullen verloren gaan.
Vervolgens werd de geconcentreerde lysaat verdeeld dat zowel eiwitten neerslaan en DNA precipitatie kan worden uitgevoerd. Dit is nuttig omdat het vaak wenselijk dat metagenomic en metaproteomic gegevens worden gegenereerd uit dezelfde monsters. Wanneer een eiwit niet weergegeven in de eiwitsequentie databank dan het peptideniet worden geïdentificeerd. Waaronder genomische data van hetzelfde monster als het proteomische gegevens vermindert het risico van het niet in staat om een proteïne te identificeren vanwege de afwezigheid van de database.
Hoewel dit protocol werd geoptimaliseerd voor cartridge filterunits en gevalideerd werken aan kustgebieden oceaan microbiële kan worden aangepast voor gebruik met andere typen milieumonsters en filters. Er moet echter duidelijk worden gesteld dat het succes van dit protocol is afhankelijk van een voldoende hoeveelheid biomassa te beginnen. Daarom in aquatische ecosystemen waar de biomassa zeer laag kunnen zijn, raden we het verhogen van de hoeveelheid water dienovereenkomstig worden gefilterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al.
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C.
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
