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Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

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DOI:

10.3791/52830

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5 de junho de 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School for Mental Health and Neuroscience, Maastricht University, 2Department of Neurosciences, Institut d'Investigació Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A síntese de anticorpos monoclonais humanos é o primeiro passo em estudos destinados a desvendar os mecanismos fisiopatológicos das respostas imunes mediadas por auto-anticorpos. Desenvolvemos um protocolo para gerar anticorpos monoclonais de imunoglobulina G humana (IgG) recombinantes a partir de células B classificadas no sangue, incluindo isolamento de células B, clonagem de anticorpos e síntese in vitro.

Resumo

Encontrar novos métodos para gerar anticorpos monoclonais humanos é um campo de pesquisa ativo que é importante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo o desenvolvimento de imunoterápicos. No entanto, as técnicas para identificar e produzir tais anticorpos tendem a ser árduas e, às vezes, o par de cadeias pesada e leve dos anticorpos é dissociado. Aqui, descrevemos um protocolo relativamente simples e direto para produzir anticorpos monoclonais recombinantes humanos a partir de células mononucleares do sangue periférico humano usando a imortalização com o vírus Epstein-Barr (EBV) e a ativação do receptor Toll-like 9. Com uma coloração adequada, as células B produtoras de anticorpos podem ser isoladas para posterior imortalização e expansão clonal. Os transcritos de anticorpos produzidos pelos clones de células B imortalizados podem ser amplificados por PCR, sequenciados como pares de cadeias pesadas e leves correspondentes e clonados em vetores de expressão de imunoglobulinas. Os anticorpos obtidos com esta técnica podem ser ferramentas poderosas para estudar respostas imunes humanas relevantes, incluindo autoimunidade, e criar a base para novas terapêuticas.

Introdução

O objetivo deste artigo é descrever em detalhe uma metodologia para gerar e caracterizar anticorpos monoclonais IgG humanas obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC).

O interesse em estudar anticorpos humanos tem crescido em muitos campos diferentes de pesquisa. Em particular, muitos grupos de pesquisa estão interessados ​​na patologia causada por auto-anticorpos 1-3. Clonámos e caracterizado auto-anticorpos patogénicos 1. O estudo de auto-anticorpos podem ajudar a identificar as suas metas e desenvolver estratégias terapêuticas, por exemplo, utilizando anticorpos concorrente 4. Além disso, o estudo de anticorpos humanos podem também ser de interesse em outras áreas de pesquisa, ou seja, para avaliar a resposta imune após a vacinação 5, para caracterizar o perfil de anticorpos de indivíduos que foram expostos e se tornaram resistentes a patógenos específicos 6 ou para estudar quais Os anticorpos são emo repertório singular 7,12.

Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para gerar anticorpos monoclonais humanos recombinantes 8-12; A maioria destes usar exibição em fagos e imortalização de células B. O uso de exibição em fagos tem sido amplamente aplicada para a descoberta de novos anticorpos 13. No entanto, tem um grande inconveniente, isto é, que os pares de cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana estão dissociados no processo. A produção de hibridomas com células B humanas ou transformação EBV supera esta desvantagem.

Usamos a infecção das células B timo com EBV em associação com a estimulação das células B policlonais através do receptor Toll-like? 9 (TLR-9) 6,12.

Neste artigo, descreve detalhadamente a tecnologia que nós usamos para o desenvolvimento de anticorpos humanos IgG, com uma visão completa de todos os passos do PBMC isolamento para a geração de anticorpos em vitro. Esteprotocolo pode ser utilizado para a análise de qualquer tipo de perfil de IgG humana. No nosso laboratório, as células B produtoras de anticorpos de IgG têm sido separados com sucesso a partir do resto de PBMC após separação. Cinquenta células B ordenadas 8 podem então ser plaqueadas em placas multi-poços e imortalizadas por EBV e TLR-9 activação, para a expansão clonal de células B individuais. Como células de alimentação, os fibroblastos a partir de tecido de pulmão embrionário humano têm sido utilizados, linha de células WI38, o que facilita a visualização das células B imortalizadas. A partir destas células B, as sequências das cadeias pesada e leve da imunoglobulina pode ser obtido por PCR, e os genes dos anticorpos de imunoglobulina G clonado em vectores de expressão e produzido in vitro. Usando esta técnica, os anticorpos individuais com exactamente a mesma sequência de anticorpo encontradas no dador pode ser estudada.

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Protocolo

O consentimento informado foi obtido dos participantes do estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional.

1. Isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)

  1. Centrifugar 25 ml de sangue heparinizado dos participantes a 900 xg durante 15 min, o mais rapidamente possível após a extracção de sangue. Se houver menos sangue, reduza os reagentes em conformidade. Execute todos os próximos passos em uma capa.
  2. Transferir o soro para um tubo limpo. Ele pode ser usado em passos posteriores para a congelação de PBMC ou no caso de doentes auto-imunes, para testar a auto-anticorpos.
  3. Diluir o sangue com 10 ml de RPMI 1640 e voltar a suspender as células por pipetagem cima e para baixo.
  4. Adicionar 15 ml de uma solução contendo polissacarose e diatrizoato de sódio (1,077 g / ml) para um novo tubo de 50 ml.
  5. Suavemente camada do sangue na parte superior da solução no passo 1.4, trazendo as duas aberturas de tubos a fim Togetela até que os dois líquidos chegar muito lentamente em contacto, e, em seguida, decanta-se a suspensão de PBMC lentamente na parte superior do tubo de 50 ml. Este passo é crítico para ter uma boa separação de PBMCs.
  6. Centrifuga-se o tubo obtido no passo 1.5 a 400 xg sem travão, à TA durante 20 min.
  7. Após a centrifugação, com a pipeta de recuperar o anel branco que aparece na parte central do tubo, que contém as PBMC.
  8. Lavam-se as células com 25 ml de meio RPMI 1640.
  9. Centrifugar a 300 xg à temperatura ambiente durante 10 min.
  10. Descartar o sobrenadante e lava-se as células com 10 ml de meio RPMI 1640. Centrifugar novamente como no passo 1.9.
  11. Contar as PBMC com uma câmara de Neubauer conforme relatado anteriormente 14.
  12. Processar a PBMC como na seção 2 ou armazená-los para uso posterior da seguinte forma: 10 milhões de PBMC para o congelamento por tubo cryovial diluído em 1 ml de 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) e 90% de soro obtidas no passo 1.2. Congelar progressivamente e por muito tempo storaiva em nitrogênio líquido.

2. Coloração PBMC para Classificando CD22 + e IgG + por celular Citometria

  1. Placa as CMSPs em um frasco de cultura 2 de células de 25 cm com 6 ml de meio RPMI 1640 completo (suplementado com L-glutamina, tampão HEPES 10 mM, 50 U / ml de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de bovino) e deixá-los recuperar S / N na incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
  2. Bloquear tubos de FACS estéreis estéril com 4% de albumina de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), solução de O / N. Lavar os tubos duas vezes com PBS e os encher com 500 uL de meio RPMI 1640 completo. Use estes tubos para recuperar as células após separação.
  3. Recolher os PBMC para um tubo de centrífuga e a 400 xg à temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Volte a suspender as células em tampão de marcação (veja as etapas 2.5 e 2.6) e contá-los 14. O tampão de marcação é estéril 2% de soro fetal bovino e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS.
  5. Preparar 3 de separação de células (FACS) tubos activado por fluorescência com 10 células cada 5 e ressuspender-os em 100 ul de tampão de marcação. Estes tubos servirá para definir as portas da classificação.
    1. No primeiro tubo adicionam-se 5 uL de anticorpo anti-CD22 PerCP (recomendado na folha de dados do fabricante), no segundo tubo 20 ul de IgG anti-PE (recomendado na folha de dados do fabricante), e nada no terceiro tubo. Incubar em gelo e no escuro durante 30 min.
  6. 5.000.000 Ressuspender as células em 200 ul de tampão de marcação, num tubo de FACS e adicionar 10 ul de anti CD22 PerCP e 40 ul de IgG anti-PE. Incubar as células em gelo e escuro durante 30 min. Se a classificação de um maior número de células é desejado, dimensionar-se todos os reagentes.
  7. Células centrifugar a 400 xg com um freio de baixa durante 5 min à TA.
  8. Decantar suavemente o sobrenadante.
  9. Ressuspender as células em 500 μl de tampão de marcação. Células centrifugar a 400 xg com um freio de baixa durante 5 min à TA. Repita os passos 2.7 e 2.8
  10. Decantar suavemente o sobrenadante e ressuspender as células em 300 ul de meio completo RPMI.
  11. Passar as células através de um filtro de 0,45 um. As células estão prontas para classificar.

3. Seleção das células B CD22 + e IgG +

  1. Use três tubos de controlo para estabelecer a viabilidade das células. No controle sem manchas, use a trama para frente e tamanho de dispersão para definir o gating linfócitos. Os controles com o CD22 PerCP e anti-IgG PE servir para estabelecer as portas eo portão de classificação. Execute seguintes dados relatados anteriormente 15.
    Nota: A porta é um conjunto de limites de valor (limites) que servem para isolar um grupo específico de eventos de citometria de, em nossas células de caso, a partir de um grande conjunto. No caso de um portão de triagem dos limites de valor permite a recuperação de acontecimentos de citometria de, células que estão dentro deos limites definidos: CD22 + e + IgG.
  2. Como um tubo de recolha na manipulação, usar os tubos bloqueados com 500 ul de meio completo RPMI 1640, obtidas a partir do passo 2.2.
  3. Prossiga para classificar dupla positivo 15: CD22 + IgG +. Observe que o número final de células em cada condição. Placa classificados células no topo de células alimentadoras o mais rapidamente possível.

4. A irradiação de células alimentadoras

Nota: Execute a preparação das células alimentadoras entre 1-3 dias antes da ordenação. Pelo menos 5000 células WI38 são necessários por poço numa placa de 96 rodada bem. Realize os passos 4.1, 4.2 e 4.4 em uma capa.

  1. Cultivar as células WI38, a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio completo RPMI 1640 (o mesmo que para as PBMC), até que o número desejado de células é atingido.
  2. Irradiar-los em 50 Grays, seguindo um protocolo descrito antes de 16. Realizar a irradiação uma vez que as células WI38 foram tripsinizadas e ressuspensas em Complete meio RPMI, com ou WI38 ligado ao frasco de cultura e tripsinizadas após a irradiação. Seguir o método para a tripsinização indicado pelo fornecedor de células WI38. Irradiar o número de células necessárias para cobrir os poços necessários para o plaqueamento de células B de IgG + (1% do total de PBMC contadas no passo 1.11).
  3. Placa de 90 ul contendo 5,000 irradiadas células WI38 em cada poço da placa 96 rodada bem. Deixar os poços na fila do lado de fora do prato vazio (porque eles evaporam rapidamente), e apenas utilizar os 60 poços no meio da chapa para o plaqueamento das células. Encha as cavidades exteriores que são de moldação da placa com 200 ul de PBS.
  4. Colocá-los em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO2, até serem necessários.

5. Galvanização Ordenado PBMC, infecção por EBV e Crescer

  1. Diluir as PBMC ordenadas, a placa 50 células em 50 ul de meio RPMI 1640 completo por poço na placa 96 rodada bem (wit previamente plaqueadash WI38 células irradiadas). Realize os passos em uma capa equipado para o trabalho EBV.
    Nota: a infecção da 50 células por poço é optimizada e aumenta a verossimilhança para produzir um anticorpo monoclonal 8, no entanto, recomenda-se a verificar esta por PCR, tal como descrito antes 1,6.
  2. Adicionar 60 ul de sobrenadante de EBV (contendo 3-4 x 10 8 cópias virais / mL) para cada poço na placa de 96 poços 17 rodada. O cuidado deve ser tomado durante o trabalho de EBV.
  3. Adicionar 1 ug / ml de CpG (ODN2006) por poço.
  4. Deixar as células em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
  5. Clone visualmente monitor de crescimento ao microscópio após uma semana.
    Nota: Alguns exemplos de crescimento de células B pode ser visto abaixo, na secção de resultados. Repare que as taxas de crescimento dos clones pode variar, e tempo extra pode ser necessário para começar a ver alguma massa de células em crescimento no meio do poço.
  6. Após o 1º duas semanass monitor de clone crescendo sob o microscópio de luz e avançar para a primeira troca de mídia. Lentamente pipeta 90 ul de meio a partir da parte superior do poço, e em recolher uma placa limpa de 96 poços. (Células B encontram-se na parte inferior do poço, de modo que não existe o risco de aspirar-los).
    1. Adicionar a cada poço 100 ul de meio RPMI 1640 completo suplementado com 1 ug / ml de CpG (ODN2006) e 50 U / ml de IL2. Se clones estão crescendo, analisar essa primeira troca de mídia por ELISA como na etapa 6.
  7. Monitorar clone crescente e depois mudar de suporte do 3º e 4º semana de crescimento de novo, tendo 90 ul de meio e adição de 100 ul de RPMI 1640 completo suplementado com 1 ug / ml de CpG (ODN2006) e 50 U / ml de IL2. Utilizar o sobrenadante foi recolhido para monitorizar a produção de IgG por ELISA, tal como no passo 6.
    Nota: Depois de um clone mês crescente deve ser evidente através da observação agregados de células redondas de thaT encontram-se geralmente no meio do fundo redondo bem.
  8. Neste passo, mudar de suporte da mesma maneira que as semanas anteriores, mas apenas com meio RPMI 1640 completo. Um bom indicador para saber o momento certo para mudar de mídia é a cor da mídia, se ele está se tornando células amareladas precisar de uma troca de mídia.
  9. Quando as placas de 96 poços contendo são grandes clones (aproximadamente 5 x 10 5 células), transferi-los para um bem plana de uma placa de 24 poços. Adicione 300 ml de RPMI completo 1640 para o novo bem. Ressuspender o clone 96 poços crescendo, pipetando cima e para baixo várias vezes, e células de transferência para o novo bem, distribuir homogeneamente. Adicionar novos meios de comunicação quando necessário.
    1. Quando os alvéolos da placa de 24 poços são cheios de células (cerca de 5 x 10 6 células), transferir para um bem plana de uma placa de 6 poços. Adicionar 2 ml de meio RPMI 1640 completo para a nova cavidade. Ressuspender as células na placa de 24 cavidades por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, e distribuí-los homogeneamente no novo poço.
  10. Adicionar mídia quando necessário. Se as células não estão a ser mantidas em cultura, sedimentar as células a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Armazenar os sobrenadantes para teste ELISA. Lava-se a pelete de células uma vez com 1 x PBS, centrifugar novamente a 400 xg durante 5 min, e armazenado seco a -80 ° C até à extracção do ARN.
    1. Quando as células na placa de 6 poços tornam-se confluentes (aproximadamente 20 x 10 6 células), transferir para uma placa de cultura de 60 mm. Adicione 4 ml de RPMI 1640 completo para a nova placa. Volte a suspender as células em 6 bem-placa e transferi-los como é feito os passos 5.9 e 5.10.
  11. Adicionar novos meios de comunicação quando necessário. Neste passo, congelar as células em 10-30.000.000 / ml em 90% de soro fetal de vitelo e 10% de DMSO. Se quantidades maiores de células são queria, continuar a expansão dos clones em placas de superfície maiores.

6. ELISA para IgG Detecção de Anticorpos

  1. Pipetar 50 ul / cavidade em uma placa de ELISA Of cabra F (ab) 2 de anticorpo Fc anti-humano diluído de 1 200 em tampão de revestimento. Tampão de revestimento contém 50 mM de Na 2 CO 3, pH 9,6.
  2. Selar as placas com um adesivo plástico, e incubar 1 h a 37 ° C. Alternativamente, incuba-se a 4 ° CO / N.
  3. Lava-se cada poço 6 vezes com 200 ul de tampão de lavagem. Tampão de lavagem contém 0,05% de Tween-20 em 1 x PBS. Não toque nem risque a superfície bem onde o anticorpo se ligou.
  4. Bloco com tampão de bloqueio, com 100 ul / poço. O tampão de bloqueio contém 4% de leite seco não gordo em PBS. Selar a placa e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
  5. Não lavar. Descarte tampão de bloqueio e tapa a placa 3 vezes de cabeça para baixo sobre um papel toalha para remover o líquido residual.
  6. Incubar sobrenadantes e normas 'clones.
    1. Para um primeiro ensaio, diluir sobrenadantes de clones obtidos no passo 5.6 ou 5.7 1/3 em meio RPMI. Para os padrões dilui-se com solução de IgG humana meio RPMI para obter: 1,000 ng /ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml e em branco. Utilizar 50 ul / poço e incubar a 37 ° C durante 60 min. Analisar outras diluições do sobrenadante do clone "para testar a afinidade de anticorpos, tais como 1/10 ou 1/100.
  7. Lave como foi feito no passo 6.3.
  8. Utilizar 50 ul / poço de cabra F (ab) 2 anti-humano conjugado com peroxidase de IgG Fc diluída 1: 20000 em tampão de incubação. Tampão de incubação contém 1% de BSA e 0,02% de Tween 20 em PBS 1x. Incubar a 37 ° C durante 60 min.
  9. Lave como foi feito no passo 6.3.
  10. Adicionar / solução bem substrato 100 ul contendo 0,1% de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 10 min, até que uma cor azul formas estáveis ​​nos poços. Seja cuidadoso; não espere muito tempo!
  11. Parar a reacção por adição de 50 ul de 2 H 2 SO 4. Medir a absorção a 450 nm, dentro de 30 minutos após a paragem da reacção.
    Nota: Todos os clones 'supernatants com 3 desvios-padrão sobre o branco será considerado positivo para anticorpos humanos IgG. Para a confirmação dos clones positivos de ELISA este deve ser repetido pelo menos três vezes em diferentes sobrenadantes do mesmo clone. Também para descartar a possibilidade de reactividade cruzada não específica é recomendado para assegurar que não há nenhum sinal quando sobrenadantes são incubadas em poços não revestidos, mas bloqueados. Neste passo, um ensaio de detecção para o rastreio de a especificidade antigénica dos anticorpos de interesse pode ser realizada antes de avançar para a secção 7.

7. Isolamento de ARN e First Strand cDNA Synthesis dos Clones IgG Produtores

  1. Logo que a produção de IgG é confirmada por ELISA, extrair o ARN do clone.
  2. Para extracção de RNA das células que crescem em passos de 5,7 ou 5,9, utilizar o sobrescrito kit de síntese de ADNc de células III directa, o que permite a obtenção de DNA a partir de 10000 células a uma célula.
  3. Para a extração de RNA do larger quantidades de células, ou a partir do sedimento armazenado no passo 5.11 utilizar o kit de isolamento de ARN puro alta. Outros sistemas de extracção de ARN, também pode ser adequado a esta etapa. Siga as instruções do fabricante.
  4. Para o número de células entre 1 x 10 6 e 1 x 10 4 uso do sistema de transcrição reversa, seguindo as instruções do fabricante. Outros sistemas para a síntese da primeira cadeia de cDNA também pode ser utilizado.

8. 1 º e 2 º PCR para amplificação do cadeias pesadas e leves das IgG-produzindo clones de células B

  1. Com o ADNc dos clones de células, obtidas na etapa 5.6 e 5.7 e positiva no ELISA de IgG no passo 6, realizar PCR com os iniciadores listados na Tabela 1.
  2. Configure PCRs independentes para cada pesado, kappa e lambda cadeia IgG. Faça uma solução estoque com iniciadores directos e inversos, em concentrações iguais. Adicione-os a reacção a 0,4 uM de concentração final.
  3. Use 1 ul da síntese de cDNA para realizar a PCR 1 ST. Aqui, realizar 20 reações ul utilizando as instruções do fabricante Takara Taq. Em alternativa, utilize outras polimerases.
  4. Coloque a 1 r de PCR sob as seguintes condições de ciclos: 94 ° C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 ° C durante 30 seg; 58 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 45 seg; 72 ° C durante 7 min, deixe-o arrefecer a 4 ° C.Include um espaço em branco na reacção, para detectar possíveis contaminações.
  5. Prepare TBE 1x (89 mM Tris-borato e EDTA 2 mM). Num volume de 100 ml de 1x TBE adicionar 1 g de agarose (1% de gel de agarose). Aquece-se a solução no forno de microondas durante cerca de 1 min, até a agarose se dissolve. Em seguida, adicionar 4 mL de 10 mg mL de brometo de (corante de ADN ou equivalente) / etídio e misturar.
    1. Despeje o conteúdo em uma bandeja e esperar até que se polimerizado. Executar 5 ul de mistura de PCR em gel de visualizar as bandas. Fragmento de cadeia pesadas deve ser em torno de 400-550 pb, enquanto cadeia leve deve ser em torno de 300-400 pb. Se as bandas não são detectados, proceder de igual modo com 2 nd PCR.
  6. Use um ul da primeira mistura de PCR para executar a 2ª PCR. Use os mesmos reagentes que no passo 8.2, mas utilizando a mistura apropriada de iniciadores (ver Tabela 1). Para os 2 nd usam PCR nas seguintes condições: 94 ° C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 ° C durante 30 seg; 56,5 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 55 seg); 72 ° C durante 7 min; deixe-o arrefecer a 4 ° C. Incluir um branco na reacção, para detecção de possíveis contaminações de PCR.
  7. Preparar um gel de agarose como descrito em 8.5. Execute o gel para visualizar o produto PCR como em 8.5.1 Use as amplificações que contêm os fragmentos de tamanho certo para clonagem na etapa 9 e produzir os anticorpos na etapa 10.
  8. Sequência do DNA, usando 10 reação l contendo: 100 ng do 2º PCR, 0.2 | iM do iniciador ou mistura de iniciadores, 1 ul do terminador e um l do tampão. Realizar a reacção de sequenciação sob estas condições: (25 ciclos de: 96 ° C durante 10 segundos; 50 ° C durante 5 seg; e a 60 ° C durante 4 min); 60 ° C durante 7 min; deixe-o arrefecer a 4 ° C.
  9. Purifica-se as reacções de sequenciação com colunas G50 Microspin seguindo as instruções do fabricante. Avaliar as sequências da ligadura em um analisador de seqüência automática como descrito anteriormente 18. Electroferogramas deve ser limpo e correspondem a uma sequência de imunoglobulina.
    Nota: Se os produtos de PCR mostrar sequências de imunoglobulina pouco claras ou mistos, por favor considere a cloná-los usando o sistema TopoTA, para obter sequências isoladas e, em seguida, vá para o passo 9.

9. clonagem e sequenciação das cadeias pesadas e leves dos clones produtores de IgG

  1. Prepare 1 mg de DNA de vetores pFUSE2ss-clig-hk, pFUSE2ss-Clig-hl2 e pFUSEss-Chig-HG1.
  2. Digerir estes vectores com as enzimas de restrição apropriadas. Use Eco RI e BsiWI para pFUSE2ss-clig-hk, Eco RI e Avr II para pFUSE2ss-clig-hl2, e Eco RI e Nhe I para pFUSEss-Chig-HG1. Use três unidades de cada enzima de restrição durante 1 ug de ADN do vector.
    1. Digerir com uma enzima e purifica-se o produto digerido com um kit de purificação de PCR. Digerir com a segunda enzima e purifica-se com um kit de extracção de Gel (de acordo com o protocolo do fabricante). Cortar o fragmento de interesse a partir do gel de agarose. Prepare gel de agarose como no passo 8.5.
  3. Digerir os 2 nd PCR produtos do clone IgG produzindo: Eco RI e BsiWI para a amplificação da cadeia kappa, Eco RI e Avr II para a amplificação da cadeia lambda, e Eco RI e Nhe I para a amplificação da cadeia pesada. Digerir com uma enzima e purifica-se o produto digerido com um PKit de Purificação CR. Digerir com a segunda enzima e purifica-se o produto digerido com um kit de purificação de PCR. Usar as mesmas unidades de enzimas e quantidade de DNA como no passo 9.2.
  4. Ligar os fragmentos de PCR dentro dos vectores com DNA ligase de T4 recomendações 16 ° CO / N seguintes do fabricante. A razão utilizada deve ser de 1: 2 (vector: inserto).
  5. Use um ul da ligação para transformar bactérias DH5a. Siga condições DH5ct do fabricante para a transformação. Espalhe bactérias em placas de blasticidina ou zeocina, dependendo do tipo de vector utilizado. Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
  6. Crescer colónias individuais, e extrair DNA com um kit miniprep, seguindo as instruções do fabricante. Use para única colônia crescer e Extração de DNA, as recomendações do fabricante do kit miniprep DNA. Analisá-las por digestão com as enzimas utilizadas para a preparação de vectores e inserções como nos passos 9.2 e 9.3.
  7. Sequência do DNA, por using 100 ng do vector, tal como feito nos passos 8.8 e 8.9.

10. Produção de anticorpos em células HEK

  1. Cultivar células HEK em Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 1% de L-glicose, 1% de penicilina / estreptavidina (DMEM +) até uma confluência de 75% numa placa de 150 mm de cultura de células. Execute em uma capa passos 10,1-10,7.
  2. Antes da transfecção, trocar o meio para meio como antes, mas sem soro de vitelo fetal.
  3. Para cada pesada, cadeia leve de transfecção, preparar uma mistura de transfecção com 2,5 ml de DMEM (sem soro), 9 ug do vector com a cadeia pesada, 6 ug do vector com a cadeia leve, e 100 ul de polietilenimina (PEI solução) (a partir de um estoque de 1 ug / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Suavemente adicionar 2,5 ml da mistura de transfecção, preparado no passo 10.3 para as células HEK na placa. Balance a placa para distribuir de forma homogênea.
  5. EmCubate as células na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas.
  6. Mudar o meio de cultura para meio sem soro fetal de vitelo.
  7. Recolhe-se o meio das placas de 4 dias mais tarde.
    Nota: Os anticorpos, os meios podem ser utilizados para caracterizar a sua reactividade in vitro e in vivo.

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Resultados

O gate de triagem após coloração das células positivas de CD22 e IgG é mostrado na Figura 1 Nesta imagem da área das células duplamente positivas -. Células B produtoras de anticorpos IgG - é seleccionado para classificar todas essas células em um tubo separado. Na análise, cerca de 1% do total de PBMC correspondem a esta população positiva dupla. O número de células classificadas obtidos dependerá do número de células obtidas na secção 1.

Os diferentes resultados após 5 sem...

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Discussão

Neste texto, todos os passos para a geração de anticorpos IgG a partir de PBMC humanas são apresentados em detalhe. Este protocolo inclui algumas vantagens em relação às técnicas anteriormente publicados. Uma das vantagens é que o anticorpo produzido mantém as cadeias pesada e leve correspondentes ao par original no clone de células B. A identificação de anticorpos IgG pode ser feito em qualquer tipo de dador humano, e não há necessidade de exacerbação da resposta imunitária devido à vacinação 5. A utilização...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Contrato de investigação Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa "Graduate School of Translational Programa de Neurociência" Scientific (022005019) para (CH).

Concessões do Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) ea Association Française contre les Myopathies para (PM-M.); bem como por um Veni Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (916.10.148) uma bolsa da Fundação Cérebro dos Países Baixos (FS2008 (1) -28) eo Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (a ML ).

Agradecemos Jozien Jaspers por sua ajuda na triagem de células B por citometria de fluxo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Histopaque-1077 Solução Sigma-Aldrich10771contendo polissacarose e diatrizoato de sódio
FACSAria II classificador de células BD Biosciences
96 placas de micro poço de fundo em U Costar3799
Instituto Memorial Avançado de Roswell Park (RPMI) 1640 médio Gibco, Life Technologies12633-020
30% v/v sobrenadante contendo EBV da linha celular B95-8   ATCCCRL-16123.4 x 108 cópias/ml
CpG2006 Células Wi38 ODN7909
Sigma-Aldrich90020107
Interleucina-2Roche 
placas ELISAGreiner Bio-One, Microlon655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragmento Específico (não conjugado)Jackson ImmunoResearch109-006-008
4% de leite em pó desnatado (Bloqueador de Grau Blotting) Biorad170-6404
IgG Humano SigmaI 2511Imunoglobulina purificada por IgG HUMANA, 5,6 mg/ml
Cabra F(ab)2 IgG anti-humana Fcγ (conjugado com peroxidase (PO))Jackson ImmunoResearch109-036-008
Leitor ELISA (Perkin Elmer 2030) Perkin Elmer 2030-0050
IgM Anti-Humano AffiniPure Rabbit conjugado com peroxidase, Fc5µ   Jackson ImmunoResearch309-035-095
Sistema de Síntese Direta de cDNA de Células SuperScript III Invitrogen 18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700Kit
 KitRoche 11828665001
PromegaA3500
Taq DNA Polimerase Taq RecombinanteTAKARAR001A
Primers (2 μ l)Sigma
Ultrapure Agarose Invitrogen16500-500
100 bp ladderInvitrogen15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)Biorad170-8100
QIAquick PCR kit de purificaçãoQIAGEN28106
BigDye Terminator v3.1 kit de sequenciamento de ciclo Applied Biosystems4337455
placa de reação de 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well)Applied Biosystems4346906
Analisador genético ABI300 Applied Biosystems4346906
células competentes DH5α (E. coli)Invitrogen18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)Invivogenpfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) Invivogenpfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)Invivogenpfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp) Meio SOC Invivogenpfuse2ss-hcll2
Invitrogen15544-034
Meio de ágar à base de LB suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)Invivogenfas-zn-s
Meio líquido à base de Terrific Broth (TB) suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo TB)Invivogenfas-zn-l
DNA Miniprep kit Omega Bio TechnologyD6942-02
Nanodrop (Espectrofotômetro ND1000)Meio
LB suplementado com Blasticidina (Ágar Fast-Media Blast Agar)Invivogenfas-bl-s
Meio líquido à base de Caldo Fantástico (TB) suplementado com Blasticidina (Fast-Media Blast TB)Invivogenfas-bl-l
EcoRINew England BiolabsR0101S20.000 U/ml, em 10x NEBuffer EcoRI
NheINew England BiolabsR0131S10.000 U/ml, em 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladderNew England BiolabsN3200S0.1-10.0 kb, 1.000 μ g/ml
XmaINew England BiolabsR0180S10,000 U/ml, em 10x CutSmart Buffer 
BsiWINew England BiolabsR0553S10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrIINew England BiolabsR0174S5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Fosfatase Alcalina TermossensívelThermo ScientificEF06511 U/µ l, em 10x FastAP Buffer
DH5α células competentes Invitrogen18263-012
PE Mouse Anti-Human IgGBD Pharmingen555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22Fisher scientificBDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN27106
BigDye Terminator v3.1Applied Biosystems4337455
da Invivogen10799068001 de Isolamento de RNA de Alta Pureza da Applied Biosystems de sistema de transcrição reversa de ágar à base de Nanodrop

Referências

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  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
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  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
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  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321(2011).
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