A síntese de anticorpos monoclonais humanos é o primeiro passo em estudos destinados a desvendar os mecanismos fisiopatológicos das respostas imunes mediadas por auto-anticorpos. Desenvolvemos um protocolo para gerar anticorpos monoclonais de imunoglobulina G humana (IgG) recombinantes a partir de células B classificadas no sangue, incluindo isolamento de células B, clonagem de anticorpos e síntese in vitro.
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Artigo de método
Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Encontrar novos métodos para gerar anticorpos monoclonais humanos é um campo de pesquisa ativo que é importante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo o desenvolvimento de imunoterápicos. No entanto, as técnicas para identificar e produzir tais anticorpos tendem a ser árduas e, às vezes, o par de cadeias pesada e leve dos anticorpos é dissociado. Aqui, descrevemos um protocolo relativamente simples e direto para produzir anticorpos monoclonais recombinantes humanos a partir de células mononucleares do sangue periférico humano usando a imortalização com o vírus Epstein-Barr (EBV) e a ativação do receptor Toll-like 9. Com uma coloração adequada, as células B produtoras de anticorpos podem ser isoladas para posterior imortalização e expansão clonal. Os transcritos de anticorpos produzidos pelos clones de células B imortalizados podem ser amplificados por PCR, sequenciados como pares de cadeias pesadas e leves correspondentes e clonados em vetores de expressão de imunoglobulinas. Os anticorpos obtidos com esta técnica podem ser ferramentas poderosas para estudar respostas imunes humanas relevantes, incluindo autoimunidade, e criar a base para novas terapêuticas.
Introdução
O objetivo deste artigo é descrever em detalhe uma metodologia para gerar e caracterizar anticorpos monoclonais IgG humanas obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC).
O interesse em estudar anticorpos humanos tem crescido em muitos campos diferentes de pesquisa. Em particular, muitos grupos de pesquisa estão interessados na patologia causada por auto-anticorpos 1-3. Clonámos e caracterizado auto-anticorpos patogénicos 1. O estudo de auto-anticorpos podem ajudar a identificar as suas metas e desenvolver estratégias terapêuticas, por exemplo, utilizando anticorpos concorren....
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Protocolo
O consentimento informado foi obtido dos participantes do estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional.
1. Isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)
- Centrifugar 25 ml de sangue heparinizado dos participantes a 900 xg durante 15 min, o mais rapidamente possível após a extracção de sangue. Se houver menos sangue, reduza os reagentes em conformidade. Execute todos os próximos passos em uma capa.
- Transferir o soro para um tubo limpo. Ele pode ser usado em passos posteriores para a congelação de PBMC ou no caso de doentes auto-imunes, para testar a auto-anticorpos.
- Diluir....
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Resultados
O gate de triagem após coloração das células positivas de CD22 e IgG é mostrado na Figura 1 Nesta imagem da área das células duplamente positivas -. Células B produtoras de anticorpos IgG - é seleccionado para classificar todas essas células em um tubo separado. Na análise, cerca de 1% do total de PBMC correspondem a esta população positiva dupla. O número de células classificadas obtidos dependerá do número de células obtidas na secção 1.
Os diferentes resultados após 5 sem.......
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Discussão
Neste texto, todos os passos para a geração de anticorpos IgG a partir de PBMC humanas são apresentados em detalhe. Este protocolo inclui algumas vantagens em relação às técnicas anteriormente publicados. Uma das vantagens é que o anticorpo produzido mantém as cadeias pesada e leve correspondentes ao par original no clone de células B. A identificação de anticorpos IgG pode ser feito em qualquer tipo de dador humano, e não há necessidade de exacerbação da resposta imunitária devido à vacinação 5. A utilização.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Contrato de investigação Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) a (GN-G.). Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa "Graduate School of Translational Programa de Neurociência" Scientific (022005019) para (CH).
Concessões do Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) ea Association Française contre les Myopathies para (PM-M.); bem como por um Veni Fellowship da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (916.10.148) uma bolsa da Fundação Cérebro dos Países Baixos (FS2008 (1) -28) eo Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (a ML ).
Agradecemos Jozien Jaspers por sua ajuda na triagem de células B por cit....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Solução Sigma-Aldrich | 10771 | contendo polissacarose e diatrizoato de sódio |
| FACSAria II classificador de células | BD Biosciences | ||
| 96 placas de micro poço de fundo em U | Costar | 3799 | |
| Instituto Memorial Avançado de Roswell Park (RPMI) 1640 médio | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v sobrenadante contendo EBV da linha celular B95-8 | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 cópias/ml |
| CpG2006 | Células Wi38 ODN | 7909 | |
| Sigma-Aldrich | 90020107 | ||
| Interleucina-2 | Roche | ||
| placas ELISA | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragmento Específico (não conjugado) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% de leite em pó desnatado (Bloqueador de Grau Blotting) | Biorad | 170-6404 | |
| IgG Humano | Sigma | I 2511 | Imunoglobulina purificada por IgG HUMANA, 5,6 mg/ml |
| Cabra F(ab)2 IgG anti-humana Fcγ (conjugado com peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| Leitor ELISA (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| IgM Anti-Humano AffiniPure Rabbit conjugado com peroxidase, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| Sistema de Síntese Direta de cDNA de Células SuperScript III | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Kit | ||
| Kit | Roche 11828665001 | ||
| Promega | A3500 | ||
| Taq DNA Polimerase Taq Recombinante | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μ l) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR kit de purificação | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 kit de sequenciamento de ciclo | Applied Biosystems | 4337455 | |
| placa de reação de 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Analisador genético ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| células competentes DH5α (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp) | Meio SOC Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| Invitrogen | 15544-034 | ||
| Meio de ágar à base de LB suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Meio líquido à base de Terrific Broth (TB) suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (Espectrofotômetro ND1000) | Meio | ||
| LB suplementado com Blasticidina (Ágar Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Meio líquido à base de Caldo Fantástico (TB) suplementado com Blasticidina (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20.000 U/ml, em 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10.000 U/ml, em 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1.000 μ g/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, em 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Fosfatase Alcalina Termossensível | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µ l, em 10x FastAP Buffer |
| DH5α células competentes | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
Referências
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S.
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Reimpressões e permissões
