Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

Resumo

Estabelecemos um método de encapsulamento de células-tronco pluripotentes (células PS) em cápsulas de hidrogel de alginato usando um bico coaxial. Isso evita que as células se agreguem excessivamente e limita a tensão de cisalhamento experimentada pelas células em cultura em suspensão. A técnica é aplicável à produção em massa de células PS, bem como à pesquisa de nicho de células-tronco.

Resumo

As células-tronco pluripotentes (células PS) são o foco de intensa pesquisa devido ao seu papel na medicina regenerativa e na triagem de medicamentos. No entanto, o desenvolvimento de um sistema de cultura em massa seria necessário para o uso de células PS nessas aplicações. A cultura em suspensão é um método de cultura promissor para a produção em massa de células PS, embora algumas questões, como o controle da agregação e a limitação da tensão de cisalhamento do meio de cultura, ainda não tenham sido resolvidas. Para resolver esses problemas, desenvolvemos um método de encapsulamento de alginato de cálcio (Alg-Ca) usando um bico coaxial. Este método pode controlar o tamanho das cápsulas facilmente co-fluindo gás N₂. O diâmetro da cápsula controlável deve ser maior que 500 μm, pois uma vazão muito alta de gás N₂ causa a quebra de gotículas e, portanto, de cápsulas de tamanho heterogêneo. Além disso, uma baixa concentração de Alg-Na e CaCl₂ causa cápsulas não esféricas. Embora uma cápsula de Alg-Ca sem revestimento de Alg-PLL se dissolva facilmente, permitindo a coleta de células, elas também podem vazar de cápsulas sem revestimento de Alg-PLL. De fato, um revestimento de alginato-PLL pode prevenir o vazamento celular, mas também é difícil de quebrar. Essa tecnologia pode ser usada para pesquisar o nicho de células-tronco, bem como a produção em massa de células PS, porque o encapsulamento pode modificar o microambiente ao redor das células, incluindo a matriz extracelular e a concentração de fatores secretados.

Introdução

As células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) são atualmente fonte de intensa pesquisa devido ao seu papel na medicina regenerativa. No entanto, grandes quantidades de células são necessárias para a regeneração dos tecidos. Por exemplo, aproximadamente um bilhão de células pancreáticas necessárias para um paciente diabético tipo 1¹. No entanto, a cultura convencional de pratos só é capaz de obter 1 × 10⁵ células/^cm2, exigindo assim 1^m2 de área de cultura para obter células pancreáticas derivadas de células-tronco suficientes para tratar um paciente diabético tipo 1. O desenvolvimento de um sistema para a cultura em massa de células-tronco pluripotentes, como microcarreador² e cultura em suspensão, é, portanto, necessário para a medicina regenerativa. A cultura em suspensão representa um método promissor de cultura em massa, mas controlar a agregação de células é um desafio em culturas em suspensão direta de células iPS humanas³. De fato, as células suspensas são expostas à tensão de cisalhamento, o que causa dano celular³ ou diferenciação⁴.

A pesquisa em encapsulamento à base de hidrogel foi conduzida para resolver problemas associados à cultura em suspensão. Nas cápsulas de hidrogel, as células são protegidas do fluxo do meio. Relatórios anteriores documentaram o uso de vários tipos de hidrogel, incluindo agarose⁵, PEG⁶ e alginato (Alg), para encapsulamento celular. O hidrogel de Alg-Ca é um dos hidrogéis mais úteis para o encapsulamento celular porque o hidrogel de Alg-Ca é formado imediatamente após a queda da solução de alginato em uma solução de CaCl₂ e também é prontamente digerido por enzimas ou reagentes quelantes.

Aqui, estabelecemos um processo de encapsulamento de alginato estável para células iPS usando um bico coaxial. Ao usar o fluxo de gás N₂ para formar gotículas, é possível encapsular células em cápsulas uniformes sem a necessidade de outros reagentes, como óleo. Neste método, a taxa de fluxo de N₂ e a concentração de CaCl₂ e alginato são as principais condições operacionais que afetam o tamanho, a forma e a uniformidade das cápsulas. Este relatório demonstra a otimização dessas condições operacionais por meio do uso de uma câmera de alta velocidade e um microscópio.

Protocolo

1. Materiais Preparando

1. Preparar tampão HEPES 10 mM. Ajustar o pH para 7,0 à TA e adicionar NaCl a 0,9%.
2. Preparar a solução de alginato e 5% de solução de EDTA a 10 mM através da mistura de solução salina tamponada com HEPES preparado em 1.1. Ajustar o pH para 7,0 à temperatura ambiente.
3. Autoclave os reagentes (1.1, 1.2) durante 20 min a 121 ° C.
4. Preparar 60 milímetros pratos revestidos com gelatina em camadas com 1,2-2,0 x 10 ⁶ de fibroblastos de rato embrionário (MEF) células, as quais são tratadas como células de alimentação por incubação dentro de DMEM contendo 10% de FBS ES-qualificados e 10 ug / ml de mitomicina C para 90 - 120 min.
5. Manter rato induzida estaminais pluripotentes (IPS) sobre o prato de células com as células de alimentação na presença de 5 ml de DMEM de alto teor de glucose contendo 20% de FBS ES-qualificado, 50 uM de 2-mercaptoetanol, aminoácidos não-essenciais, e antibióticos ( 100 unidades / ml de penicilina G sódio, 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina, e 250 ng / ml de amphotericin B).
6. Semente 4 × 10 ⁵ células iPS sobre uma placa de 60 mm revestidas com gelatina e incubar a 37 ° C e 5% de CO _2. Alterar o meio de cultura todos os dias durante a incubação. Após 3-4 dias de cultura, as células trypsinize durante 1 min com 500 ul de tripsina a 0,05% contendo EDTA a 0,02% a 37 ° C e 5% de CO _2. Depois disso, retire as células tocando no prato de cultura dez vezes.
7. Adicionar 2,5 ml de DMEM com 10% de FBS e antibióticos ES-qualificado (seguindo as células iPS dissociação do rato em células individuais por pipetagem com 1.000 mL micropipeta, três vezes) suspensão de células centrifugar a 160 × g por 3 min e remover o sobrenadante e contar as células . Seguindo a contagem das células, propagar novamente as células recolhidas num prato revestido com gelatina e incubar durante 30 min para isolar as células iPS a partir das células MEF. Após a contagem das células (geralmente 1-3 × 10 ⁶ células / prato pode ser coletado), reseed 4 × 10 ⁵ células iPS emo prato.

2. celular encapsulação em cápsulas de Hidrogel de Alginato

1. Recolher as células por o mesmo procedimento descrito em 1.5 e 1.6. Após a centrifugação a 160 x g durante 3 minutos, lava-se a pelete de células iPS com solução salina tamponada com HEPES três vezes. Depois de re-suspender as células em solução salina tamponada com HEPES, filtrar a suspensão de células através de um filtro de 40 um da célula, a fim de remover grandes agregados, o que poderia de outro modo entupir o bocal.
2. Misturar 2 ml de suspensão de células numa solução salina tamponada com HEPES e 3 ml de solução a 5% Alg-Na. Finalmente 5 ml de suspensão de células numa solução de 3% Alg-Na é obtido. A densidade celular é desejavelmente superior a 10 ⁶ células / ml.
3. Depois de recolher a suspensão de células para uma seringa de 5 ml, instalar um bocal co-axial (Figura 1A, B) na seringa e colocá-las sobre a bomba de seringa. Emit _N2 fluxo de gás (inferior a 1 L / min) através da agulha exterior do bico de co-axial eexpelir a suspensão de células através do bocal interno.
4. Recolhe gotas em 250 ml de 0,5% de solução de _CaCl2 e esperar 10-20 min para a gelificação enquanto se agitava a 60-90 rpm.

3. Tratamento de cápsulas de alginato (opcional)

1. Incubar cápsulas Alg-Ca em 0,05% de poli-L-lisina (PLL) solução durante 5 min a 37 ° C e 5% (w / v) de CO _2.
2. Após lavagem das cápsulas com solução salina tamponada com HEPES, incubar em DMEM contendo FBS a 10% a fim de neutralizar a carga eléctrica na sua superfície. Utilizá-los na forma de cápsulas revestidas (Figura 1C).
3. Incubam-se as cápsulas em solução salina tamponada com HEPES contendo 10 mM de EDTA durante 5 minutos. As cápsulas tratado com EDTA são utilizados na forma de cápsulas ocas (Figura 1C).

4. Cultura e coletar células em alginato Cápsulas

1. Incubar as células encapsuladas a 75 rpm com agitação a 37 ° C e 5% de CO ₂durante 10 dias.
2. Recolha e incubar as cápsulas em EDTA 10 mM a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 10 min. Recolher as células a partir das cápsulas de alginato PLL sem tratamento por centrifugação a 1000 × g durante 3 min.
3. Se as cápsulas de alginato são tratadas com PLL, romper a membrana Alg-PLL, pipetando para cima e para baixo em torno de dez vezes com uma agulha ligada a uma seringa e centrifuga-se que em 1000 - 5000 × g durante 5 min. Diâmetro da agulha deve ser menor do que o tamanho da cápsula e 25 g (260 ^ m) de agulhas são utilizadas nesta experiência (600 um)
4. Após a centrifugação, coletar sedimento celular estritamente a partir de membranas Alg-PDD quebrados se você quiser coletar amostras de mRNA a partir de células. Restantes membranas Alg-PLL possivelmente prevenir a purificação de ARNm.

Resultados

No protocolo de 2,5, a solução de alginato expelido forma uma forma esférica imediatamente após a expulsão (Figura 2A - H). Se a suspensão é expulso com uma taxa de fluxo de _N2 inferior a 1 L / min, o tamanho das gotículas é uniforme (Figura 2I). No entanto, se o fluxo de _N2 é superior a 1 L / min, a gotícula de quebra (Figura 2G, de setas brancas) e o tamanho das gotas se torna heterogéneo (Figura 2J). Sendo assim, é difícil prepa...

Discussão

A encapsulação pode ser cultura em comparação com as culturas em suspensão directos. Cultura em suspensão é um método mais simples para obter grandes quantidades de células estaminais pluripotentes que os métodos de encapsulamento. No entanto, controlando a agregação de células numa cultura em suspensão é ainda difícil. No método de encapsulamento, agregação celular é limitado em cápsulas e podem, portanto, ser bem controlada. A publicação anterior mostrou que células encapsuladas formado agregados de tamanho unif...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Embrião de camundongo	fibroblasto Cell Biolabs	SNL 76/7
Célula-tronco pluripotente induzida	por camundongo RIKEN Bio resorce center	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM de alta glicose	GIBCO	11995
ES qualificado  FBS	GIBCO	16141079
Antibióticos Antibacterianos	GIBCO	15240
Aminoácido Não Essencial	GIBCO	11140
2-mercaptoetanol	GIBCO	21985-023
Fator Inibidor de Leucemia ESGRO	Merck Millipore	ESG1107
Tripsina / EDTA	GIBCO	25300
Agulha 26 G/16 G	Seringa Hoshiseido
10 ml	TERUMO	SS-10ESZ
Sódio  Cloreto	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Alginato de Sódio	Wako	194-09955
Cloreto de Cálcio	Wako	039-00475
Poli-L-lisina (MW = 15.000 - 30.000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Bomba de silinge	COMO UM
Microscópio	Olympus	IX71
Microscópio	Leica	DM IRB
Câmera Hispeed	nac tecnologia de imagem	Memrecam HX-3