Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Resumo

O modelo de trombose induzida por FeCl₃ em camundongos é descrito aqui. Um método para monitorar o crescimento do trombo por observação de microscopia intravital em um vaso mesentérico e por medição do fluxo sanguíneo na artéria carótida é apresentado.

Resumo

A trombose grave e suas consequências isquêmicas, como infarto do miocárdio, embolia pulmonar e acidente vascular cerebral, são os principais problemas de saúde em todo o mundo. A lesão por cloreto férrico é agora uma técnica bem estabelecida para induzir com rapidez e precisão a formação de trombos em veias ou artérias expostas de pequeno e grande diâmetro. Esse modelo tem desempenhado um papel fundamental no estudo da fisiopatologia da trombose, na descoberta e validação de novos fármacos antitrombóticos e na compreensão do mecanismo de ação desses novos agentes. Aqui, é apresentada a implementação desta técnica em um vaso mesentérico e artéria carótida em camundongos. O método descreve como marcar leucócitos e plaquetas circulantes com um corante fluorescente e observar, por microscopia intravital no mesentério exposto, seu acúmulo na parede do vaso lesado, o que leva à formação de um trombo. Na artéria carótida, a oclusão causada pela formação do coágulo é medida pelo monitoramento do fluxo sanguíneo com uma sonda Doppler.

Introdução

O estudo dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento de trombose e a avaliação da eficácia de fármacos anti-trombóticos bem estabelecida requer modelos animais experimentais. Grandes modelos animais foram os primeiros a ser utilizado uma vez que proporcionam grandes vasos mais semelhantes aos seres humanos do que roedores ^1. No entanto, de alto custo, as instalações maiores necessários e da dificuldade em manipulá-las geneticamente são os principais inconvenientes para a sua utilização e animais de grande porte são agora limitados a estudos pré-clínicos final uma vez ensaios preliminares em roedores têm dado resultados conclusivos ^2. Com a disponibilidade de largura de estirpes transgénicas e knockout e seu pequeno tamanho que minimiza a quantidade de drogas antitrombóticas necessárias para os ensaios in vivo, os ratinhos são utilizados principalmente para a investigação trombose. Portanto, vários modelos de doenças trombóticas tem sido desenvolvido em murganhos ^3.

Muitos modelos de trombose estabelecidos perturbar os intimuma camada da parede do vaso, seguido pela exposição da matriz extracelular sub-endotelial para o fluxo sanguíneo induzindo a formação de coágulos sanguíneos ^4. Os trombos podem resultar da exposição de colagénio, que provoca activação de plaquetas e / ou a partir da exposição do factor tecidual que activa a cascata de coagulação ^5. Várias técnicas são então utilizados para realizar a lesão inicial navio. Pierangeli et ai. Desenvolveram um modelo de ruptura mecânica com uma ferramenta de microcirurgia na veia femoral ^6. Kikushi et ai. Descreveu um modelo que consiste na administração de um composto reactivo foto (Rosa de Bengala) que se acumula na bicamada lipídica de células endoteliais, seguido por excitação específica da parede do vaso de interesse com luz verde (540 nm) ^7. A lesão, também pode ser induzida por uma alta intensidade de iluminação curto pulso de laser ^8. Outra técnica, em primeiro lugar estabelecido na artéria carótida de ratosconsiste na aplicação tópica de cloreto férrico _(FeCl3) ^9. Neste caso, os resultados denudação vaso de radicais livres gerados por FeCl _3, que faz com que a peroxidação lipídica e destruição de células endoteliais ^10. A lesão induz a expressão de várias moléculas de adesão que desencadeiam a adesão e agregação de plaquetas, bem como o recrutamento de leucócitos. Demonstrou-se que os leucócitos, principalmente os neutrófilos, desempenham um papel crucial na activação da cascata de coagulação do sangue levando a trombose ^11. Este método está bem adaptado para reproduzir a cascata de coagulação; os investigadores devem ter em mente que, neste modelo de ratinho, a trombose é tipicamente induzido em vasos saudáveis ​​enquanto a trombose em seres humanos está ocorrendo principalmente na ex doente. vasos ateroscleróticos.

Como este modelo é muito simples de implementar e é também eficaz em camundongos, é agora o modo de trombose usado na maior partel para pequenos animais em estudos in vivo. Além disso, esta técnica oferece a possibilidade de induzir a formação de trombos numa variedade de vasos. Navios-alvo pode ser artérias ou veias de grande diâmetro (carótida, femoral, veia cava) ou de pequeno diâmetro (mesentério, cremaster) ^12-14. Mais recentemente, foi também utilizado na artéria cerebral média proximal para desenvolver um modelo de acidente vascular cerebral ^15. A formação da trombose pode ser directamente observada por meio de microscopia intravital após marcação fluorescente de plaquetas e leucócitos ou monitorizada medindo a diminuição do fluxo sanguíneo com uma sonda de temperatura ou uma sonda Doppler ^12,16,17. Vários parâmetros, tais como tempo de oclusão, o tempo de formação de trombos ou tamanho do trombo pode então ser investigados. As diferenças fisiológicas entre os vasos investigado resultado em variações significativas na trombos obtido. Portanto, os pesquisadores geralmente selecionar o vaso-alvo de acordo com os parâmetros que eles querem measure e / ou a configuração que deseja investigar a doença. Normalmente, o modelo na artéria carótida é mais relevante para a pesquisa sobre aterotrombose relacionada ao infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral enquanto que estudos sobre a veia cava são mais relevantes para a pesquisa sobre trombose venosa profunda. A acessibilidade dos diferentes vasos também determina o método utilizado para medir o crescimento do trombo. Por exemplo, os vasos mesentéricos são de fácil acesso tornando este modelo adequado para observação microscópica intravital e o estudo da dinâmica de formação de trombos. A artéria carótida é menos acessível, mas maior, permitindo medições de fluxo de sangue e fornecer um excelente modelo para estudar a trombose oclusiva.

O modelo de trombose induzida cloreto férrico tem prestado um enorme progresso na compreensão desta patologia. Ele tem sido usado em muitos estudos que incidem sobre o papel do factor de von Willebrand na formação da trombose ^18,19. Combinado com modi genéticatécnicas ficação, permitiu a identificação de muitos genes específicos envolvidos em doenças trombóticas. Lamrani et ai. por exemplo, demonstraram que um knock-in do gene JAK2 ^V617F está associada com uma formação acelerada de coágulo instável ^20. Zhang et ai. Investigaram a implicação fisiológica do receptor P2Y12 de plaquetas e demonstraram que os ratinhos transgénicos que sobre-expressam este receptor especificamente em plaquetas somente, apresentou uma formação de trombo mais rápida e estável na artéria mesentérica feridos com FeCl ₃ ^21. O papel crucial de activador do plasminogénio tipo tecido (tPA) e uroquinase-tipo do activador de plasminogénio (uPA) no processo de degradação de fibrina, também tem sido investigada neste método ^22. Além disso, este modelo também fornece um modo simples e preciso de testar as capacidades fibrinolíticas de muitas drogas novas in vivo. Por exemplo, Wang et al. Usaram este modelo de the validação pré-clínica de um romance ativador do plasminogênio recombinante dirigido contra plaquetas ativadas ^23. Este método também permitiu a validação de proteínas terapêuticas isoladas a partir da saliva de morcegos vampiros, carrapatos e mosquitos, ou a partir do veneno de serpentes de identificação específico do alvo ^24-27. Estes exemplos demonstram a versatilidade do modelo de cloreto férrico. Neste artigo, vamos nos concentrar em dois métodos e estudar cloreto férrico trombose induzida em dois tipo de navio diferente; vaso mesentérico e artéria carótida.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Alfred Pesquisa Médica e da Educação Comissão de Ética Animal Precinct (E / 1534/2015 / B). Todas as manipulações cirúrgicas foram realizadas sob anestesia geral e os animais não apresentaram dor em qualquer fase. Todas as experiências descritas são não-recuperação.

1. Preparação

1. Cortar bandas finas de papel de filtro (1 mm x 2 mm).
2. Recentemente preparar duas soluções de cloreto férrico, de 4% (w / v) e 6% (w / v) diluída em água desionizada. Preparar a solução de rodamina 6G 0,3% em PBS, filtrou-se através de 0,22 um.
3. Corte um pequeno pedaço (5 mm x 1 cm) a partir da seringa de plástico branco de embalagem.

2. Mesentery arteríola formação de trombos Observado por Microscopia intravital

1. Pesar de 10-12 semanas de idade C57BL / 6 de tipo selvagem do rato e anestesiar em conformidade com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), embora a injecção intraperitoneal. Monitore a profundidade da anestesia com a resposta aos pés, cauda e / ou pitada pele, reatividade de pitada córnea e da pálpebra, e ausência de movimento bigodes. Se necessário, injectar uma segunda dose de cetamina (50 mg / kg) para manter a anestesia do animal. Aplicar pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. Colocar o rato numa pequena placa de petri colocado sobre uma almofada de aquecimento ajustada a 37 ° C.
   Nota: Embora a injecção IP pode resultar em dor para os animais, a duração deste desconforto será mínimo (menos de 3 segundos). Dor e desconforto associado com injecções irá ser minimizado através da utilização de pessoal experiente e competentes e tamanho da agulha adequada (25 L). Após todos os procedimentos, todos os animais a eutanásia, usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical.
2. Executar uma incisão na linha média abdominal de cerca de 3 cm na pele e corte cuidadosamente o peritônio.
3. Colocar o rato no lado do animal de estimaçãori prato, exteriorizar suavemente seus intestinos e espalhar cuidadosamente o mesentério com 2 cotonetes para trazer um recipiente adequado para a superfície da placa de Petri. Secar bem com um limpador delicado.
   NOTA: Para limitar o movimento dos vasos mesentéricos, a papaverina pode ser utilizado para inibir o peristaltismo intestinal.
4. Embeber a cauda do rato em água morna para dilatar os vasos e injectar 30 jil de Rodamina 6G (0,3%) na veia da cauda do rato com uma seringa 29 G para marcar leucócitos e plaquetas.
5. Coloque a placa de Petri sob um microscópio invertido e foco no arteriole escolhido utilizando o canal de campo claro.
6. Embebe-se um papel de filtro de banda com 6% (w / v) de ferro (III) e cloreto de aplicar o papel de filtro sobre a arteríola com duas pinças; a primeira a realizar o papel de filtro, o segundo ao pressioná-lo suavemente sobre a área de interesse. Observar a formação de trombos nos primeiros 10 segundos após a deposição do papel de filtro.
   NOTA: É muito commpara ferir a microvasculatura rodeado e a precisão da deposição do papel de filtro e a pressão é, por conseguinte, importante suavemente para limitar este problema.
7. Observe a formação de trombos por microscopia de fluorescência (TRITC canal: excitação de pico 557 nm, 576 nm pico de emissão), por meio do papel de filtro. Observe os leucócitos circulantes e plaquetas, que têm tido até o Rodamina 6G ea sua agregação para o trombo é, portanto, fácil de identificar.
8. Aqui o papel de filtração após 1 min de exposição a ferro (III) e cloreto de continuar a monitorizar a formação do trombo. Lavar o recipiente com PBS.
9. Observar e registar a formação dinâmica do trombo em destaque com a rotulagem de plaquetas e leucócitos com a Rodamina 6G. Capturar as imagens e medir o tamanho do trombo. As imagens aqui apresentados foram obtidos com um microscópio intravital invertido, embora uma objectiva de 4X, no canal de fluorescência TRITC.
10. Fepois todos os procedimentos, a eutanásia dos animais usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical.

3. Formação Carótida Artéria Thrombus avaliada pela medição do fluxo de sangue Velocity

1. Pesar de 10-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse e anestesiar em conformidade com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), embora a injecção intraperitoneal. Aplicar pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
2. Corrigir o mouse sob um microscópio cirúrgico usando fita adesiva nas pernas, em uma almofada de aquecimento ajustado para 37 ° C.
3. Faça um pequeno travesseiro para fora de um limpador e gravá-lo sob a cabeça do rato para elevar a cabeça ligeiramente. Use um loop fio com pinças para puxar o focinho para baixo (use dentes superiores). Isto irá expor a região da artéria carótida para fácil acesso.
4. Realize uma pequena 5 mm de profundidade da incisão da pele logo abaixo da mandíbula, até o esterno.
5. Dissecar a fascia e isolar um fragmento de qualquer artéria carótida comum esquerda ou para a direita acima da bifurcação.
6. Introduzir cuidadosamente pinças em-entre a artéria eo nervo para separá-los. Não perturbe o nervo que perto da artéria e evitar tocar muito da artéria carótida, uma vez que pode causar danos ao navio. Isolar uma secção de pelo menos 5 mm da artéria.
7. Seca-se a área da artéria adequadamente com escovas para evitar que qualquer líquido que interfere com o FeCl _3.
8. Coloque o pequeno pedaço de plástico branco sob a parte isolada da carótida comum, de modo a _FeCl3 não mergulhe nos tecidos circundantes. Para esta finalidade, utilizar um segundo uma pinça para trazer a peça para o primeiro, em seguida, lentamente deslizar o papel plástico sob a artéria.
9. Embebe-se um pedaço de papel de filtro com 4% (w / v) ou 6% (w / v) de cloreto férrico e colocá-lo em redor da artéria.
10. Após 3 min de exposição, retirar o papel de filtro, lavar com PBS e secar a área wlimpadores de pára-om.
11. Coloque a sonda de fluxo Doppler em torno do navio no local da lesão e começar a gravar as mudanças no fluxo. Na carótida comum saudável de ratos adultos, o fluxo é normalmente cerca de 1 mL / min. Cuidado! contacto da sonda com cloreto férrico vai danificar a sonda de modo que qualquer contacto deve ser evitado. Os dados aqui apresentados foram obtidos com um medidor de fluxo Transonic System Inc., perivascular TS420 módulo equipado com uma sonda de fluxo Doppler Nano 0,5 PBS.
    NOTA: A concentração de cloreto férrico pode modificar as cinéticas de formação de trombo, resultando em diferentes tempos de oclusão. Assim, uma exposição a 6% (w / v) de cloreto férrico dá uma oclusão mais rápido do que a exposição a 4% (w / v) de cloreto férrico.
12. Seguindo todos os procedimentos, eutanásia todos os animais usando uma overdose de cetamina e xilazina seguido por deslocamento cervical e limpar cuidadosamente a sonda Doppler.

Resultados

A observação de microscopia intravital fluorescente do mesentério irá revelar a acumulação de Rodamina 6G marcado plaquetas e leucócitos ao longo da parede do vaso lesionado por FeCl _3. A formação progressiva de um trombo é monitorizado parcial num recipiente de 200 um mesentério (Figura 1). Um trombo aparece lentamente e é claramente identificável após o primeiro minuto de exposição à FeCl ₃ (Figura 1, t = 60 segundos). 40 segundos após a remoção do papel de filtr...

Discussão

O modelo de trombose cloreto férrico induzida é uma excelente ferramenta de pesquisa. Como se mostra neste estudo, é extremamente fácil de implementar e, quando utilizado em combinação com a microscopia intravital ou medidor de fluxo de Doppler, que fornece uma boa monitorização em tempo real de formação de trombos. Ajustando o tempo de exposição e a concentração do FeCl _3, como também oferece a possibilidade de produzir ou trombos oclusivos ou não-oclusivos.

No entanto, este méto...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Papel para cromatografia Whatman	GE Healthcare	3030917
Cloreto de ferro (III) 40% (w/v)	VWR	24212.298
Rodamina 6G	Sigma	R4127
Microscópio invertido	Câmera	IX81
	Olympus	XM10
	Transonic	TS420
Sonda de fluxo Nano-doppler	Transônico	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
xilazina (Rampun)	Bayer	75313
Placa de Petri	Sarstedt	82.1472
Seringa de insulina (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Aplicadores com ponta de algodão	BSN medical	211827A
Suturas Dynek dysilk	Dynek Pty Ltd	CS30100
tampão fosfato salino Dulbecco (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Almofada térmica	Kirchner	T60

digital em preto e branco Olympus Medidor de fluxo Doppler