Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

Daria V. Ilatovskaya; Oleg Palygin; Vladislav Levchenko; Alexander Staruschenko

doi:10.3791/52850

Artigo de método

Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

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DOI:

10.3791/52850

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27 de junho de 2015

Daria V. Ilatovskaya¹ , Oleg Palygin¹ , Vladislav Levchenko¹ , Alexander Staruschenko¹

¹Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

Neste artigo

Resumo

Alterações nos níveis de cálcio intracelular nos podócitos são um dos meios mais importantes para controlar a função de filtração dos glomérulos. Aqui, explicamos uma abordagem de alto rendimento que permite a detecção do manuseio de cálcio em tempo real e da atividade de canais iônicos únicos nos podócitos dos glomérulos recém-isolados.

Resumo

Os podócitos (células epiteliais glomerulares renais) são conhecidos por regular a permeabilidade glomerular e manter a estrutura glomerular; um papel fundamental para essas células na patogênese de várias doenças renais foi estabelecido, uma vez que a lesão podocitária leva à proteinúria e ao apagamento do processo do pé. Foi relatado anteriormente que vários agentes endógenos podem causar uma sobrecarga dramática na concentração intracelular de Ca²⁺nos podócitos, presumivelmente levando à albuminúria, e isso provavelmente ocorre por meio de canais iônicos condutores de cálcio. Portanto, pareceu-me importante estudar o manuseio do cálcio nos podócitos tanto em condições normais quanto em vários estados patológicos. No entanto, as abordagens experimentais disponíveis permaneceram um pouco limitadas a células cultivadas e transfectadas. Embora representem um bom modelo básico para tais estudos, são essencialmente extraídos do ambiente nativo do glomérulo. Aqui descrevemos a metodologia de estudo de podócitos como parte do glomérulo inteiro recém-isolado. Esta preparação retém o potencial funcional dos podócitos, que ainda estão presos aos capilares; portanto, os podócitos permanecem no ambiente que conserva a maior parte do aparelho de filtração dos glomérulos. O presente manuscrito elabora duas abordagens experimentais que permitem 1) detecção em tempo real de alterações na concentração de cálcio com a ajuda de microscopia de fluorescência confocal raciométrica e 2) o registro da atividade de canais iônicos únicos nos podócitos dos glomérulos recém-isolados. Essas metodologias utilizam as vantagens do ambiente nativo do glomérulo que permitem aos pesquisadores resolver alterações agudas no manuseio de cálcio intracelular em resposta a aplicações de vários agentes, medir a concentração basal de cálcio dentro das células (por exemplo, para avaliar a progressão da doença) e avaliar e manipular a condutância de cálcio no nível de canais iônicos únicos.

Introdução

Rins manter o equilíbrio homeostático para várias substâncias e regular o volume de sangue de uma forma que determina a pressão arterial total. Distúrbios no filtração renal, reabsorção ou secreção de causar ou acompanham os estados patológicos, que variam de hiper ou hipotensão para a doença renal terminal que eventualmente exige transplante renal. A unidade de filtração renal (glomérulo) consiste em três camadas - o endotélio capilar, membrana basal e uma camada de célula única de células epiteliais - podócitos, que desempenham um papel importante na manutenção da integridade e função de ^um diafragma de fenda. Disfunção no filtro de permeabilidade select....