Alterações nos níveis de cálcio intracelular nos podócitos são um dos meios mais importantes para controlar a função de filtração dos glomérulos. Aqui, explicamos uma abordagem de alto rendimento que permite a detecção do manuseio de cálcio em tempo real e da atividade de canais iônicos únicos nos podócitos dos glomérulos recém-isolados.
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Artigo de método
Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os podócitos (células epiteliais glomerulares renais) são conhecidos por regular a permeabilidade glomerular e manter a estrutura glomerular; um papel fundamental para essas células na patogênese de várias doenças renais foi estabelecido, uma vez que a lesão podocitária leva à proteinúria e ao apagamento do processo do pé. Foi relatado anteriormente que vários agentes endógenos podem causar uma sobrecarga dramática na concentração intracelular de Ca2+ nos podócitos, presumivelmente levando à albuminúria, e isso provavelmente ocorre por meio de canais iônicos condutores de cálcio. Portanto, pareceu-me importante estudar o manuseio do cálcio nos podócitos tanto em condições normais quanto em vários estados patológicos. No entanto, as abordagens experimentais disponíveis permaneceram um pouco limitadas a células cultivadas e transfectadas. Embora representem um bom modelo básico para tais estudos, são essencialmente extraídos do ambiente nativo do glomérulo. Aqui descrevemos a metodologia de estudo de podócitos como parte do glomérulo inteiro recém-isolado. Esta preparação retém o potencial funcional dos podócitos, que ainda estão presos aos capilares; portanto, os podócitos permanecem no ambiente que conserva a maior parte do aparelho de filtração dos glomérulos. O presente manuscrito elabora duas abordagens experimentais que permitem 1) detecção em tempo real de alterações na concentração de cálcio com a ajuda de microscopia de fluorescência confocal raciométrica e 2) o registro da atividade de canais iônicos únicos nos podócitos dos glomérulos recém-isolados. Essas metodologias utilizam as vantagens do ambiente nativo do glomérulo que permitem aos pesquisadores resolver alterações agudas no manuseio de cálcio intracelular em resposta a aplicações de vários agentes, medir a concentração basal de cálcio dentro das células (por exemplo, para avaliar a progressão da doença) e avaliar e manipular a condutância de cálcio no nível de canais iônicos únicos.
Introdução
Rins manter o equilíbrio homeostático para várias substâncias e regular o volume de sangue de uma forma que determina a pressão arterial total. Distúrbios no filtração renal, reabsorção ou secreção de causar ou acompanham os estados patológicos, que variam de hiper ou hipotensão para a doença renal terminal que eventualmente exige transplante renal. A unidade de filtração renal (glomérulo) consiste em três camadas - o endotélio capilar, membrana basal e uma camada de célula única de células epiteliais - podócitos, que desempenham um papel importante na manutenção da integridade e função de um diafragma de fenda. Disfunção no filtro de permeabilidade selectiva glomerular provoca perda urinária de macromoléculas, tais como proteinúria. Vários agentes podem afectar a estrutura das podócitos e os seus processos de pé, que determinam a integridade da barreira de filtração glomérulos.
Os podócitos estão envolvidos na manutenção do glomfunção de filtração eruli. Foi estabelecido que a manipulação imprópria de cálcio pelo podócitos leva a lesão celular e desempenha um papel importante na progressão de várias formas de nefropatias 2,3. Portanto, o desenvolvimento de um modelo que permite a medição direta da variação da concentração de cálcio intracelulares será fundamental para estudos de função podocyte. Isolado glomérulos foram anteriormente utilizados em um numerosos estudos, incluindo medição do coeficiente de reflexão albumina muda 4 e avaliação das correntes celulares integral na de células inteiras eletrofisiológicos medições de patch-clamp 5,6. No presente artigo descrevemos o protocolo que permite ao pesquisador para medir as mudanças de concentração de cálcio intracelular em resposta aos pedidos de agentes farmacológicos, estimar os níveis basais de cálcio dentro das células, e avaliar indivíduo atividade canais de cálcio. Medições da concentração de cálcio Ratometric e patch-clamp electrophysiology foram usadas para determinar as alterações na concentração intracelular de cálcio no seio da actividade podócitos e canal, respectivamente.
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Protocolo
O uso de animais e bem-estar devem aderir ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório seguindo protocolos revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC).
1. Lave rim
- Use 8 a 12 semanas de idade de ratos macho (sugerido é uma estirpe Sprague Dawley, no entanto outras estirpes de idade e sexo diferente pode ser utilizado com modificações apropriadas).
- Anestesiar o animal de acordo com o procedimento permitido pelo protocolo IACUC; monitorar a profundidade da anestesia e inspecionar o animal. A descrição detalhada da cirurgia a ser realizada em 1,3-1,8 pode ser encontrado em Ilatovskaya et al 7.
- Após anestesia adequada, colocar o animal em uma mesa cirúrgica, com temperatura controlada, fazer uma incisão na linha média do abdome (até 3 polegadas de comprimento), e descobrir a veia cava ea aorta.
- Insira ligadura ao redor dos celíacos e artérias mesentérica superior e da abdominalaorta acima daqueles; não ligadura.
- Blunt dissecar a aorta abdominal abaixo das artérias renais, e coloque duas ligaduras em torno dele, mas não ligar, em seguida, apertar a aorta acima das ligaduras e amarre o fio inferior.
- Cateterize aorta com uma tubagem de polietileno PE50 (ligado a uma bomba seringa cheia com PBS) abaixo da braçadeira e fixar o cateter com a segunda ligadura; remover o grampo, ligar a bomba, e ligar a aorta e artérias mesentérica com doença celíaca. Rapidamente fazer incisão na veia renal para aliviar a pressão.
- Infundir a aorta com o PBS pré-arrefecida durante 2 ou 3 minutos a um caudal de 6 ml / min.
- Pare de perfusão, especiais de consumo e 7 decapsulate os rins, e colocá-los no gelo na solução PBS. Eutanásia do animal de acordo com o protocolo aprovado pelo IACUC.
2. Isolamento do Rato Os glomérulos
- Preparar 30 ml de solução fresca de 5% de BSA em meio RPMI 1640.
- Usando uma lâmina de barbear e tesouras,isolar o córtex de ambos os rins, e em seguida, mediu até ficar homogénea. Este procedimento foi descrito anteriormente 7.
- Empurrar o tecido moído durante o passo anterior através de um peneiro de aço inoxidável de malha 100 (pré-embebidos em solução de BSA a 5% / RPMI) utilizando uma espátula. Recolhe-se o fluxo de passagem e por força da gravidade permitir o fluxo de passagem para passar através de um peneiro de 140 mesh.
- Filtra-se o fluxo através recolhidos a partir de 140 utilizando um peneiro de malha pré-embebido peneira de malha 200, descarta-se o filtrado e lava-se a parte superior do crivo com 10 - 15 ml da solução de BSA / RPMI preparado para recolher os glomérulos que sedimentam sobre o crivo.
- Coloque a solução de BSA / RPMI contendo glomérulos sobre gelo em um tubo de 15 ml e deixar o sedimento glomérulos na parte inferior do tubo de até 20 min. O concentrado glomérulos no fundo do tubo irá ser claramente visto. Remover o excesso de solução, deixando cerca de 2 ml no tubo.
3. Single-channel patch-clamp Electrophysiology
- Prepare 5 x 5 milímetros chips de vidro capa de revestimento com 70.000 MW - 150.000 poli-ʟ-lisina, e deixe secar. Use cerca de 30 ml de solução estéril filtrado 0,01% em água por tampa de vidro.
- Aquecer as soluções experimentais para a TA e encher a câmara de patch-clamp e pipeta. Para a monitorização canais trpC, usar uma solução de banho, em mM: 126 de NaCl, 1 CaCl2, 10 de HEPES, 2 de MgCl2, 10 de glucose, pH 7,4; pipeta: 126 de NaCl, CaCl2 1,5, HEPES 10, glucose 10; pH 7,4.
- Adicionar inibidores para a solução da pipeta para bloquear a actividade de canais endógenos, os quais não são relevantes para os estudos (recomendados são: 100 uM de ácido niflúmico ou DIDS (para bloquear Ca 2+ -activated canais Cl -), 10 mM de TEA (para inibir a grande condutância Ca 2 + - K + dependente do canal), 10 nM iberiotoxin (para bloquear os canais de K + -activated Ca2 +), 10 mM nicardipina (para bloquear N-tipo Ca2 + canais)) diretamente antes do experimento patch-clamp.
- Misture suavemente a solução contendo glomérulos, e em seguida, aplicar cerca de 50 l de la à tampa revestida chips de vidro poli-ʟ lisina. Deixe os glomérulos anexar por aproximadamente 5 min.
- Mover os chips de vidro com glomérulos para a câmara de patch-clamp pré-cheia com a solução de banho; perfundir a câmara a um caudal de 3 ml / min durante 1 min para assegurar a remoção dos glomérulos não acopladas.
- Realizar um experimento patch-clamp convencional em um modo ligado à célula 7. Com uma pipeta de vidro (7-10 mohms resistência pipeta) formar uma vedação de alta resistência entre uma pipeta e uma membrana podócitos por aplicação de sucção suave (uma pipeta ligada a um podócitos na superfície do glomérulo isolado é mostrado na Figura 2, em a esquerda).
- Para as medições ligado de células, de baixo passam as correntes em 300 Hz por um filtro de oito pólos Bessel.
- VOCÊse isolado glomérulos em experimentos de patch-clamp para até 4-6 horas. Mantenha a fração estoque glomérulos no gelo.
4. Raciometrico confocal de fluorescência As medições da concentração de cálcio intracelular no Podócitos
- Colocar 500 mL da fracção de glomérulos (descrito em 2.5) em 0,5 ml de tubo cónico e adicionar corantes cálcio Fura Red, AM e Fluo-4, AM. Utilizar 2 mM e 1 mM concentrações de banco de Fura Red, AM e Fluo-4, AM, respectivamente (armazenar a -20 ° C, dissolveu-se em DMSO) e 2,5 ul de usar cada corante por 500 ul de fracção de glomérulos. Imediatamente após a adição dos corantes cobrir o tubo com folha de alumínio.
- Colocar os tubos num agitador rotativo durante pelo menos 20 minutos até 1 hora à TA.
Nota: Os agentes farmacológicos podem ser adicionados durante este passo. - Prepare lamelas de vidro, cubra-os com poli-ʟ-lisina e permitir a secagem usando set placa aquecida a 70 ° C.
- Uma vez que o carregamento de corantes de cálcio é complete, aplicar 100 ul de solução contendo os glomérulos para as lamelas revestidas com poli-ʟ-lisina e deixá-los aderir à superfície durante cerca de 5 min. Montar as lamelas anexado-glomérulos em uma câmara de imagem, e perfundir com a solução de banho (contendo (em mM): 145 NaCl, 4,5 de KCl, 2 de MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) com um caudal de 3 ml / min para remover os glomérulos acopladas e os corantes restantes.
- Definir o microscópio confocal de varrimento a laser a um comprimento de onda de excitação de 488 nm e filtros de emissão (525/25 e 650/25 nm para Fluo-4 e Fura Red, respectivamente). Definir o software de imagem para uma freqüência e resolução desejada.
- Encontre o glomérulos em claro e, em seguida, ligue a detecção do sinal de fluorescência. Ajustar a intensidade do laser para cada corante para evitar a saturação do sinal. Escolha o plano focal com as podocytes que estão diretamente ligados ao vidro. Isto minimiza o efeito causado pela contracção de um glomérulo em resposta à drogaaplicação. Verifique novamente se o glomérulo de escolha é bem ligado ao vidro;
- Comece imaginando o plano focal de escolha (levar 512 x 512 imagens com a freqüência ajustada em 4 segundos para visualizar rápido Ca 2+ alterações transitórias. Use um / NA 1.4 ou lente objetiva semelhante 60X imagem de alta resolução para), aplicar medicamentos de interesse, e registar a resposta.
- Escolher um plano focal desejado (o mais próximo da superfície do vidro quanto possível, para assegurar a imagiologia de podócitos na superfície do glomérulo). Verifique a intensidade da fluorescência na Fluo4 e canais FuraRed, e certifique-se que o glomérulo é claramente visto em campo claro.
- Iniciar a imagiologia. Antes da aplicação de todas as drogas, ficha, pelo menos, 1 min de linha de base de fluorescência para assegurar que o sinal é estável (não há picos repentinos ou desvanecimento do sinal).
- Aplicar drogas desejadas com a ajuda de uma micropipeta; ter cuidado e garantir a droga foi capaz de difundir bem e alcançar o glomerulus. Misturar a solução de banho suavemente se necessário, monitorar o plano focal selecionado e verifique se ele não se moveu fora de foco por causa da aplicação de drogas.
- Registar as alterações na intensidade de fluorescência para os sinais Fluo4 e FuraRed. Certifique-se a gravação é longo o suficiente, esperando até que o sinal atinge o nível de patamar ou atinge um pico e, em seguida, retorna à linha de base. Execute mudança solução ou adição de quaisquer outros medicamentos, se necessário.
- Parar a gravação e salvar o arquivo no formato nativo do software.
5. Análise de Imagem para as medições de cálcio
- Realizar análise de imagem com o software open ImageJ equipado com o plug-in utilitário ND que permite importar imagens no formato nativo ND2.
- Importar a seqüência de imagens; certifique-se de dividir os canais e usar um modo hyperstack em tons de cinza.
- Siga o → Ferramentas → caminho Analisar gerente ROI no software ImageJ para opena uma janela do gerenciador de ROI. Seleccione várias regiões de interesse (podocytes) usando uma ferramenta de seleção oval eo "(t) Adicionar" função no Gerenciador de ROI. Como o último ROI, selecione a área no fundo; salvar as ROIs selecionadas (Mais → Salvar).
- Realce a janela que contém o canal selecionado para análises. Use a mais → função multi Medida no Gerenciador de ROI, marque a caixa "uma linha por fatia" no diálogo que aparece, e em seguida, clique em OK. Os resultados serão mostrados no formato que pode ser configurado na janela de resultados: entrar nas opções de menu Resultados → Definir Medidas, selecione "valor de cinza média" e calcular os valores de intensidade de pixel para cada ROI, que será exibido na janela de resultados em colunas separadas para cada ROI.
- Copie os valores de intensidade de ROI medidos para cada canal (Fluo-4 e Fura Red) em software de análise de dados preferido; valores de intensidade fundo subtrair de cada datum ponto.
- Para cada ponto de tempo calcular o rácio de intensidades do Fluo-4 aos canais Fura Red. Gráfico de dispersão / linha mudanças em tempo ponto de Ca 2+ transitória para cada ROI. Calcule os valores médios / SE para glomérulos selecionados.
Nota: coluna Time deve ser definido de acordo com a frequência de imagem selecionada em 4.5.
6. Os cálculos de concentração intracelular de cálcio usando fluorescência de Fluo-4 Sinal
- Retirar uma amostra de glomérulos e executar o protocolo experimental acima para o passo 4.7. Depois de gravar a fluorescência de fundo adicionar Ionomicina (concentração final na câmara do banho deve ser de 10 uM) à solução de banho, e aumento da intensidade de fluorescência ficha. Uma vez que a intensidade atinge o seu máximo e começa a decadência, adicione MnCl2 (concentração final deve ser de 5 mm) para extinguir a fluorescência 8.
- Analisar os dados obtidos em 6.1. Copie os Fluo-4 valores de intensidade de sinal ROI obtidos de acordocom o protocolo descrito em 5,1-5,5 por software de análise preferido.
- Calcular a concentração intracelular de cálcio (em nM) na podócitos correspondente ao ROI através de uma fórmula:
K onde d é uma dissociação pré-determinada constante para Fluo-4 (345 nM), F é a intensidade no ponto de tempo que está a calcular a concentração de cálcio para (linha de base), e F e F max min são os valores de intensidade na ponto de carga máxima de cálcio (após aplicação ionomicina) e após a extinção da fluorescência do (com MnCl 2), respectivamente (ver Figura 3).
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Resultados
Aqui abordamos o problema de medir alterações agudas nos níveis de cálcio nos podocytes. A Figura 1 mostra uma representação esquemática do protocolo experimental projetado para realizar alta resolução de imagem confocal de fluorescência ao vivo e gravações de atividade de canais iônicos individuais nos podocytes do recém- glomérulos isolados de roedores. Resumidamente, após o rato é anestesiados, os rins devem ser lavados com PBS para limpá-las de sangue. Em seguida, os rins são excisados e decapsula...
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Discussão
A abordagem aqui descrita permite a análise de manuseamento de cálcio pelos podócitos dos glomérulos de roedores. Esta técnica permite a aplicação de patch-clamp eletrofisiologia canal único e fluorescência confocal ratiometric imagem. No entanto, ambas as abordagens podem ser utilizadas separadamente, por conta própria. O protocolo proposto tem várias etapas relativamente simples, incluindo rubor 1) rim; 2) isolamento dos glomérulos por peneiração diferencial; 3) realização de patch-clamp experimentos eletrofisiológico...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) para a assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Gregory Blass é reconhecida pela revisão crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde HL108880 concessão e American Diabetes Association conceder 1-15-BS-172 (para AS), eo Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl em DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poli-ʟ-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Ácido Plurônico | Sigma-Aldrich | F-68 | solução |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Rotador de tubos | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Alemanha |
| Microscópio confocal Nikon (invertido) | Nikon | Nikon A1R | Excitação a laser de 488 nm. Filtros de emissão 500-550 nm e 570-620 nm |
| Objetiva | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Óleo | |
| Lâmina de cobertura | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Graxa de alto vácuo | Dow Corning | Composto de silicone | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Câmara de gravação/perfusão | Warner Instruments | RC-26 | |
| Amplificador de patch clamp | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Sistema de aquisição de dados | Molecular Devices | Digidata 1440A | Sistema Axon Digidata® |
| Filtro passa-baixa | Warner Instruments | LPF-8 | Filtro de Bessel de 8 polos |
| Capilares de vidro borossilicato | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Puxador de micropipetas | Sutter Instrument Co | P-97 | Puxador de micropipetas tipo Flaming/Brown |
| Microforja | Narishige | MF-830 | Japão |
| Micromanipulador motorizado | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Microscópio invertido | Nikon | Eclipse Ti | |
| Mesa de isolamento de microvibrações | TMC | equipada com gaiola de Faraday | |
| Sistema de perfusão com válvula multicanal | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Câmara de gravação/perfusão | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipina | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxina | Sigma | I5904-5UG | |
| Ácido niflumico | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| Cloreto de TEA | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | sem antibióticos |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | solução de albumina a 30% |
| Mesa cirúrgica com controle de temperatura | MCW core | para roedores | |
| Peneiras de aço: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| Malha 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | peneira para CD-1 |
| Microscópio binocular | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Microscópio binocular | Nikon | SMZ745 | |
| Sistema de perfusão baseado em bomba de seringa | Harvard Apparatus | ||
| Tubo de polietileno | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Anestesia com isoflurano |  VetEquip, Inc. | 911103 | |
| Outros reagentes básicos | Sigma-Aldrich |
Referências
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Reimpressões e permissões
