Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Resumo

Este protocolo de co-imunoprecipitação permite estudar a interação entre a nucleoproteína do vírus influenza A e a proteína antiviral Mx1 em células humanas. O protocolo enfatiza a importância da N-etilmaleimida para a co-imunoprecipitação bem-sucedida da nucleoproteína Mx1 e do vírus influenza A.

Resumo

Estudar a interação entre proteínas é fundamental para entender sua(s) função(ões). Um método muito poderoso que é frequentemente usado para estudar interações de proteínas com outras macromoléculas em uma amostra complexa é chamado de co-imunoprecipitação. O protocolo de co-imunoprecipitação descrito permite demonstrar e investigar ainda mais a interação entre a proteína 1 de resistência ao mixovírus antiviral (Mx1) e um de seus alvos virais, a nucleoproteína (NP) do vírus influenza A. O protocolo começa com células de mamíferos transfectadas, mas também é possível usar células infectadas pelo vírus influenza A como material de partida. Após a lise celular, a proteína NP viral é puxada para baixo com um anticorpo específico e os complexos imunológicos resultantes são precipitados com grânulos de proteína G. A redução bem-sucedida de NP e a co-imunoprecipitação da proteína antiviral Mx1 são subsequentemente reveladas por western blotting. Um pré-requisito para a co-imunoprecipitação bem-sucedida de Mx1 com NP é a presença de N-etilmaleimida (NEM) no tampão de lise celular. Os alquilados NEM liberam grupos tióis. Presumivelmente, essa reação estabiliza a interação NP-Mx1 fraca e / ou transitória, preservando uma conformação específica de Mx1, seu alvo viral ou um terceiro componente desconhecido. Uma limitação importante dos experimentos de co-imunoprecipitação é a redução inadvertida de proteínas contaminantes, causada pela ligação inespecífica de proteínas às esferas de proteína G ou anticorpos. Portanto, é muito importante incluir configurações de controle para excluir resultados falsos positivos. O protocolo de co-imunoprecipitação descrito pode ser usado para estudar a interação de proteínas Mx de diferentes espécies de vertebrados com proteínas virais, qualquer par de proteínas ou de uma proteína com outras macromoléculas. O papel benéfico do NEM para estabilizar interações fracas e/ou transitórias precisa ser testado para cada par de interações individualmente.

Introdução

Resistência myxovirus (Mx) proteínas são uma parte importante da defesa imune inata contra patógenos virais. Estas proteínas são grandes GTPases dinamina-like que são induzidos por tipo I e tipo III interferons. Os genes Mx correspondentes estão presentes em quase todos os vertebrados em uma ou várias cópias e dos seus produtos de genes inibir uma vasta variedade de vírus, incluindo Orthomyxoviridae (por exemplo., O vírus da gripe), Rhabdoviridae (por exemplo., O vírus da estomatite vesicular), Bunyaviridae (por exemplo. , La Crosse vírus) e Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana-1) ^1-4. Não está cla....

Protocolo

Nota: O seguinte protocolo de transfecção e co-imunoprecipitação é estabelecida para um formato de placa de Petri 9 cm. Outros formatos também são possíveis após a escala do protocolo.

1. Sementeira do rim embrionário humano (HEK) Células 293T

1. Semente da células HEK293T um dia antes da transfecção a 1,2 x 10 ⁶ culas por 9 centímetros de Petri em 12 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 0,4 mM de Na-piruvato, 0,1 aminoácidos não essenciais mM, 100 U / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina.
2. Crescer as células 16 horas a....

Resultados

N-etilmaleimida é um composto orgânico que pode ser utilizado para modificar irreversivelmente grupos tiol livres, por exemplo, para inibir as proteases de cisteína (Figura 1).

A proteína antiviral Mx1 inibe a replicação do vírus da gripe A, interagindo com a nucleoproteína virai. O protocolo de co-imunoprecipitação otimizado aqui descrito permite estudar essa interação NP-Mx1. Células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão para a proteína Mx1 antivir.......

Discussão

O estudo da interacção entre proteínas antivirais e seus alvos virais é muito importante para compreender os detalhes do mecanismo antiviral destas proteínas. Isso pode dar novos insights sobre como os vírus e seus hospedeiros co-evoluído e ser a base para o desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O protocolo de co-imunoprecipitação optimizado descrito aqui permite o estudo da interacção entre a proteína de rato e a sua Mx1 alvo viral, a proteína NP da gripe. O aspecto mais importante deste protocolo é a adição.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM alta glicose	Gibco	52100-047
N-Etilmaleimida	Sigma	E-3876	Tóxico
Igepal CA-630	Sigma	I-30212	também conhecido como NP40
Coquetel de inibidor de protease	Roche	11 873 580 001
anticorpo monoclonal anti-NP	NIH Biodefesa e Infecções Emergentes Repositório	de Recursos de PesquisaNR-4282	ascite mistura de clones A1 e A3 soro
policlonal anti-RNP	NIH Biodefesa e Infecções Emergentes Repositório de Recursos de Pesquisa	NR-3133	dirigido contra A/Scotland/840/74 (H3N2)
Proteína G Sepharose 4FF	GE Healthcare	17-0618-01
Hiperfilme ECL 18 x 24 cm	GE Healthcare	28-9068-36
ECL substrato de western blotting	Pierce	Rolamento 32106