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Artigo de método

Criação e Caracterização da UTI e CAUTI em um modelo de rato

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DOI:

10.3791/52892

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23 de junho de 2015

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1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

Neste artigo

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Resumo

A capacidade de modelar infecções do trato urinário (ITU) é crucial para poder entender a patogênese bacteriana e gerar o desenvolvimento de novas terapêuticas. O objetivo deste trabalho é demonstrar modelos de camundongos de ITU experimental e ITU associada a cateter que recapitulam e predizem achados observados em humanos.

Resumo

Infecções do trato urinário (ITU) são altamente prevalentes, uma importante causa de morbidade e estão cada vez mais resistente ao tratamento com antibióticos. As fêmeas são desproporcionalmente afetados por UTI: 50% de todas as mulheres terão uma infecção urinária em sua vida. Além disso, 20-40% dessas mulheres que têm uma inicial UTI vai sofrer uma recorrência com algumas recorrências freqüentes que sofrem com grave deterioração da qualidade de vida, dor e desconforto, a interrupção das atividades diárias, aumento dos custos de cuidados de saúde, e poucas opções de tratamento outro de profilaxia antibiótica de longo prazo. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) é o principal agente causador da adquirida na comunidade ITU. Associada a cateter ITU (ITU-SVD) é a infecção hospitalar adquirida mais comum responsável por um milhão de ocorrências em os EUA anualmente e custos dramáticos de saúde. Enquanto UPEC é também a principal causa de CAUTI, outros agentes causadores são da maior importância, incluindo Enterococcusfaecalis. Aqui nós utilizamos dois modelos de ratos bem estabelecidas que recapitulam muitas das características clínicas destas doenças humanas. Para UTI, um modelo C3H / HeN recapitula muitas das características de virulência UPEC observados em seres humanos, incluindo respostas de acolhimento, formação IBC e filamentação. Para CAUTI, utilizando um modelo de murganhos C57BL / 6, que retém o implante na bexiga cateter, tem sido mostrado para ser susceptível a E. faecalis infecção da bexiga. Estes modelos representativos estão sendo usados ​​para ganhar novos insights marcantes na patogênese da doença de UTI, que está levando ao desenvolvimento de novas terapias e estratégias de gestão ou de prevenção.

Introdução

Infecções do trato urinário (ITU) é uma das infecções bacterianas mais comuns e podem ser divididos em duas categorias com base no mecanismo de aquisição, comunidade e hospitalar adquirida UTI. UTIs geralmente ocorrem em mulheres saudáveis ​​e estudos adquirida na comunidade mostraram que aproximadamente 50% das mulheres terão pelo menos uma UTI em sua vida 1. Além disso, a recorrência é um grande problema. Uma mulher que tem uma infecção aguda inicial tem uma chance de 25-40% de ter uma segunda infecção no prazo de seis meses, apesar adequado tratamento antibiótico e muitas mulheres continuam a ter recorrências freqüentes 2. As bactérias que causam estas infecções também estão se tornando cada vez mais resistentes aos antibióticos mais protocolos de tratamento de confusão 3-6. UTI afetam milhões de pessoas a cada ano custando cerca de 2,5 bilhões de dólares em despesas relacionadas com cuidados de saúde em os EUA, ressaltando o impacto ea prevalência da doença1,7 .Nosocomial adquirida UTIs estão principalmente associados com a presença de corpos estranhos, tais como cateteres. Associada a cateter UTIs (CAUTI) continuam a ser os nosocomial mais comum adquirida UTI, representando ~ 70-80% de tais infecções 8. Além disso, CAUTI está associada com aumento da morbidade e mortalidade e é a causa mais comum de infecções da corrente sanguínea secundárias 9.

Comunidade associada UPEC adquirida UTIs são pensados ​​para ser causada pela introdução de bactérias na bexiga de reservatórios no trato gastrointestinal através de manipulação mecânica durante a relação sexual, falta de higiene ou outras dinâmicas população microbiana entre host diferente nichos 10. Uma vez no interior da bexiga, UPEC empregar vários factores de virulência, incluindo cápsulas, sistemas de aquisição de ferro, toxinas, um plasmídeo de virulência, ARNt, ilhas de patogenicidade e fatores de colonização que foram mostrados para desempenhar um papel na patogénese 11-14. Fundamental para o estabelecimento de colonização UPEC, UPEC também codificar vários tipos de acompanhante adesiva arrumador via (CUP) pili que reconhecem receptores com especificidade estereoquimica 15. Tipo 1 pili, inclinado e com a adesina FimH, são expressos por UPEC e se ligam uroplakins 16 e α-1, β-3 integrinas 17, que são expressos na superfície luminal dos dois bexigas humanas e mouse 18 mannosylated. Estas interacções mediadas por FimH facilitar a colonização bacteriana e invasão das células epiteliais superficiais 19,20. Uma vez dentro da célula, UPEC pode escapar para dentro do citoplasma onde uma única bactéria pode dividir-se rapidamente para formar uma comunidade bacteriana intracelular (IBC), o qual após a maturação, pode conter 10 ~ 4 21 bactérias. Formação IBC tem sido demonstrada em, pelo menos, seis estirpes diferentes de rato, C3H / HeN, C3H / HeJ, ratinhos C57BL / 6, CBA, FVB / NJ e BALB / C, e com uma grande variedade de diferentes UPEEstirpes C e outras Enterobacteriaceae 22-24. No entanto diferenças temporais e espaciais da formação IBC pode variar, dependendo do fundo do rato e a estirpe infectante UPEC. Em ratinhos C3H / HeN infectadas com o UPEC protótipo estirpes UTI89 ou formação CFT073, IBC pode ser visualizada como pequenos biomassas de bactérias tão cedo quanto 3 hpi (infecção hr post). Esta comunidade continua a expandir-se e atinge um "ponto médio" de desenvolvimento de aproximadamente 6 hpi, quando a bactéria em forma de haste ocupam uma grande percentagem do espaço citoplasmático de células guarda-chuva superficial terminalmente diferenciadas Estes GRG forma precoce de uma maneira relativamente síncrona com a maioria visualizadas dimensões similares e morfologias. ~ 8 hpi as bactérias no IBC mudança a partir de um bacilo cocos morfologia. GRG são de natureza transitória. Assim, a maturação IBC 12-18 resultados HPI em contínua expansão da população bacteriana, seguido do seu filamentação e dispersão para fora da célula with propagação subsequente às células vizinhas 23. Assim, o nicho IBC permite rápido crescimento bacteriano num ambiente protegido da resposta imune do hospedeiro e antibióticos 25. As fases distintas de infecção UPEC que são vistas em ratos também são observadas em seres humanos, tais como os GRG e filamentação, suportando o modelo de ratinho de ITU como uma ferramenta útil que pode ser usado para modelar ITU em seres humanos 22,26-28.

Enquanto a maioria das mulheres experimentam uma infecção urinária em sua vida, o resultado dessas infecções podem variar de infecção aguda auto-limitada sem o retorno, a cistite recorrente frequente. Além disso, estudos têm mostrado uma forte ocorrência familiar de UTI, sugerindo um componente genético contribui para a UTI susceptibilidade 29. Descobrimos que os resultados divergentes UTI atendidos em clínicas pode ser espelhado pelos resultados diferentes de infecção experimental UPEC entre linhagens puras 30. Por exemplo, C3H / galinha, CBA, Ratinhos DBA, e C3H / HeOuJ são susceptíveis, de uma forma dependente da dose infecciosa, a cistite longa duração, crónica, caracterizada por as bactérias persistentes de título elevado (> 10 4 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml), bacterianas título elevado fardos de bexiga em sacrifício> 4 semanas pós-infecção (WPI), inflamação crônica e necrose urothelial. Estes ratos também apresentam níveis séricos elevados de IL-6, FEC-G, KC e IL-5 nas primeiras 24 hpi que servem como biomarcadores para o desenvolvimento de cistite crónica. Isso pode representar fielmente o curso natural da UTI em algumas mulheres, como estudos placebo mostraram que uma grande percentagem de mulheres que experimentam UTI manterá altos níveis de bactérias em sua urina por várias semanas após os primeiros sintomas da cistite se não for dado o tratamento com antibióticos 31 , de 32 anos. Além disso, usando ratinhos C3H / galinha, descobrimos que uma história de cistite crônica é um fator de risco significativo para infecções recorrentes subseqüentes graves. ITU recorrente é o mais simanifestação clínica gnificant de UTI eo rato C3H / HeN é atualmente o modelo estudado apenas que recapitula uma maior predisposição após a exposição anterior. Um segundo resultado UTI é recapitulada em camundongos C57BL / 6, onde a infecção aguda UPEC é auto-limitada, com resolução de inflamação da bexiga e bacteriúria dentro de aproximadamente uma semana. Interessantemente, no presente modelo, UPEC prontamente formar reservatórios intracelulares quiescentes dentro do tecido da bexiga do que UPEC são capazes de sair de um estado latente para reiniciar uma ITU activo, potencialmente explicando um mecanismo para a mesma estirpe ITU recorrente em seres humanos 33, 34.

Além de influências genéticas em ITU susceptibilidade, a introdução de um cateter na bexiga aumenta grandemente a probabilidade de ter uma infecção, assim como o aumento da gama de bactérias capazes de causar uma infecção. Tem sido demonstrado que a cateterização urinária humana provoca histológica ealterações imunológicas na bexiga devido ao stress mecânico que resulta em uma resposta inflamatória robusta, esfoliação, edema da lâmina e submucusa, desbaste urotelial, e lesão da mucosa do urotélio e rim 35,36. Além disso, o cateter proporciona uma superfície para a fixação bacteriana criando assim um ambiente utilizado por várias espécies de causar CAUTI. Enquanto UPEC ainda são um dos principais contribuintes, Enterococcus faecalis é responsável por 15% destes CAUTI 37. E. faecalis está se tornando cada vez mais resistentes aos antibióticos com vancomicina surgimento de resistência, o que representa um grave problema de saúde 38. E. faecalis possuem inúmeros fatores de virulência, incluindo toxinas e adesinas necessárias para fixação em ambos o cateter e epitélio 38. Durante a sondagem vesical, o anfitrião é vulnerável a adesão microbiana, a multiplicação ea disseminação no 39,40 trato urinário. E. Faecalis forma um biofilme sobre o cateter como parte de um mecanismo de persistir na bexiga e divulgar para os rins, que é reproduzida em um modelo de rato CAUTI 41. Recentemente, tem sido demonstrado durante a cateterização urinária, o fibrinogénio (Fg) é libertado para dentro da bexiga, como parte da resposta inflamatória. Fg acumula na bexiga, reveste o cateter e é essencial para E. faecalis formação de biofilme, funcionando como um andaime anexo. Em um modelo de murganhos C57BL / 6 de rato CAUTI, descobrimos que a E. a formação de biofilme faecalis no cateter, e, assim, a persistência na bexiga, foi dependente do pilus Ebp, especificamente o seu EBPa de adesina de extremidade. Verificou-se que o domínio N-terminal de EBPa se liga especificamente a FG revestimento do cateter. Além disso, verificou-se que a E. faecalis utiliza Fg como fonte de metabólitos durante a infecção, aumentando assim a formação de biofilme 42.

Modelos de ratos têm provado crítica para undersensão, bem como prever manifestações clínicas da UTI e CAUTI 41. Neste artigo vamos demonstrar preparo do inóculo da cistite UPEC isolar UTI89 e inoculação transuretral de camundongos C3H / galinha. Adicionalmente, demonstramos um protocolo para a inserção do cateter na ratinhos C57BL / 6 e inoculação da E. faecalis OG1RF tensão. Ambas as técnicas para levar consistente e fiável ITU ou CAUTI em ratinhos. Nós também exibem técnicas usadas para observar a formação IBC durante cistite aguda e coleta de urina para análise de cistite crônica ou recorrente. Camundongos C3H / HeN têm sido utilizados para estudar aspectos da UPEC patogênese bacteriana incluindo invasão inicial, formação IBC, filamentação eo desenvolvimento de cistite crônica 23,33,43. Estes parâmetros de virulência também têm sido estudadas em uma variedade de outras origens rato 22,33. Para CAUTI, o / 6 modelo C57BL permite a implantação de corpo estranho na bexiga com co bacteriana subseqüenteIonização, que pode ser mantido durante 7 dias após a infecção de 41. Estes modelos têm sido úteis para avaliar mecanismos de virulência bacteriana, respostas do hospedeiro à UTI e mecanismos para subverter a resposta do hospedeiro, muito do que foi posteriormente retomados ou observados em populações humanas clínicos.

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Protocolo

Declaração de Ética: A Comissão de Estudos animal da Universidade de Washington aprovou todas as infecções e procedimentos de mouse, como parte do protocolo número 20120216, o qual foi aprovado 2013/01/11 e 2016/01/11 expira. Cuidado geral dos animais foi consistente com a guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa e Guia de Recursos de Cuidados USDA Animal. Procedimentos de eutanásia são consistentes com as "orientações AVMA para a eutanásia dos animais edição de 2013".

1. UPEC UTI protocolo, Inoculação agulha Preparação (Figura S1)

  1. Retire a tampa da agulha G 30. Linha de aproximadamente 1 polegada de tubagem PE10 sobre o veio da agulha. UV esterilizar os conjuntos de agulha durante a noite. Agulhas cateterizada pode ser armazenado indefinidamente em placas de Petri estéreis.

2. UPEC bacteriana inóculo Preparação

  1. Prepare UTI89 inoculo (começar 72 horas antes da inoculaçãodia ção)
    1. Streak UTI89 sobre uma placa de agar LB (Luria-Bertani) a partir de um lote congelado. Incubar durante a noite a 37 ° C. Escolha uma colónia e inocular-lo em 10 ml de LB num balão de 125 ml. Incubar a 37 ° C durante 24 h, estaticamente.
    2. Inocular 10 ml de cultura de uma noite em 10 ml de LB em um novo frasco de 125 ml durante mais 24 horas adicionais a 37 ° C, estaticamente.
    3. Transferência de 3 ml (irá variar com base no tamanho e estirpe inoculo desejado) para tubos de 1,5 ml estéreis e centrifugar a 7000 xg durante 3 min e ressuspender o pellet em PBS 1x e centrifuga-se uma segunda vez. Ressuspender o sedimento bacteriano em 1 ml de PBS 1x.
  2. Medir a densidade óptica bacteriana e ajustar a concentração para a densidade de inoculo desejado. A concentração do padrão do inoculo utilizado é de 10 7 bactérias; no entanto, isto pode variar de acordo com o desenho do estudo.

3. A inoculação bacteriana

  1. Limpar a estação de trabalho com etanol a 70% e Csobre a área com papel absorvente (ou use capela de fluxo estéril).
  2. Desenha-se a 0,9 ml do inoculo bacteriano preparada numa seringa de 1 ml (TB) (remover as bolhas de ar). Coloque uma agulha de inoculação estéril preparado com PE10 tubulação, na seringa contendo o inóculo, em seguida, cortar o tubo de polietileno estéril.
    NOTA: Deixar um milímetro de tubagem acima da ponta da agulha para evitar a perfuração da bexiga.
  3. Corte um pedaço quadrado de 1 polegada de parafilme e colocar um pouco de lubrificante cirúrgico (aproximadamente do tamanho de uma moeda de dez centavos) por cima.
  4. Anestesiar ratos fêmeas C3H / HeN, colocando-os em uma jarra de vidro 32 onças contendo uma bola de chá-infusor com bolas de algodão embebidas com 3 ml de isoflurano ou câmara de vaporizador (a seguir fabrica protocolo) até inconsciente, mas ainda respirando normalmente (1 respiração / sec) .
    NOTA: Alguns comitês IACUC não aprovar o uso de uma jarra ou vaporizador. Por favor, siga a indicação do comitê IACUC da sua instituição.
    NOTA: Se frasco de vidrocom chá-ball e / ou nariz cone com bolas de algodão isoflurano-soakd são utilizados, o animal deve ser cuidadosamente observados para evitar overdose de anestésico e morte. A vantagem de utilizar uma câmara de vaporizador de anestesia e é que ela proporciona a administração controlada de isoflurano que evita overdose acidental. CUIDADO: O isoflurano é um anestésico por inalação. Utilizar numa área bem ventilada e minimizar a inalação.
  5. Retire o rato da jar / vaporizador e colocá-lo em sua parte traseira em uma toalha de papel e espalhar as pernas.
  6. Cobrir o nariz do rato com um cone de nariz (um tubo ligado ao vaporizador, que fornece uma dose controlada isoflurance que vem equipado com algumas unidades vaporizador) ou tubo de 50 ml com uma bola de algodão contendo uma pequena quantidade (aproximadamente 1-2 ml ) de isoflurano.
  7. Gentilmente palpitar da bexiga para induzir a micção e garantir uma bexiga anulado. Limpe a área periuretral com 100% de etanol wipe. Umedeça a agulha de inoculação / seringa, primeiro ponto, nalubrificante cirúrgico.
  8. Inocular cada murganho com 50 uL da solução de bactérias através da inserção da agulha de inoculação transurethrally, cerca de 12 mm e pressiona o êmbolo da seringa gentilmente para distribuir o inoculo para a bexiga suavemente (10 ul / seg). Remova a agulha inoculação do mouse.
    NOTA: O retorno imediato de inóculo na abertura uretral quando começando a inocular indica inserção inadequada ou incompleta da agulha.
  9. Retirar o mouse de nariz cone e devolvê-lo à sua gaiola. Repita os passos de 3,3-3,8 para cada rato. Quando / se alternando condições de inóculo / estirpes, descarte a seringa ea agulha de inoculação num recipiente apropriado aprovado e começar de novo o passo 3.2.
    NOTA: A inoculação com organismos uropatogênicas geralmente não causar sintomas dor severa. No entanto, em casos raros, a administração de grandes doses de agentes patogénicos podem causar febre, redução na ingestão de alimentos e água e comportamento anormal. UMAnimal saúde devem ser monitorizados durante todo o experimento. Se os sintomas de dor são evidentes aviso, um analgésico, tal como buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg administrados por via subcutânea), pode ser aplicada. Os procedimentos devem estar em conformidade com IACUC de cada instituição.

4. Determinação de Encargos bacterianas

  1. Prepare separadas tubos de 5 ml para cada par de bexiga e rins a ser colhida. Adicionar 1 ml de 1x PBS / tubo / bexiga mouse para ser colhida. Adicionar 0,8 ml de 1x PBS / tubo / par de rins de rato a ser colhida. Rotular cada tubo para corresponder a um determinado rato. Prepara-se uma placa de 96 poços contendo 180 ul de 1x PBS em cada poço diluições em série de 1:10.
  2. Limpar a área de trabalho com etanol 70% e cobrir a área com uma tampa ou papel toalha absorvente.
  3. Anestesiar o mouse com isoflurano (ver passo 3.4) até que o mouse pára de respirar por cerca de 1 min, em seguida, colocá-lo na capa ou toalha de papel absorvente. Outros métodos de euthanasia são também aceites pelas comissões IACUC, tais como dióxido de carbono, e pode ser substituído por overdose de isoflurano.
  4. Sacrificar o rato por deslocamento cervical rápido que consiste em imobilizar o pescoço na base da cabeça e a cauda puxando horizontalmente para longe do corpo até luxação ocorre.
    NOTA: A maioria comissões IACUC exigem um meio secundário de eutanásia e deslocamento cervical é um método comum. No entanto, outros métodos podem ser utilizados, se aprovado pelo comitê IACUC.
  5. Coloque o rato morto em sua parte traseira e spray de etanol de 70% no abdômen. Dissecar o rato, a colheita da bexiga e rins, em que a fim de minimizar a potencial contaminação do sangue a seguir a dissecção do rim. Coloque os órgãos de forma independente para os preparados 5 ml tubos contendo 1x PBS (ver passo 4.1).
    NOTA: Use diferentes tesoura para a dissecção externa e para a colheita de órgãos para minimizar a contaminação.
  6. Toque do tubo para assegurar que os órgãos são em tele 1x PBS. Repita o passo 4,3-4,5 para cada rato. Tesouras limpas e pinças em etanol a 70% depois de cada rato.

5. bacteriana Recovery

  1. Homogeneizar bexiga colhidas e rins nos tubos de 5 ml com um homogeneizador de tecidos, de 15 segundos por rim e bexiga por 30 seg. Lavar sequencialmente homogeneizador em 1x PBS, etanol a 70% e PBS 1x entre amostras.
  2. Fazer diluições em série 1:10 para 10 -8 e cada prato de diluição para a CFU (unidades formadoras de colónias) em placas de LB-agar. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite e contar as colónias no dia seguinte.

6. IBC enumeração

  1. Remover assepticamente o da bexiga e colocá-lo em 1x PBS numa placa de 6 poços com fundo de silicone. As placas podem ser preparadas utilizando um kit de elastómero de silicone e vertendo aproximadamente 1 cm de silicone em cada poço, ver instruções do fabricante. Corte a bexiga ao meio com uma tesoura.
  2. Usando pequenos pinos metálicos afunilar suavemente o bladder, de modo que o lúmen da bexiga fica virado para cima. Certifique-se de colocar os pinos nas bordas exteriores das secções da bexiga para garantir a quantidade máxima de urothelium está exposto.
  3. Após espalhamento, lavar cuidadosamente a bexiga uma vez com PBS 1x. Remover o PBS 1x por pipeta. Fixar a bexiga através da adição de suficiente paraformaldeído a 3% para cobrir toda a bexiga espalmadas. CUIDADO: O paraformaldeído é cancerígeno. Equipamento de proteção adequado, incluindo luvas, deverão ser usados ​​em todos os momentos. O descarte deve seguir as diretrizes institucionais.
  4. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Remover solução de paraformaldeído. Lavar uma vez com PBS 1x.
  5. Lava-se com solução de lavagem de LacZ (2 mM de MgCl 2, desoxicolato de sódio a 0,01% e 0,02% de Nonidet-p40in PBS 1x) três vezes durante 5 minutos por lavagem.
  6. Remover a solução de lavagem e adicionar suficiente mancha LacZ (9,5 ml de solução de lavagem de LacZ, 0,4 mL de 25 mg / ml de X-gal e 0,1 ml de 100 mM de K-ferrocianeto / K-ferricianeto) para cobrir as bexigas. Incubar a 30 ° C overniGHT protegido da luz.
  7. Remover bexigas espalmados da incubadora e observar GRG, que aparecem como azul puncta como visualizado com um escopo de dissecação, ampliação 40-60X.
    NOTA: Às vezes, um mouse pode urinar antes da colocação do tubo sob a uretra. Neste caso, espere 15-20 minutos antes de tentar coletar a urina novamente.

Coleção 7. urina para Bacteriuria CFU enumeração (Não Aplicável para CAUTI)

  1. Para a coleta de urina pré ou pós-infecção gentilmente conter o mouse, segurando a cauda e colocá-la sobre uma superfície plana elevada (superior da gaiola mouse).
  2. Segure um tubo de 1,5 ml estéril por baixo da uretra mouse. Suavemente pressionar para baixo sobre a parte de trás do rato perto da cauda para aplicar pressão sobre a bexiga. Pegar a urina no tubo de 1,5 ml.
  3. Fazer diluições em série 1:10 para 10 -7 e cada diluição em placa LB. adequado Incubar as placas a 37 ° C durante a noite e contar as colónias no dia seguinte.

8. CAUTI Modelo protocolo, Cateter Needle Preparação para CAUTI Modelo (Figura S2)

  1. Retire a tampa da agulha G 30. Cortar um pedaço de tubo de sete milímetros PE10 e 5 mm peça de tubagem de silicone, tais como RenaSIL. Passe a agulha com PE10 tubo até que o tubo toca a base da agulha.
  2. Em seguida, alimentar a peça 5 milímetros na agulha contendo PE10. UV esterilizar os conjuntos de agulhas durante a noite.
    NOTA: Ao colocar o tubo de silicone, deixe cerca de 1 mm da tubulação que se estende além da ponta da agulha.

9. E. faecalis OG1RF bacteriana inóculo Preparação

  1. Prepare OG1RF inóculo a partir de 48 horas antes do dia da inoculação. Streak OG1RF sobre uma placa BHI (infusão de coração e cérebro) a partir de um estoque congelado.
  2. Escolha uma colónia e inocular-lo em 10 ml de caldo BHI e crescer estaticamente durante 18 horas a 37 ° C. Centrifugar a cultura e lavar o sedimento (3 vezes) em volumes de 1 mL de 1x PBS estéril.
  3. Ressuspender o sedimento bacteriano em PBS 1x. Medir a densidade óptica bacteriana e ajustar a concentração para o tamanho do inoculo desejado. A concentração do padrão do inoculo é utilizado 10 7; no entanto, isto pode variar de acordo com o desenho do estudo

10. Implantação do Cateter

  1. Limpe a estação de trabalho com 70% de etanol e cobrir a área com uma cobertura absorvente (ou use capela de fluxo estéril).
  2. Fixe-agulha cateter para uma vazias 1 ml (TB) de seringa. Corte um pedaço quadrado de 1 polegada de parafilme e colocar um pouco de lubrificante cirúrgico (aproximadamente do tamanho de uma moeda de dez centavos) por cima.
    NOTA: Duas agulhas diferentes são usadas para a deposição do cateter e para o inoculo à inoculação acidental minimizada devido à manipulação mecânica necessária para a implantação do cateter. Isto também permite a conveniência de preparação menos agulhas de inoculação.
  3. Anestesiar camundongos C57BL / 6, colocando-os em um frasco de vidro contendo 32 onças um chá-infuser bola com bolas de algodão embebidos em 3 ml de isoflurano ou câmara de vaporizador (a seguir fabrica protocolo) até inconsciente, mas ainda respirando normalmente (1 respiração / sec).
  4. Em seguida, coloque o mouse sobre as suas costas numa toalha de papel e espalhar as pernas. Cubra o nariz do rato com um cone do nariz ou tubo de 50 ml com bolas de algodão contendo uma pequena quantidade (aproximadamente 1-2 ml) de isoflurano.
    CUIDADO: O isoflurano é um anestésico por inalação. Utilizar numa área bem ventilada e minimizar a inalação pelo pesquisador.
  5. Gentilmente palpitar da bexiga para induzir a micção e garantir uma bexiga anulado. Limpe a área periuretral com etanol 100% limpa.
  6. Desinfectar a área periuretral com solução de iodo-povidona 10% usando um aplicador de algodão-ponta. Umedeça a agulha de inoculação / seringa, primeiro ponto, em que o lubrificante cirúrgico.
    NOTA: Povidine-iodo é usado para a implantação do cateter, o que é uma solução asséptica mais forte do que o álcool. Implantação do cateter requermais manipulação mecânica para inserir o cateter e, consequentemente, um maior potencial para a contaminação.
  7. Inserção do cateter dentro da abertura uretral. Uma vez dentro, use uma pinça para empurrar o (7 milímetros PE10) na direção da longa peça da bexiga, consequentemente empurrando a 5 mm (de silicone) pequeno cateter e depositá-lo no interior da bexiga. Remover a agulha, com o tubo 7 milímetros ainda ligado, imediatamente.

11. A inoculação bacteriana

  1. Siga o protocolo de inoculação bacteriana na seção 3, utilizando o inóculo preparado a partir da secção 9. Retire o mouse do cone do nariz e devolvê-lo à sua gaiola

12. Em cada ponto de sacrificar o tempo

  1. Prepare a 5 ml para tubos de bexiga e rim (para órgãos siga o passo 4.1) e 1,5 ml tubo de Eppendorf para cateteres. Adicionar 1 ml de PBS 1x em 1,5 ml tubo de Eppendorf para as amostras de cateter
  2. Siga os passos 4,3-4,5. Dissecar o mouse, a colheita da bexiga, rins e cateter, placing os tecidos independentemente em tubos de 5 mL contendo 1x PBS e o cateter na Eppendorf de 1,5 ml (ver passo 12.1).
    NOTA: Use diferentes tesoura para a dissecção externa e para a colheita de órgãos e recuperação cateter para minimizar a contaminação
  3. Em seguida, siga o passo 4.6.

13. bacteriana Recovery

  1. Para órgãos, siga os passos 5.1 e 5.2. Para a recuperação de bactérias a partir de cateteres, de vórtice à velocidade máxima durante 30 segundos, sonicar as amostras de cateter durante 5 min, utilizando um banho de ultra-sons, e depois vórtice à velocidade máxima durante mais 30 s.
  2. Fazer diluições em série 1:10 para 10 -8 e cada prato de diluição para CFU enumeração em placas de BHI. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite e conte as colônias no dia seguinte.

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Resultados

Os modelos intravesicais de simples e cateter UTI associado fornecer plataformas flexíveis para elucidar os mecanismos moleculares da patogênese bacteriana, o impacto destas doenças no tecido hospedeiro, e o desenvolvimento e teste de novas abordagens para gerenciar essas infecções comuns e dispendiosas. Dependendo da estirpe de ratinho e de agentes patogénicos, a inoculação intravesical pode ser utilizado para estudar interacções hospedeiro-agente patogénico para elucidar factores necessários para iniciar ou modular ag...

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Discussão

Comunidade descomplicada adquirida UTI é ​​uma infecção comum e onerosa respondendo por vários milhões de atendimentos ambulatoriais por ano 46. Além disso, Cautis são uma infecção adquirida saúde comum que tornou-se extremamente onerosa para os profissionais de saúde como os Centros de Serviços Medicare e Medicaid não reembolsa os prestadores para o custo adicional de tratamento resultante do hospital adquiriu CAUTI 45. Os modelos de ratinho de infecção do trato urinário, cistite, tanto simples e ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O financiamento para este trabalho foi fornecida por ORWH SCOR P50 DK064540, SR1 DK 051.406, SR1 AI 108.749-01, F32 DK 101.171, e F32 DK 104516-01.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material para preparação de cateter e agulha:
30 G agulhasBD Precision Glide30510630 G x ½ (0,3 mm x 13 mm)
Tubo de polietileno PE10BD427400Diâmetro interno -0,011 pol (0,28 mm); diâmetro externo - 0,024 pol (0,61 mm)
Tubo de silício curado com platina RenaSIL 025Braintree Scientific, IncSIL 025diâmetro interno-0,012 x diâmetro externo 0,025, bobina
Material para infecções:
Isoflourano – IsothesiaButler Schein29405250 ml
Kimble Chase5413289V 21
Infusor de Chá de Aço InoxidávelSchefs-AmazonPremium Loose Leaf Infuser Por Schefs - Aço Inoxidável - Grande Capacidade -
Bolas de algodão não estéreisFisherbrand22-456-880
50 ml Tubos FalconVWR89039-660
Isotec 3 -vaporizadorOhmeda1224478
Perfurador de orelhaFisher Scientific13-812-201(quando necessário)
Solução BetadineSolução10% Povidie-iodo solução tópica
Q-tipsFisher Scientific22-037-9246 polegadas
Fraldas para bancoFisherbrand14206 63Absorventes (20" X36"
Lubrificante cirúrgicoSurgilube0281-0205-36
Tesoura de dissecaçãoFerramentas Fine Science, INC14084-08
Micro-Adson ForcepsFine Science tools, INC11018-12
Seringa de 1 mlBD309659Ponta deslizante de tuberculina
ParafilmBemisPM9964 polegadas x 125 FT
Rack EppendorfFisherbrand05-541-1
Tubos EppendorfMIDSCIAVX-T-17-C
Coleta de cateteres, bexigas e rins:
HomogeneizadorPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
Tubo de fundo redondo de polipropileno de 5 mlBD352063para homogeneização de órgãos
Toalha de papelGeorgia-Pacific
EtanolPharmco-AAPER11100020S200 proof
Costar™ Placas de Poliestireno Transparente de 96 PoçosCorning3788
1x Fosfato de sódio salinoSigma-AldrichP3813
BRANSONIC Limpador ultrassônico 1210Branson Ultrasonics Corporation1210
Materiais IBC:
Placa de teste de cultura de tecidos de 6 poçosTechno Plastic Products92006
PinsFine Science Tools26002-20
Sylgard 184 DowCorning3097358-1004Kit de Elastômero de Silicone
X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosídeo)Invitrogen15520-034Ultrapure
N, N-DimetilformamidaSigma AldrichD4551
MgCl2 (cloreto de magnésio)Sigma AldrichM8266
Desoxicolato de sódioSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Octilfenolpoli (etilenoglicolether) n
Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado (K-ferrOcyanide)Sigma AldrichP3289
Hexacianoferrato de potássio (III) (K-ferrIcyanide)Sigma Aldrich60299
de 25 pés Frasco de Vidro Transparente de Betadine

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

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