Um protocolo para avaliar alterações nos níveis de dano ao DNA e na capacidade de reparo do DNA que podem ser induzidas por irradiação crônica in vivo de baixa dose em linfócitos do baço de camundongo, medindo a histona fosforilada H2AX, um marcador de quebras de fita dupla de DNA, usando citometria de fluxo é apresentado.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Exposição à radiação de dose baixa pode produzir uma variedade de efeitos biológicos, que são diferentes em quantidade e qualidade dos efeitos produzidos por doses elevadas de radiação. Abordar questões relacionadas com a segurança da saúde ambiental, ocupacional e público de uma forma adequada e cientificamente justificada depende fortemente a capacidade de medir com precisão os efeitos biológicos de poluentes doses baixas, como as substâncias químicas e radiação ionizante. Danos e reparação do ADN são os mais importantes indicadores precoces de riscos para a saúde devido às suas potenciais consequências a longo prazo, como o cancro. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar o efeito da crônica exposição in vivo a doses baixas de radiação β γ- e sobre os danos e reparação do ADN em células de baço de ratinho. Usando um marcador geralmente aceite de quebras de ADN de cadeia dupla, histona H2AX fosforilada chamado γH2AX, demonstramos como ele pode ser usado para avaliar não só os níveis de danos no DNA, mas também mudana capacidade de reparo do DNA potencialmente produzido por dose baixa em exposições in vivo. A citometria de fluxo permite a medição rápida, precisa e fiável de imunofluorescência marcado γH2AX em um grande número de amostras. ADN de cadeia dupla reparação de quebras pode ser avaliada por exposição esplenócitos extraídos a uma dose desafiadora de 2 Gy de produzir um número suficiente de ADN para provocar quebra reparação e medindo o induzido (1 h pós-irradiação) e danos no ADN residual (24 hrs pós-irradiação). Danos no ADN residual seria indicativo de reparação incompleta e o risco de instabilidade genómica longo prazo e cancro. Combinado com outros ensaios e de pontos finais que podem ser facilmente obtidos em tais estudos in vivo (por exemplo, as aberrações cromossômicas, freqüências de micronúcleos em reticulócitos de medula óssea, a expressão do gene, etc.), esta abordagem permite uma avaliação precisa e contextual dos efeitos biológicos estressores de baixo nível.
Introdução
Controvérsia significativa sobre os potenciais efeitos nocivos, tanto de doses baixas ou muito baixas de radiação e medo do público de radiação, impulsionado por imagens dos bombardeios atômicos de Hiroshima e Nagasaki e de acidentes em usinas nucleares raros ionizante (exacerbada pelos meios de comunicação de massa), tem levado a muito estrita regulação protecção contra as radiações e padrões que não são potencialmente justificada cientificamente. Nas últimas três décadas, numerosos relatórios têm documentado tanto a falta de nocivos e a presença de efeitos biológicos potencialmente benéficos induzidos pela baixa dose de radiação 1-4. O principal fator de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos de manuseio e tratamento do mouse devem aderir a regras estabelecidas pelos programas legislativo e / ou de cuidados de animais e aprovados por um comitê de cuidados com os animais local. Todos os métodos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care com a aprovação do comitê de cuidados com os animais local.
ATENÇÃO: Todos os trabalhos com radioatividade (incluindo, mas não limitado a manipulação do trítio, γ-irradiação externa, manipulação de tecidos animais, resíduos radioativos cama) devem aderir a regras estabelecidas pelas autoridades legislatura e / ou protecção contra as radiações e ser exe....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 2 mostra exemplos de citometria de fluxo gráficos esperados para os esplenócitos preparados utilizando o método descrito aqui. As células são primeiro fechado com base na gráfico de dispersão (Figura 2A e 2D, volume eletrônico é equivalente a dispersão para a frente). FL3 / propidium histogramas de iodo (Figura 2B e 2E) confirmar distribuição normal do ciclo celular. Sinal γH2AX calcu.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo apresentado neste artigo é útil para a realização de rato grande escala estudos in vivo que examinam os efeitos genotóxicos de baixos níveis de vários agentes químicos e físicos, incluindo a radiação ionizante. Nossa biotério livre de patógenos específicos único equipado com um irradiador Gammabeam 150 e um salão de 30 metros de comprimento irradiação permite a realização de estudos ao longo da vida que envolvem irradiações baixa ou muito baixa taxa de dose em centenas ou mesmo milhares de ratos. Pe.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes conhecidos.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a contribuição de nossos colegas Sandrine Roch-Lefevre e Eric Gregoire do Instituto de Radioproteção e Segurança Nuclear (Paris, França). Este trabalho foi apoiado pelo programa de Ciência e Tecnologia do Governo do Canadá nos Laboratórios Nucleares Canadenses (Chalk River, Ontário, Canadá), pelo Grupo de Proprietários CANDU (Toronto, Ontário, Canadá), pela Comissão Canadense de Segurança Nuclear e pelo Instituto de Radioproteção e Segurança Nuclear (Paris, França).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HTO: água tritiada, [3H] | obtida localmente de um reator nuclear | atividade de estoque 3,7 GBq/mL; pode ser substituído por HTO da Perkin Elmer | |
| OBT: Alanina, L-[3-3H]: trítio ligado organicamente (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glicina, [2-3H]: trítio ligado organicamente | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: trítio ligado organicamente (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| água tritiada, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substituto para HTO de origem local |
| O irradiador GammaBeam 150 | Atomic Energy of Canada Limited | fabricado localmente | pode ser substituído por outra fonte de radiação g de atividade suficientemente baixa |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 com L-Glutamina e HEPES 500mL |
| soro fetal bovino | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anticorpo anti-gH2AX, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 anticorpo anti-camundongo de cabra | Life Technologies (anteriormente Invitrogen) | A21121 | |
| iodo propídio | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| etanol | Álcoois Comerciais | P006-EAAN Garrafas de | 500 ml Etanol Absoluto |
| Tubos de 1,5 ml | de | microcentrífuga | Fisher Scientific |
| Tubos de 15 ml Tubos | centrífuga de polipropileno estéreis | Fisher Scientific | 05-539-5 |
| nitrogênio líquido | Linde | P110403 | |
| tubos de vidro sem tampa de 12 x 75 mm | Fisher Scientific | K60B1496126 | tubos de vidro borossilicato descartáveis com extremidade lisa |
| Frascos T25 | VWR | CA15708-120 | nunc tisue cultura Frasco de 25ml (fornecedor nº 156340) |
| Tesoura Fine Science Tools | 14068-12 | Tesoura Wagner 12 cm pinça afiada/afiada | |
| , reto | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken fórceps 13 cm, |
| fórceps reto, curvo | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern fórceps 12 cm, curvo |
| 60 mm placas de Petri | VWR | CA25382-100 | BD Falcon Placa de cultura de tecidos 60 x 15 mm |
| filtros de células, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Filtros de células Falcon 50/caixa |
| Receita PBS: 1 comprimido dissolvido em 200 ml de água deionizada, ajuste o pH para 7,4 se necessário. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Comprimidos de Solução Salina Tamponada com Fosfato |
| TBS receita: para fazer 10x estoque | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Cloridrato de Trizma |
| 88 g | NaCl Fisher Scientific | S271-500 | Cloreto de Sódio |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 Cloreto de | Potássio |
| Dissolva em 1 L de água deionizada, ajuste o pH para 7,4 |
Referências
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
