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Artigo de método

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

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DOI:

10.3791/52965

⸱

19 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, 2Third Xiangya Hospital and the Institute of Vascular Disease and Translational Medicine, Central South University

Neste artigo

Resumo

As células endoteliais vasculares desempenham um papel significativo em muitos distúrbios cardiovasculares importantes. Este artigo descreve um método simples para isolar e expandir as células endoteliais da aorta do camundongo sem o uso de nenhum equipamento especial. Nosso protocolo fornece um meio eficaz de identificar mecanismos na fisiopatologia das células endoteliais.

Resumo

O endotélio vascular é essencial para a homeostase vascular normal. Sua disfunção participa de vários distúrbios cardiovasculares. O camundongo é um modelo importante para a pesquisa de doenças cardiovasculares. Este estudo demonstra um método simples para isolar e cultivar células endoteliais da aorta de camundongo sem nenhum equipamento especial. Para isolar as células endoteliais, a aorta torácica é rapidamente removida do corpo do camundongo e o tecido adiposo e o tecido conjuntivo aderidos são removidos da aorta. A aorta é cortada em anéis de 1 mm. Cada anel aórtico é aberto e semeado em uma matriz reduzida do fator de crescimento com o endotélio voltado para baixo. Os segmentos são cultivados em meio de crescimento de células endoteliais por cerca de 4 dias. A brotação endotelial começa já no dia 2. Os segmentos são então removidos e as células são cultivadas continuamente até atingirem a confluência. As células endoteliais são colhidas usando proteinase neutra e cultivadas em meio de crescimento de células endoteliais por mais duas passagens antes de serem usadas para experimentos. A coloração por imunofluorescência indicou que, após a segunda passagem, a maioria das células foi duplamente positiva para captação de Dil-ac-LDL, ligação à lectina e coloração de CD31, características típicas das células endoteliais. Sugere-se que as células da segunda à terceira passagem sejam adequadas para experimentos in vitro e in vivo para estudar a biologia endotelial. Nosso protocolo fornece um meio eficaz de identificar mecanismos celulares e moleculares específicos na fisiopatologia das células endoteliais.

Introdução

O endotélio vascular é não só uma camada de barreira que separa o sangue e os tecidos, considera-se um grande glândula endócrina que se estende ao longo de toda a árvore vascular com uma área de superfície de 400 metros quadrados 1. O bem-estar do endotélio é essencial para a homeostase vascular. O endotélio disfuncional participa em várias desordens cardiovasculares, incluindo a aterosclerose, vasculite e a lesão de isquemia / reperfusão, etc. 2-4. Até à data, os mecanismos celulares e moleculares específicos envolvidos nestas configurações de doença não são bem compreendidos, devido à natureza anatómica difusa de endotélio.

O rato é um modelo importante para a pesquisa porque as técnicas de manipulação genética são mais desenvolvidos em ratos do que em quaisquer outras espécies de mamíferos. No entanto, o isolamento de células endoteliais de aorta de murino primário é considerado particularmente difícil devido ao pequeno tamanho da aorta torna enzymatIC digestão do endotélio impraticável. Alguns relataram procedimentos para isolar e purificar ECs exigem 5-7.

O objetivo deste protocolo é a utilização de um método simples para isolar e expandir células endoteliais da aorta do rato sem o uso de qualquer equipamento especial. Neste protocolo, a aorta isolada de fresco é cortada em pequenos segmentos e semearam-se sobre uma matriz com o endotélio virada para baixo para permitir a germinação endotelial. Após segmentos são removidos, as células endoteliais são expandidos em forma favorecida do endotélio e está pronto para experimentos após dois ou três passagens. As vantagens do método descrito são as seguintes: 1) consideravelmente elevados números de células endoteliais são colhidas a partir de um único aorta; 2) a viabilidade das células é bem preservada; e 3) é necessário nenhum equipamento ou técnica especial. Ele fornece um meio eficaz de identificar mecanismos celulares e moleculares específicos na fisiopatologia das células endoteliais. Para aqueles que estão interessados ​​em estudar prcélulas endoteliais cultivadas imary de ambos os camundongos knock-out de genes, gene knock-in ratos, ou um modelo de doença murino, este protocolo é muito útil e fácil de praticar.

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Protocolo

1. Isolamento de aorta de ratinhos

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Wayne State University.

  1. Coloque o mouse na câmara de indução da máquina de anestesia. Defina o fluxo de isoflurano a 4% em conjunto com 25% de ar fresco e 75% de O 2. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (4% para indução, ± 1,0% para manutenção) em conjunto com 25% de ar fresco e 75% de O 2, por intermédio da câmara de indução seguida por um cone de nariz dedicado. NOTA: Anestesia com isoflurano pode ser entregue em 75% de ar, de oxigénio / 25% ou 100% em oxigénio.
  2. Verifique o mouse a cada 5 minutos até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada pitada tep).
  3. Aqui o rato para fora da câmara de indução e continuar a inalação de isoflurano que o cone do nariz dedicado que é ligado ao equipamento de anestesia. alternar aisoflurano fluir para 1% para manter a anestesia.
  4. Embora seja sob anestesia, coloque o mouse sobre um bloco de cirurgia, posicionadas em suas costas. Use fita de laboratório para proteger os membros.
  5. Use uma lâmpada de aquecimento para manter o rato quente. Mantenha a lâmpada em uma distância adequada do mouse para que o rato não vai mais ao calor.
  6. Pulveriza-se a caixa com 70% de etanol.
  7. Use tesouras de dissecação para abrir o abdómen da linha média, e expor a aorta abdominal. Abrir a cavidade torácica e expor o coração e os pulmões.
  8. Corte a aorta abdominal no meio com uma tesoura de dissecção para liberar o sangue.
  9. Encha uma seringa de 1 ml (com 25 g de agulhas) com 1 ml de PBS contendo 1.000 U / ml de heparina. Injectar PBS contendo 1.000 U / ml de heparina no ventrículo esquerdo e a aorta perfundir. Empurrar o coração e o pulmão com uma pinça com as grandes artérias para o lado direito dos ratinhos para expor a aorta torácica.
  10. remover rapidamente da aorta torácica utilizando micro-diforceps ssection e colocá-lo em 1x PBS gelado (estéril), em seguida, transportar o recipiente em uma capa de fluxo de ar laminar.
  11. Inserir uma seringa de 1 ml, equipado com 25 agulhas G em uma das extremidades da aorta, e lavar suavemente a aorta com PBS gelado para remover o sangue.
  12. Use uma pinça micro-dissecção para remover o máximo do tecido adiposo em anexo e pequenos vasos laterais possível.
  13. Imediatamente transferir a aorta para meio de crescimento endotelial.
  14. Corte a aorta em rodelas de 1 mm usando uma lâmina de bisturi estéril. Colheita aproximadamente 8 - 10 anéis por aorta.
  15. Abra cada anel aórtico usando um par de tesouras micro-dissecção.

2. As sementes dos segmentos da aorta em Matrix

  1. Quando não estiver em uso, mantenha a matriz reduzida do fator de crescimento em -20 ° C para evitar a solidificação. Coloque a matriz reduzida pelo factor de crescimento em 4 ° C, pelo menos durante a noite para permitir um descongelamento completo.
  2. Pré-arref ecimento de 6 poços de placa e pontas de pipeta para -20 ° C durante pelo menos10 min. Colocar a placa de 6 poços em gelo e um revestimento das cavidades da placa com 1 ml de matriz sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Colocar a placa num incubador de 37 ° C durante 20 min para permitir que a matriz se solidificar.
  3. Implantar as peças da aorta para a matriz solidificada usando uma pinça micro-dissecção estéreis. Coloque as peças lúmen de cabeça para baixo sobre a matriz, sem tocar no endotélio. Colocar 3 - 4 segmentos aórticos próximos uns dos outros na matriz.
  4. Adicionar meio de crescimento de células endoteliais apenas o suficiente para manter os segmentos molhado (~ 200 mL).
  5. Incubar a placa a 37 ° C sob 5% de CO2 durante 4 a 6 h. No final do dia, adicionar meio apenas suficiente para cobrir os segmentos aórticos.
  6. Observar o segmento da aorta sprouting periodicamente sob um microscópio de contraste de fase. Verifique o nível médio e crescimento celular a cada dia. Adicionar meio se necessário para manter segmentos da aorta cobertos.
  7. No dia 4 th, remova gentilmente o meio e retire a segmentos da aorta from a matriz, utilizando uma agulha estéril sem interromper as células endoteliais que crescem.
  8. Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais novo e permitir que as células endoteliais continuam a proliferar na matriz durante 2 - 3 dias.

3. Passaging inicial das células endoteliais da aorta do rato

  1. Revestimento de um novo frasco T12.5 com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min.
  2. Lavam-se as placas cuidadosamente com matriz estéril 37 ° C de PBS.
  3. Adicionar 2 ml de proteinase neutral (50 U / mL) para as placas de matriz e incubar à temperatura ambiente no balancim plataforma com agitação ocasional. Verifique as células em um microscópio de contraste de fase para garantir que a maioria das células são separadas.
  4. Adicionar 2 mL de D-Val para inactivar a proteinase neutro.
  5. Recolhe-se o sobrenadante cuidadosamente num tubo de centrífuga de 15 mL. Lava-se a placa com 2 ml de D-Val e recolher o sobrenadante.
  6. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min a RooTemperatura m.
  7. Re-suspender o sedimento de células em 4 ml de meio de crescimento de células endoteliais e placa no balão T12.5 revestidos com gelatina. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 h.
  8. Substituir o meio. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 até que eles são 85% - 90% confluentes.

4. Passaging das células de camundongo aórtica endoteliais

  1. Revestimento dois novos frascos T12.5 com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min. Pré-aqueça Tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, 0,02 EDTA em PBS) e PBS estéril a 37 ° C durante cerca de 15 min.
  2. Lavam-se as células cuidadosamente com estéril 37 ° C de PBS.
  3. Adicionar 0,5 mL de Tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, 0,02 EDTA em PBS) e incuba-se a 37 ° C durante ~ 1 min ou até que a maioria das células se virar.
  4. Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais para parar a digestão. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo dentro dos frascos de várias vezes. Se necessário, utilizar uma célularaspador para recolher as células.
  5. Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  6. Re-suspender o sedimento de células em 4 ml de meio de crescimento de células endoteliais e da placa em balões de 2 T12.5 revestidas com gelatina. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 h.
  7. Substituir o meio. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO2 até que eles são 85% - 90% confluentes.
  8. Use as células endoteliais da aorta de rato após 2 - 3 passagens.

5. Caracterização das células de camundongo aórtica endoteliais

  1. Re-placa das células.
    1. Bata de uma placa de 6 poços com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min. Lavar a placa com PBS.
    2. Pré-aqueça o Tripsina-EDTA e PBS estéril a 37 ° C durante cerca de 15 min.
    3. Lavam-se as células com PBS estéril 3 vezes. Adicionar 0,5 mL de Tripsina / EDTA para as células, incubar durante ~ 1 min a 37 ° C óR até que a maioria das células se virar.
    4. Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais para parar a digestão. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo dentro dos frascos de várias vezes. Se necessário, utilizar um raspador de células para recolher as células.
    5. Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    6. Descartar o sobrenadante, re-suspender as células em meio de crescimento de células endoteliais. Semear as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 3 x 10 5 / poço.
    7. Incubam-se as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que as células se fixem à superfície da cultura.
  2. Dil-ac-LDL captado e Ulex -lectin vinculativo.
    1. Armazenar o 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocianina marcado com perclorato de LDL acetilada (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Antes da coloração, descongelar Dil-ac-LDL em gelo. A solu estoque Dil-ac-LDLção é de 1 mg / mL. Armazenar a aglutinina marcado com FITC Ulex europaeus (Ulex -Lectin, 1 ug / mL) a 4 ° C. A solução Ulex -Lectin estoque é de 1 mg / mL. Loja Hoechst 33342 a 4 ° C. A 33342 solução de Hoechst é de 100 mcg / mL.
    2. Adicionar 10 ul de solução de estoque Dil-ac-LDL a 1 mL de meio de cultura para obter uma concentração final de 10 ug / mL.
    3. Antes da coloração, remover o meio velho e lavar as células em cada poço com o novo meio.
    4. Retire o novo meio e adicione o meio de coloração Dil-ac-LDL.
    5. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1 h.
    6. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
    7. Adicionar 1 ml de formol a 10% para fixar as células. Colocar a placa à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
    8. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes. Evite luz.
    9. Adicione 1 mL estéril 1x PBS que contém 10 ml de Ulex -Lectin.
    10. Incubar as células a temperatu quartore no escuro durante 1 h.
    11. Remover o Ulex-LECTINA por lavagem das células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
    12. Adicionar a Hoechst 33342 para concentração final de 1 ug / ml, incubar 10 min no escuro.
    13. Ver a fluorescência do Dil-ac-LDL (vermelho, comprimento de onda de excitação de 576 nm), Ulex -Lectin (verde, excitação comprimento de onda de 519 nm) e Hoechst (azul, excitação comprimento de onda de 361 nm) com um microscópio de fluorescência invertido.
  3. coloração fluorescente para CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina e calponina.
    1. Loja anticorpo anti-ratinho CD31 conjugado com FITC, anticorpo eNOS, VE-caderina de anticorpo, anti-IgG de coelho conjugado com FITC, a 4 ° C no escuro. Loja anticorpo VEGFR2 em -20 ° C.
    2. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
    3. Adicionar 1 ml de formol a 10% para fixar as células. Colocar a placa à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
    4. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
    5. Para manchar CD31, adicione 1 mL de 1x estérilPBS que contém 10 ml de anticorpo CD31-FITC. Para manchar quer VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina, adicione 1 mL de estéril 1x PBS que contém 4 mL de VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina anticorpo primário, respectivamente.
    6. Incubar as células em gelo durante 1 h no escuro.
    7. Remover os anticorpos por lavagem das células com PBS estéril 3 vezes.
    8. Para a coloração de VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina, adicionar 1 ml de PBS estéril 1x que contém 10 ul de IgG anti-coelho conjugado com FITC. Incubar as células em gelo durante 1 h no escuro. Remover o IgG por lavagem das células com PBS estéril 3 vezes.
    9. Adicionar a Hoechst 33342 para concentração final de 1 ug / ml, incubar 10 min no escuro.
    10. Ver a fluorescência de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina, calponina (verde, comprimento de onda de excitação de 518-535 nm) e Hoechst (azul, comprimento de onda de excitação de 361 nm) com um microscópio de fluorescência invertido.

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Resultados

Sprouting celular endotelial

células endoteliais espontânea brotando iniciado a partir de um segmento do mouse aorta. O segmento de rato aorta foi deixada crescer numa matriz reduzida pelo factor de crescimento, em seguida, em meio de crescimento de células endoteliais durante 4 dias. O surgimento de células endoteliais normalmente aparece em 2 - 4 dias. As fotomicrografias foram tomadas no dia 4 (Figura 1). Como mostrado nas figuras, numerosas células endot...

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Discussão

Este estudo demonstra um método simples para isolar e endotelial cultura células de uma aorta mouse sem qualquer equipamento especial. A coloração por imunofluorescência indicou que a maioria das células eram células endoteliais após a segunda passagem. Sugere-se que as células na segunda para a terceira passagem são adequados para in vitro e in vivo para estudar a biologia endotelial.

As Notas-chave do Protocolo Present

Há cinc...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo é apoiado pelo American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 e pelo National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). Agradecemos a Roberto Mendez, da Wayne State University, por ajudar na preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos de 4 ou 6 semanasJackson Laboratory#000664
Estéril 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco#10010-023
Estéril 1x PBS contendo 1.000 U/mL de heparinaSigma AldrichH3149
Meio de crescimento de células endoteliais (Dulbeccos' Águia Modificada' s Medium [DMEM] com 25  mM HEPES [Gibco, # 12320-032], complementado com 100  μ g/mL de suplemento de crescimento de células endoteliais de tecido neural bovino [ECGS, Sigma, #2759], 10% de soro fetal bovino [FBS, Gibco, #10082-147], 1.000  U/mL de heparina [Sigma Aldrich, H3149], 10.000  U/mL de penicilina e 10  mg/mL de estreptomicina [Gibco, #15140-122])
Matriz reduzida por fator de crescimentoBD Biosciences356231
Proteinase neutra (Dispase, 1  U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) e meio D-Val (D-Valine, 0,034  g / L, Sigma, # 1255), em Dulbeccos ' Águia Modificada' s Médio, baixa glicose (Gibco, # 12320-032)
1,1'-dioctadecil-3,3,3', 3'- tetrametilindo-carbocianina LDL acetilada marcada com perclorato (Dil-ac-LDL)Life TechnologiesL3484
Aglutinina Ulex europaeus (Ulex-Lectina)SigmaL9006
Anticorpo conjugado CD31-FITC anti-camundongoBD Biosciences553372
Anticorpo anticorpo anticorpo do receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascularSinalização9698
Anti-óxido nítrico sintase endotelial endotelial de camundongoAbcamab5589
Anti-caderina endotélio vascular de camundongoAbcam33168
Calponina anti-camundongoAbcam700
Seringa anti-coelho conjugada com FITC IgGSigmaF6005
1 mL equipada com agulha 25-GFisher Scientific50-900-04222
100 mm PratosPeri Fisher Scientific07-202-516
Placas de cultura de células de seis poçosFisher Scientific08-772-1B
T12.5 frasco de culturaFisher Scientific50-202-076
Tesouras, pinças, tesouras e pinças de microdissecação, lâmina de bisturiFine Science Tools, Inc.
Máquina de anestesia com isofluranoWebster Veterianary Supply07-806-3204
lâmpada
Máquina
de contraste de fase invertido
de fluorescência invertida
do camundongo celular de aquecimentocentrífugaMicroscópio microscópio

Referências

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