Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.
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Artigo de método
Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Interacções ligando-receptor de membrana medeiam muitas funções celulares. Encadernação cinética e sinalização a jusante desencadeada por essas interações moleculares são provavelmente afectado pelo ambiente em que a ligação mecânica e sinalização ocorrem. Um estudo recente demonstrou que a força mecânica pode regular o reconhecimento do antigénio pelo desencadeamento e do receptor de células T (TCR). Isso foi possível graças a uma nova tecnologia que nós desenvolvemos e fluorescência denominadas sonda vigor biomembrana (fBFP), que combina força espectroscopia única molécula com microscopia de fluorescência. Usando um glóbulo vermelho humano ultra-suave como o sensor de força sensível, uma câmera de alta velocidade e em tempo real técnicas de rastreamento de imagens, o fBFP é de ~ 1 pN (10 -12 N), a 3 nm e ~ 0,5 ms em vigor, a resolução espacial e temporal. Com o fBFP, pode-se medir com precisão cinética de ligação ligando-receptor individuais no âmbito da regulamentação vigente e cal intracelular simultaneamente imagem ligação desencadeadaCium sinalização sobre uma única célula viva. Esta nova tecnologia pode ser utilizada para estudar a interacção receptor-ligando outra membrana e sinalização em outras células sob regulação mecânica.
Introdução
Célula-a-célula e célula-matriz extracelular de (ECM) adesão é mediada pela ligação entre os receptores da superfície celular, proteínas de ECM, e / ou lípidos 1. A ligação permite que as células de modo a formar uma estrutura funcional, bem como reconhecer, comunicar, e reagir ao ambiente 1-3. Ao contrário de proteínas solúveis (por exemplo, citoquinas e factores de crescimento) que se ligam de uma imagem tridimensional (3D) de fase fluida para os receptores da superfície celular, os receptores de adesão de células formar ligações com os seus ligandos através de uma das junções de hiato estreita para unir duas superfícies op....
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes da e foi aprovado pelo comitê de ética de pesquisa em humanos de Georgia Institute of Technology.
1. hemácias Humano Isolamento, Biotinilação e Ajuste osmolaridade
Nota: Passo 1.1 deve ser realizada por um profissional médico, como uma enfermeira treinada, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado.
- Obter 8-10 ul (uma gota) de sangue a partir de picada no dedo e adicionar a 1 mL do tampão de carbonato / bicarbonato (Tabela 1 e 2). Suavemente vortex ou pipetar a mistura e centrifugar durante 1 min a 900 x g. Elimine....
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Resultados
A técnica BFP foi iniciada pelo laboratório Evans em 1995 17. Esta ferramenta picoforce tem sido extensivamente utilizado para medir as interacções de proteínas imobilizadas em superfícies, de modo a analisar a cinética bidimensionais de moléculas de adesão que interage com os seus ligandos 16,19,20, 30, para medir a elasticidade molecular 21,29, e para determinar conformacional proteína muda 21. Para uma fBFP, um conjunto adicional de dispositivos relacionados-epi-fluorescênc.......
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Discussão
A experiência bem sucedida fBFP implica algumas considerações críticas. Em primeiro lugar, para o cálculo de força para ser confiável, micropipeta, a RBC, eo talão sonda deve ser alinhado como perto de coaxial possível. A projecção do RBC dentro da pipeta deve ser de cerca de um diâmetro de sonda de pipeta de modo que o atrito entre a RBC e a pipeta é negligenciável. Para um RBC humano típico, o diâmetro ideal pipeta é 2,0-2,4 mm, que produz um melhor ajuste da Equação 1 17,30. Em segundo lugar, para garantir.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa relacionada a este artigo e o desenvolvimento da tecnologia fBFP no laboratório Zhu foram apoiados por doações do NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 e TW008753. Agradecemos a Evan Evans por inventar esta ferramenta experimental empoderadora e aos membros do laboratório Evans, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong e Ken Halvorsen, por nos ajudarem a construir o BFP. Também agradecemos a outros membros do laboratório Zhu, Fang Kong, Chenghao Ge e Kaitao Li, por suas ajudas no desenvolvimento da instrumentação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fosfato de sódio monobásico monohidratado (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Preparação de tampão fosfato |
| Anhy. Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Preparação de tampão fosfato |
| Carbonato de sódio (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Preparação de tampão carbonato/bicarbonato |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonato/bicarbonato preparação do tampão |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% preparação do tampão |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% preparação do tampão |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% preparação do tampão |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% preparação do tampão |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Funcionalização do grânulo |
| Biotina-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Biotinilação de hemácias |
| Nistatina | Sigma-Aldrich | N6261 | Ajuste de osmolaridade de hemácias |
| Hidróxido de amônio (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Conta de vidro silanização |
| Metanol | BDH | 67-56-1 | Silanização de esferas de vidro |
| 30% Peróxido de hidrogênio (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Silanização de esferas de vidro |
| Ácido acético (glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Silanização de esferas de vidro |
| 3-Mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Funcionalização de esferas de vidro |
| Borosilicato | Distrilab | de partículas 9002 | Funcionalização de esferas de vidro |
| Streptavidin− Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Funcionalização de esferas de vidro |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Funcionalização de ligantes |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Carregamento de corante de fluorescência de cálcio intracelular |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Carregamento de corante de fluorescência de cálcio intracelular |
| Grânulos de PE Quantibrite | BD Biosciences | 340495 | Citômetro |
| de Densidade | BD Biosciences | BD LSR II | Quantificação |
| Densidade 0.7-1.0 mm x 30 polegadas | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipeta fazendo Micropipeta |
| Flamejante/Marrom Extrator | sutter instrumento P-97 | Micropipeta fazendo | |
| Pipeta microforce | Narishige | MF-900 | Micropipeta para fabricação de |
| Óleo Mineral | Fisher Scientific | BP2629-1 | Montagem da câmara |
| Vidro de cobertura do microscópio | Fisher Scientific | 12-544-G | |
| Micro-injetor World | Precision Instruments | MF34G-5 | Conjunto da câmara |
| Seringa de 1 ml | BD | 309602 | montagem da câmara |
| Suporte de micropipeta | Narishige | HI-7 Montagem da | câmara |
| Fabricações de peças mecânicas e adaptadores projetados em casa usando usinagem CNC. | Instrumento de Biofísica | Todas as peças são personalizadas de acordo com os projetos CAD. | Sistema BFP |
| Microscópio (TiE invertido) | Sistema Nikon | MEA53100 | BFP |
| Objetiva CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Sistema Nikon | MRH00401 | BFP |
| Câmera, GE680, 640 x 480, GigE, CCD de 1/3", mono | Graftek Imaging | 02-2020C | Sistema BFP |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP sistema |
| Sonda submicrônica manual com controle remoto de alta resolução | Karl Suss | PH400 | Sistema BFP |
| Mesa antivibração (5' x 3') | TMC | 77049089 | BFP sistema |
| 3D estágio de translação manual | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D software CAD | SOLIDWORKS Corp. | Versão 2012 SP5 | Sistema BFP |
| Software LabVIEW | National Instruments | Versão 2009 | Sistema BFP, programa BFP |
| Estágio translacional piezo 3D | Physik Instrumente | M-105.3P | Sistema BFP |
| Acumulador piezoelétrico linear | Physik Instrumente | P-753.1CD | Sistema BFP |
| Software | Versão 1.4 | Sistema fBFP, fluorescência programa de imagem | |
| Dual Cam (DC-2) | Sistema fotométrico | 77054724 | fBFP |
| Filtro de emissão Dual Cam (T565LPXR) | Sistema fotométrico | 77054725 | fBFP |
| Câmera de fluorescência | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | sistema fBFP |
| Filme plástico de parafina (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | vedação de garrafas |
| Carbonato/ tampão bicarbonato (pH 8,5) | 8,4 g/L de carbonato de sódio (Na2CO3), 10,6 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3) | ||
| Tampão fosfato (pH 6,5-6,8) | 27,6 g/L NaFosfato monobásico (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibásico (Na2HPO4) | ||
| N2-5% tampão (pH 7,2) | 20,77 g/L cloreto de potássio (KCl), 2,38 g/L de cloreto de sódio (NaCl), 0,13 g/L de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), 0,71 g/L anhy. fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4), 9,70 g/L de sacarose |
Referências
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J.
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Reimpressões e permissões
