Custom-made Microdiálise Probe projeto

Resumo

Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demand.In neste trabalho um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares.

Resumo

Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demanda para monitorar as mudanças fisiológicas, farmacológicas e patológicos no líquido cefalorraquidiano. Infelizmente, as sondas comerciais são caros para grupos de pesquisa em instituições públicas. Neste trabalho, um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares. A sonda de microdiálise consiste de uma membrana de polissulfona com um corte molecular de 30 kDa. Sonda in vitro recuperações de substâncias com peso molecular diferente (no intervalo de 100-1,600 Da) e diferentes propriedades físico-químicas são comparados. A sonda produz uma recuperação in vitro de aproximadamente 20% para o de glicose compostos pequenos, lactato, acetilcolina e ATP. In vitro recuperações para neuropeptídeos com um peso molecular entre 1,000-1,600 Da quantidade de 2-6%. Assim, enquanto o w molecular mais elevadooito dos neuropeptídeos reduzido em valores de recuperação in vitro, diálise de compostos na gama mais baixa (até 500 Da) de pesos moleculares não tem grande impacto sobre a taxa de recuperação in vitro. O presente método permite a utilização de uma membrana de diálise com o outro valor de cut-off e material de membrana. Portanto, este conjunto de sonda feitos por medida tem a vantagem de flexibilidade suficiente para dialisar substâncias em uma ampla gama de pesos moleculares. Aqui, nós apresentamos uma sonda de microdiálise com um comprimento de permuta de 2 mm, o que é aplicável para microdiálise no rato e regiões do cérebro de rato. No entanto, as dimensões da sonda pode ser facilmente adaptado para comprimentos maiores de câmbio para ser utilizado em animais maiores.

Introdução

Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Durante os últimos 50 anos, a técnica minimamente invasiva de microdiálise foi continuamente melhorado para se tornar um método bem estabelecido para monitorizar as concentrações locais de compostos de pequeno peso molecular, no espaço extracelular. Quase todos os tecidos fluidos intersticiais podem ser investigados em animais que se movem livremente.

Gaddum introduziu a técnica push-pull na década de 1960. Ele modificado a partir de uma abordagem Feldberg et al., Em que tubocurarina foi perfundido através de uma cânula terminando no ventrículo lateral e recolher o efluente também através de uma cânula ^1. Gaddum desenvolveu a técnica de push-pull, no qual uma cula que consiste em duas agulhas de aço concêntrico foi implantado em áreas distintas do cérebro e perfundidos por uma solução enquanto se remove simultaneamente os neurotransmissores libertados dos neurónios circundantes da ponta ^2. Infelizmente, dama tecidoGE causada pela cânula em torno da ponta limitado a aplicação do presente método. Como um outro avanço deste método, Bito e colaboradores introduziu um método do saco de diálise em que a solução recolhida foi separada a partir do tecido circundante por uma membrana de diálise. Eles implantaram um saco de diálise no tecido subcutâneo do pescoço do cão. O conteúdo do saco de diálise é livre de proteínas e podem ser analisadas várias semanas mais tarde por iões e aminoácidos ^3. O seguinte foi o desenvolvimento dialytrode, uma sonda de microdiálise primitiva, que foi originalmente descrito por Delgado em 1972 ^4. Finalmente, Ungerstedt e colegas melhorado a concepção de sonda de microdiálise, de modo que era menor e menos deslocadas tecido ^5.

Uma sonda de microdiálise concêntrica se comporta de forma semelhante a um capilar sangue. O sistema é constantemente perfundidos com uma solução com a composição iónica do fluido do tecido circundante, enquanto a falta de analito de interesse. ºe diálise de membrana exposta à solução externa ou tecido é semi-permeável. Ele permite a difusão passiva de substâncias para a sonda ao longo do seu gradiente de concentração ^6. A permeabilidade depende de muitas variáveis ​​tais como o peso molecular, forma, carga e pH do composto. Também é limitada devido às propriedades do material da membrana, o tamanho dos poros da membrana e taxa de fluxo de ^7.

As Figuras 1 e 2 mostram uma sonda de microdiálise concêntrica. O fluido de perfusão entra através de uma tubagem de admissão para dentro da manga de metal, que rodeia a sílica fundida. Dentro da luva de metal, ele flui para baixo ao longo da sílica fundida e deixa-o em sua ponta. No espaço entre a membrana de diálise e o politetrafluoroetileno (PTFE) -tubing (tal como teflon) o líquido de perfusão, em seguida, flui para cima. Aqui, a difusão de substâncias a partir do tecido ocorre, que cercam a membrana. O dialisado sai da sonda através da PTFE-tubagem, que está ligada à tomada tubagem e pode ser recolhido.

A técnica de microdiálise tem várias vantagens em relação ao outro em técnicas in vivo. A sonda constitui uma barreira física com o resultado de que o dialisado não contém enzimas ou células. Portanto, não há necessidade de purificação do eluato, antes da análise, e sem degradação enzimática de analitos ocorre. A degradação oxidativa pode ocorrer durante a passagem de analitos no tubo, mas muitas vezes isso pode ser evitado através da adição de um antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico) ao perfusato. Alternativamente, o dano oxidativo dos neuropeptídeos, por exemplo, foi suprimido de forma eficiente mediante a substituição do tubo de saída com uma ponta para recolher o dialisado ^8. O dialisado pode ser investigado diretamente com quase qualquer tipo de método analítico e vários analitos podem ser coletados simultaneamente. Este sistema pode ser utilizado em animais acordados, e quase todas as regiões do cérebro pode serexaminados. Além disso, a infusão de fármacos através da sonda é possível (retrodiálise). No entanto, também existem limitações da técnica de microdiálise. A resolução um pouco baixa vez não fornece informações em tempo real sobre as alterações de neurotransmissores. Porque é uma técnica invasiva, implantação sonda provoca trauma cirúrgico e anestésico, o que pode afetar as concentrações de neurotransmissores, é necessário durante esta etapa ^7,9,10.

A concentração do composto no dialisato compreende apenas uma pequena quantidade de composto de facto a concentração no fluido extracelular. Para o cálculo da concentração do composto desconhecido no fluido extracelular, recuperação relativa in vitro tem de ser calculada. Determinação da relação indivíduo em recuperações in vitro para cada sonda e cada composto é necessário antes de iniciar o experimento in vivo. Para este efeito, a sonda é mergulhado numa solução contendo oanalito de interesse ao passo que o líquido de perfusão é a mesma solução sem o analito de interesse. Após a determinação de concentrações de composto no dialisado, estes dados tem de ser encaminhado para a sua concentração no fluido circundante. In vitro determinações de recuperação de várias substâncias podem ser implementados simultaneamente ^9.

Muitos grupos de pesquisa neuroscience usar a técnica de microdiálise para investigar neurotransmissores e metabolitos no espaço extracelular de áreas distintas do cérebro. Assim, as sondas comerciais estão em grande demanda no ambiente de pesquisa em neurociência. Uma grande vantagem das sondas disponíveis comercialmente é a fiabilidade funcional alta. O set-up experimental para sondas comerciais está bem estabelecida e validada por muitos neurotransmissores e metabólitos bem conhecidos. No entanto, ao passo que o equipamento de microdiálise disponível comercialmente é caro e tem menos flexibilidade na aplicação ^11, no thtrabalhar é um conjunto de sonda de microdiálise é apresentado em pormenor, o qual pode ser adaptado para qualquer aplicação e pode ser fabricado por menos do que $ 10. Esta sonda feitos sob medida é uma sonda de microdiálise concêntrico testado para investigações em várias áreas do cérebro ^8.

Em recuperações sonda in vitro de substâncias com peso molecular diferente (gama de 100-1,600 Da) e com diferentes propriedades físico-químicas são comparados. A determinação in vitro de recuperação de glucose, lactato e acetilcolina com um peso molecular inferior a 200 Da, ATP com um peso molecular de cerca de 500 Da e da neuropeptídeos da angiotensina II, a substância P e de somatostatina com um peso molecular acima de 1.000 Da é realizada.

Protocolo

1. Preparando-PTFE tubing

1. Encurtar PTFE-tubulação em 2,5 centímetros peça. Use um papel escala para estimar as dimensões físicas. (Veja a Figura 3-A)
2. Corte um fim em um ângulo para facilitar a ligação da tubulação de saída. (Veja a Figura 3-A)
3. Roughen PTFE-tubagem através da utilização de papel de lixa para permitir a aderência da cola epóxi.

2. Preparar Fused Silica

1. Encurtar sílica fundida em 2,25 centímetros peça. (Veja a Figura 3-A)

3. Introduzir a Fused Silica no PTFE-tubulação

1. Inserir uma cânula de 30 L para a fibra de PTFE oco para perfurar a uma distância de 1 cm a partir da extremidade plana. Dobre o PTFE-tubo para simplificar o processo. (Veja a Figura 3b)
2. Insira a sílica fundida no PTFE-tubulação usando a cânula como orientação. (Ver Figura 3c)
3. Remova cuidadosamente a cânula e garantir a sílica fundida. (VejoFigura 3d)
4. A sílica fundida é suposto projecto de 5 mm na extremidade plana. (Veja a Figura 3e)
5. Cole a sílica fundida no local no local da punção por cola de cianoacrilato e deixe-a endurecer durante a noite. (Veja a Figura 3e)

4. Preparar Epoxy Glue (Cola de dois componentes)

1. Adicionar 30 partes de endurecedor amarela para 70 partes de cola epóxi preta com a ajuda de uma agulha fina e misture delicadamente. É diretamente pronto para usar.

5. A aplicação da membrana (Todos os Outros etapas devem ser executadas sob o microscópio e um Livro Scale é usado para estimar Dimensões físicas)

1. Puxe a membrana de polissulfona com cuidado sobre a sílica fundida, em seguida, puxe a membrana para o PTFE-tubo e ajustar a membrana para 5,5 mm, utilizando um bisturi afiado. (Veja a Figura 3-F)
2. Definir um ponto de marcação sobre a membrana com uma multa caneta para definir a duração troca de dois milímetrosa partir da extremidade da membrana.
3. Aplicar uma pequena quantidade de cola epóxi para cobrir a ponta da membrana com a ajuda de uma agulha fina. (Veja a Figura 3 g)
4. Feche o conjunto entre membrana de diálise e fibra de PTFE com a ajuda da mesma agulha fina usada na etapa 5.3) com a cola epóxi. (Veja a Figura 3 g)
5. Adicionar cola epóxi suficiente na membrana para cima para o ponto de marcação para assegurar um comprimento de troca de 2 mm. Permita que ele se endurecer durante a noite. (Ver Figura 3G) antes da determinação do comprimento de câmbio, a membrana é de 5,5 mm. Depois de aplicar a cola epoxi sobre a membrana, apenas 2 mm da membrana está disponível para difusão.

6. Aplicação da manga metálica

1. Corte uma agulha de 25 G em um centímetro peças luva de metal com a ajuda de um alicate de flexão.
2. Puxar a 1 centímetro manga metálica (25 G) para a parte restante da sílica fundida. A manga de metal posterior permite a ligação do tubo de entrada com o MICRODIAsonda lise. (Veja a Figura 3h)
3. Selar conjunta entre a manga de metal e PTFE-tubulação com a cola epóxi restante. Permita que ele se endurecer por pelo menos 24 horas. (Veja a Figura 3i)
4. Aplicando a cola quente em torno da bifurcação da sonda para a fixação e estabilização adicional.
   NOTA: O volume interno entrada da sonda é de 0,045 mL e o volume interno de saída é de 2,5 mL. Portanto, com uma taxa de fluxo de 1 mL / min, leva-se a cerca de 2,5 minutos depois de ligar o tubo de entrada para iniciar a recolha do dialisado. Com o presente protocolo, o procedimento de montagem da sonda produz sondas de microdiálise que são 95% de confiança.

7. realização de experimentos in vitro de recuperação

1. Mergulhar a sonda com um cut-off de 30 kDa e um comprimento de permuta de 2 mm dentro de uma solução de reserva de composto aCSF contendo 1 mM de glucose e 1 mM de lactato e, numa experiência em separado, em um LCR contendo 100nM de ATP e 100 nM de acetilcolina.
2. Perfundir as sondas com aCSF. Ajustar a taxa de fluxo de 1 mL / min e levar a cabo as experiências à temperatura ambiente (22 ° C). Permitir que as sondas a equilibrar durante 1 h na solução de reserva, e recolher as amostras a cada 30 minutos depois, e armazenar a -80 ° C até à medição.
3. Para o cálculo da recuperação in vitro, comparar as concentrações de analitos nos dialisados ​​com as concentrações conhecidas de analito na solução estoque. Expresse resultados como porcentagens de concentração da substância em dialysate vs. solução estoque.

Resultados

A sonda de microdiálise concêntrico feito por medida é constituído por uma membrana de polissulfona com um corte molecular de 30 kDa. O conjunto de sonda é ilustrado na Figura 3.

Ele exibiu uma recuperação in vitro para a glicose metabolitos pequena de energia (180,16 Da) e lactato (112,06 Da) de 19,10 ± 1,2% e 21,2 ± 1,6%, respectivamente. Para a acetilcolina carregado positivamente com um peso molecular de 181,66 Da, que mostrou um valor em recuperação

Discussão

A Figura 3 mostra um conjunto de sonda exemplar. Dimensões de diâmetro interno e externo corretos têm de ser cuidadosamente observados no tubo (OD 1,6 milímetros; ID 350 mm), de sílica fundida (OD 105 mm; ID 40 mm) e membrana de diálise (OD 245 mm; ID 210 mm). É também importante para manter um espaço entre a membrana e de sílica fundida de (105 um) e entre a membrana e os tubos (105 mm), bem. Se os valores forem diferentes, a pressão na sonda pode subir e provocar o vazamento da membrana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cola epóxi	SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Alemanha
Sílica fundida ID 40 µ m OD 105 µ m	Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Alemanha	Art. Nº: 6.040105
Membrana de polissulfona (filtro de hemodiálise FX Cor Diax 600)	Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Alemanha	REF: F00001593
Cola de cianacrilato (plástico de supercola Pattex®)	Henkel AG&Co. KGaA, Dü sseldorf, Alemanha
Tubo de TEFLON 1.6 x 0.35 mm	SunChrom® GmbH, Friedberg, Alemanha	Art. No: 969-195.219
Bisturi (Pena® Lâmina cirúrgica nº 10)	pfm medical ag, colônia, Alemanha	Art. No: 07310
Microscópio	MEIJI Techno	Cânula EMZ-8TR
30 G x 11" (0.3 x 25 mm)  Sterican® Z	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha	REF: 9324500
Cânula de 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) 100 Sterican®	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha	REF: 9186166
Caneta fina (Stabilo point 88 fine 0.4)	Schwan-STABILO Schwanhä uß er GmbH & Co. KG	Art. Não: 88/36
Cola quente  (Bastões de cola ULTRA Power x 11 mm)	Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Alemanha	Art. Nº: 4007841046910
Lixa P60 230 x 280	Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, Alemanha	Número de catálogo: 2608605397