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Artigo de método

Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

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DOI:

10.3791/53099

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19 de outubro de 2015

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1Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University, 4Regional Center for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, 5Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic

Neste artigo

Resumo

A entrega celular direcionada é útil em uma variedade de aplicações biomédicas. O objetivo deste protocolo é usar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPION) para rotular células e, assim, permitir abordagens de direcionamento de células magnéticas para um alto grau de controle sobre a entrega e localização celular.

Resumo

Entrega direccionada de células e agentes terapêuticos beneficiaria uma vasta gama de aplicações biomédicas, concentrando-se o efeito terapêutico no sítio alvo, enquanto minimizam os efeitos deletérios para locais fora do alvo. Segmentação célula magnética é uma técnica de entrega eficiente, segura e simples. Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (spion) são biodegradáveis, biocompatíveis, e pode ser sujeita a endocitose nas células para as tornar sensível aos campos magnéticos. O processo de síntese envolve a criação de magnetite (Fe 3 O 4) nanopartículas seguido por emulsificação a alta velocidade para formar uma poli (ácido láctico-co-glicólico) revestimento (PLGA). Os SPIONs PLGA-magnetita são aproximadamente 120 nm de diâmetro incluindo a cerca de 10 nm núcleo de magnetita diâmetro. Quando colocado em meio de cultura, são naturalmente SPIONs endocitose pelas células e armazenadas como pequenos aglomerados dentro de endossomas citoplasmáticos. Estas partículas conferem massa magnético suficiente para as célulaspara permitir o direccionamento para dentro de campos magnéticos. Numerosos separação de células e aplicações de segmentação são ativadas por prestar diversos tipos de células que respondem a campos magnéticos. SPIONs ter uma variedade de outras aplicações biomédicas, incluindo também o uso como um agente de contraste para imagiologia médica, a entrega de drogas ou gene alvo, ensaios de diagnóstico e geração de hipertermia local para terapia de tumor ou tecido de solda.

Introdução

A entrega e captura direcionadas de células para locais específicos do corpo são desejáveis para uma variedade de aplicações biomédicas. A entrega de células-tronco neurais ao cérebro por ultrassom focalizado guiado por ressonância magnética foi proposta como uma possível opção de tratamento para doenças neurodegenerativas, lesão cerebral traumática e acidente vascular cerebral1. As células-tronco mesenquimais estão sendo estudadas por sua capacidade de fornecer drogas anticâncer aos tumores devido às suas propriedades naturais dos trópicos tumorais2,3. As células-tronco cardíacas têm sido entregues ao coração como um possível tratamento para o infarto do miocárdio4,5. Stents vasculares têm sido desenvolvidos com anticorpos CD34 para capturar células progenitorascirculantes6. Embora promissoras, essas abordagens de direcionamento celular apresentam desvantagens, incluindo falta de especificidade celular, retenção celular inconsistente e entrega de células fora do alvo.

O objetivo geral do método atual é permitir o direcionamento magnético de células para uma variedade de aplicações de entrega e classificação de células. O direcionamento magnético permite a entrega controlada de células específicas a um local-alvo específico com efeitos off-target mínimos7. Os campos magnéticos podem ser gerados por dispositivos implantados ou externos para direcionar com segurança o movimento de células marcadas magneticamente dentro do corpo8. Numerosos esforços de pesquisa se concentraram no direcionamento magnético de células-tronco para tecidos lesionados, como coração9-14, retina15, pulmão16, pele17, medula espinhal18,19, osso20, fígado21 e músculo22,23, a fim de melhorar os resultados da regeneração.

O direcionamento magnético de células também foi estudado extensivamente como um meio de endotelizar dispositivos cardiovasculares implantáveis. Um endotélio uniforme e completo fornece uma barreira entre o dispositivo e os elementos sanguíneos circulantes para mitigar a trombose e a inflamação. As células endoteliais podem ser entregues ao dispositivo antes da implantação ou através do sistema vascular após a implantação. Em ambos os casos, os campos magnéticos são usados para capturar células na superfície do dispositivo e reter as células quando submetidas ao estresse de cisalhamento gerado pelo sangue circulante. Os stents vasculares magnéticos24-27 e os enxertos vasculares28 foram fabricados e testados para esse fim.

O direcionamento de células magnéticas requer uma estratégia para rotular células com partículas portadoras magnéticas. Essas partículas podem ser ligadas à superfície das células por meio de anticorpos ou pares ligante/receptor ou podem ser endocitadas nas células. As nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (NOF) são biodegradáveis, biocompatíveis e prontamente endocitadas por uma variedade de tipos de células29. Essas partículas efetivamente tornam uma célula responsiva a campos magnéticos e são naturalmente degradadas ao longo do tempo. As SPIONs fornecem um meio direto e seguro de rotular magneticamente células em cultura para uma variedade de aplicações de direcionamento e classificação magnética. Um método para sintetizar SPIONs com um núcleo de magnetita (Fe3O4) e casca de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) é fornecido. Além disso, é fornecido um método para marcar células em cultura com SPIONs.

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Protocolo

1. Síntese de magnetita Gel

  1. Lave todos os vidros por meio de ácido clorídrico concentrado seguido por água desionizada seguido de álcool etílico. Deixar secar S / N, de preferência num forno de secagem.
    CUIDADO! ácido clorídrico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor; álcool etílico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal.
  2. Utilize uma garrafa Dreschel para de-gás 500 ml de H2O desionizada fazendo borbulhar suavemente N2 gasoso durante 30 minutos.
  3. Set-up do aparelho síntese magnetita dentro de um exaustor química.
    1. Coloque um frasco de fundo redondo ml com três gargalo de 500 dentro de um aquecedor de manta de aquecimento e garantir o centro pescoço usando uma pinça e stand.
    2. Instalar um septo de borracha em uma das gargantas laterais do balão de fundo redondo e condensador de refluxo com um septo de borracha para dentro do gargalo lado restante. Continuamente correr água fria através do condensador de refluxo.
    3. Punção the septo de borracha do balão de fundo redondo com uma agulha conectada a uma linha de gás N2 e punção septo de borracha do condensador de refluxo com uma agulha conectada a uma linha de gás que funciona a um borbulhador (isto é, a garrafa com água) para visualizar saída de gás.
    4. Instalar uma pá lâmina no centro do pescoço do frasco de fundo redondo através de um adaptador de remo. Encaixar o eixo da pá de lâmina para um agitador de topo montado sobre um suporte.
  4. Purgar o balão de fundo redondo com gás N2 e deixar N 2 gás que flui a uma taxa baixa mas detectável.
  5. Remover o condensador de refluxo a partir do balão de fundo redondo e adicionar 1,000 g de ferro (III), cloreto de 0,6125 g de ferro (II) tetra-hidrato de cloreto, e 50 ml de desgaseificado H2O
    CUIDADO! de ferro (III) e ferro (II) tetra-cloreto são prejudiciais - usar equipamento de protecção pessoal.
  6. Substituir o condensador de refluxo e agita-se a 1.000 rpm, enquanto se aquecia a 50° C. A agitação sob estas condições produz nanopartículas de magnetite 10 nm de diâmetro.
  7. Uma vez a 50 ° C, adiciona-se 10 ml de solução de hidróxido de amónio a 28% por injecção através do septo de borracha no frasco de fundo redondo, enquanto ainda se agitava.
    CUIDADO! hidróxido de amônio é nocivo - usar equipamento de protecção pessoal.
    NOTA: A solução de hidróxido de amónio é usado para precipitar a magnetite e a solução deve ficar preto.
  8. Remover o septo de borracha e N2 linha de gás a partir do balão de calor e de fundo redondo a 90 ° C para evaporar o amoníaco gasoso, enquanto ainda se agitava.
    NOTA: É opcional para manter o fluxo de N 2 para o balão de fundo redondo através da perfuração do septo de borracha do condensador de refluxo, no entanto, a oxidação da magnetite de maghemite é insignificante durante este passo.
  9. Uma vez a 90 ° C, adiciona-se 1 ml de ácido oleico para o balão de fundo redondo, enquanto ainda se agitava. O ácido oleico é utilizado para revestir a magnetita ndnoparticles para formar gel de magnetite.
    CUIDADO! ácido oleico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal.
  10. Substituir o septo de borracha e N2 linha de gás para o balão de fundo redondo e remover o condensador de refluxo.
  11. Desligue o fogo e mexa a 500 rpm durante 2 horas.
  12. Retirar o frasco de fundo redondo a partir da manta de aquecimento do aquecedor e decanta-se o líquido restante, enquanto utilizando um íman forte realizada contra o fundo do frasco para reter o gel de magnetite.
    CUIDADO! lidar com a forte ímã com extremo cuidado para evitar danos ou ferimentos.
  13. Permitir que a O gel de magnetite seco ao ar / N (opcional).

2. Purificação de magnetita Gel

  1. Adicionar 40 ml de hexano para o balão de fundo redondo para dissolver o gel de magnetite
    CUIDADO! hexano é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor.
  2. Utilizar um funil separador com 40 ml de desgaseificado H2O residual para remover H 2 O frosou a solução magnetite.
    1. Lentamente, deitar a solução de magnetite na H2O no funil de separação e agitar suavemente o líquido de duas fases, durante 5 minutos.
    2. Escorra e descarte a fração aquosa inferior.
    3. Adiciona-se lentamente 40 ml de desgaseificado H2O ao funil de separação de tal modo que se estabelece em baixo da solução de magnetite e agitar suavemente e drenar como antes.
    4. Repetir a lavagem para uma terceira vez.
  3. Transferir solução magnetita para um Erlenmeyer, adicione algumas espátulas no valor de sulfato de sódio anidro, e agite para remover qualquer remanescente residual H 2 O a partir da solução de magnetita.
  4. Filtrar a solução através de papel de filtro de magnetite 1 uM num funil de filtro para remover o sulfato de sódio residual e H 2 O.
    NOTA: É recomendável assistência de vácuo.
  5. Transferir a solução para um balão de magnetite evaporação de 50 ml e usar um evaporador rotativo, para evaporar o hexano durante2 h, com as seguintes condições: velocidade de rotação moderado, vácuo aplicado, evaporando balão num banho de água a 50 C ° e 24 ° C de circulação de água através do condensador.
    NOTA: Opcionalmente, armazenar o gel magnetite antes do revestimento com PLGA.

3. Revestimento de magnetita com nanopartículas PLGA Shell

  1. Dissolve-se 3,60 g de PLGA (75/25 mistura) em 240 ml de acetato de etilo, para se criar uma (m / v) de solução de 1,5%. CUIDADO: acetato de etilo é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor.
  2. Dissolve-se 25,00 g de Pluronic F-127 em 500 ml de-gaseados de H2O utilizando um agitador magnético para criar um (m / v) de solução de 5.0%.
    NOTA: o Pluronic F-127 é um copolímero em bloco anfifílico não iónico que actua como um tensioactivo biocompatível. Ele ajuda a estabilizar a emulsão de óleo-em-água no passo 3.3.2.
  3. Usando um microspatula, recolher o gel de magnetita em seis 0,040 g alíquotas dentro de frascos de vidro ponderadas. Perform o seguinte processo de revestimento e de lavagem para cada alíquota.
    NOTA: As alíquotas são necessárias para garantir uma gestão eficiente e decantação magnética, que irá maximizar a pureza e rendimento, minimizando a degradação antes da liofilização na etapa 4.
    1. Adicionar uma alíquota de 0,040 g de gel de magnetite e 40 ml da solução de PLGA a um copo de plástico e sonicado num aparelho de limpeza de ultra-sons durante 10 minutos.
    2. Adicionar 80 ml da solução de Pluronic para o copo de plástico e emulsionar imediatamente com um misturador de laboratório para o nível mais alto durante 7 minutos para formar o revestimento de PLGA em que as nanopartículas de magnetite preparada como uma emulsão de óleo-em-água.
    3. Imediatamente diluir a solução spion em 1 L de H2O desionizada e sonicado durante 1 h numa hote química para evaporar o acetato de etilo.
    4. Coloque um ímã forte ao lado da solução spion e mexa delicadamente para coletar SPIONs acastanhadas no ímã.
      NOTA: Pode ser necessário agitar de forma intermitente durante várias horass antes de a solução torna-se esbranquiçada indicando que a maioria das SPIONs foram recolhidos.
    5. Decantar a solução aquosa, mantendo as SPIONs no copo com o ímã.
    6. Lavar as SPIONs três vezes como se segue.
      1. Suspender os SPIONs em 1 L de H 2 O. desionizada
      2. Sonicar a solução spion por 20 minutos.
      3. Coloque um ímã forte ao lado da solução spion e mexa delicadamente para coletar SPIONs acastanhadas no ímã. Pode ser necessário agitar intermitentemente durante várias horas antes de a solução se tornar clara, indicando que a maioria das SPIONs foram recolhidos.
      4. Decantar a solução aquosa, mantendo as SPIONs no copo com o ímã.
  4. Recolher os SPIONs sintetizados a partir de cada um dos seis alíquotas de gel de magnetite em um único frasco de vidro ponderado, tal como uma suspensão aquosa. Opcionalmente decantar o excesso de água magneticamente, conforme necessário.

4. Congelamento-drying de SPIONs

  1. Congelar a solução spion.
  2. Liofilizar a solução spion O / N em um liofilizador.
  3. Pesar os SPIONs liofilizados. SPIONs liofilizados podem ser armazenados à temperatura de -20 ° C até ser usado para a marcação de células.
    NOTA: O armazenamento a -20 ° C, reduz drasticamente cinética de degradação e aumenta a vida de prateleira.

5. Rotulagem de células com SPIONs

  1. Suspende-se uma alíquota de SPIONs em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 40 mg / ml e sonicar durante 30 min.
  2. Adicionar a solução para um balão spion quase confluente de células a uma concentração de 5 ul / ml de meio de cultura celular. Assegurar uma distribuição uniforme por balançando suavemente o frasco.
  3. Incubam-se as células durante 16 horas a 37 ° C.
  4. Suavemente aspirar meio de cultura e lavar as células duas vezes com PBS.
  5. Coletar células magneticamente marcadas e usar para experimentos.
  6. Solução spion não utilizados podem ser armazenados a 4 ° C e deve ser nósed dentro de alguns meses. Sonicar durante 30 minutos antes de cada utilização.

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Resultados

Nanopartículas de magnetite são de aproximadamente 10 nm de diâmetro, como resultado da agitação de uma solução aquosa de ferro (III) e cloreto de ferro (II), cloreto de tetra-hidrato a 50 ° C e 1000 rpm (Figura 1). Estes resultados demonstram a síntese bem sucedida de nanopartículas de magnetite. É importante para verificar o tamanho e a forma de nanopartículas de magnetite tomadas a partir de uma pequena amostra do lote durante a tentativa para a síntese da primeira vez. A microscopia electrónica de t...

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Discussão

Tal como acontece com qualquer protocolo de síntese de nanopartículas, a pureza dos produtos químicos reagentes é crítico para a consecução SPIONs de alta qualidade que terão efeitos citotóxicos mínimas. É, portanto, importante para adquirir reagentes muito puros, incluindo o ácido oleico (≥99%), ferro (II) tetra-hidrato de cloreto de (≥99.99%), ferro (III), cloreto de (≥99.99%), acetato de etilo (qualidade para HPLC, ≥99.9% ), hexano (grau HPLC, ≥97.0%), hidróxido de amónio (≥99.99%), e sulfato de sódio (≥99.0%). É de ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem o financiamento do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional – FNUSA-CICV (nº. CZ.1.05 / 1.1.00 / 02.0123), o Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (AHA # 06-35185N) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH #T32HL007111).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de hidróxido de amônio, 28% NH3 em H2O, ≥ 99,99% de base de metal traçoSigma-Aldrich338818-100ML Reagente nocivo - use equipamento de proteção individual
Garrafa Dreschel, 500 mlAce Glass5516-16
Acetato de Etila, CHROMASOLVR Plus, para HPLC, 99,9% Sigma-Aldrich650528-1LReagente nocivo - use equipamento de proteção individual e trabalhe em capela
Álcool etílicoSigma-AldrichE7023Reagente nocivo - use equipamento de proteção individual
Frasco de evaporação, 50 ml, junta 24/40Sigma-AldrichZ515558Para uso com rotoevaporador
Papel de filtro, 3 cm de diâmetro, grau 1Fisher09-805PPara uso com funil de filtro de vidro
Copos de vidro, 1 LFisherFB-101-1000Para lavagem de ESCORAS
Funil de filtro de vidro, adaptador de mangueira de vácuo, se encaixa 24/40, 30 mLFisherK954100-0344 
Tampas de frascos de vidroFisher03-391-46Para uso com frascos de vidro
Frascos de vidro, 2 mlFisher03-391-44Para coletar gel de magnetita e SPIONs
Hexano, CHROMASOLVR, para HPLC, ≥ 97.0% (GC)Sigma-Aldrich34859-1L Reagente nocivo - use equipamento de proteção individual e trabalhe na hotte
Ácido clorídricoSigma-AldrichH1758Reagente nocivo - use equipamento de proteção individual e trabalhe na capela
de exaustão Cloreto de ferro (II) tetrahidratado, ≥ 99,99% de base de metais traços Sigma-Aldrich380024-5GReagente nocivo - use equipamento de proteção individual
Cloreto de ferro(III) anidro, pó, ≥ 99,99% de base de metais traçosSigma-Aldrich451649-1GReagente nocivo - use equipamento de proteção individual
Aquecedor Isomantle, 500 mLVoight GlobalEM0500/CEX1
Misturador de laboratórioSilversonL5M-A
LiofilizadorLabconco7670520
MicroespátulasFisher21-401-25APara transferência de magnetita ímã de gel
NdFeB, 1 in x 1 in x 1 inAmazing MagnetsC1000H-MÍmã muito forte, manuseie com cuidado
Ácido oleico, ≥ 99% (GC)Sigma-AldrichO1008-5G Armazenar no freezer; Reagente nocivo - use equipamento de proteção individual
Agitador suspensoIKA2572201
Pinça do agitador suspensoIKA2664000Para uso com agitador suspenso
Agitador suspenso Suporte HIKA1412000Para uso com agitador suspenso
Solução salina tamponada com fosfatoLife Technologies10010-023
Copos de plástico, 250 mlFisher02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (mistura 75/25)PuracPDLG 7502PDLG 7502A também pode ser usado; Armazene no freezer
o pó Pluronic F-127, BioReagent, adequado para cultura de célulasSigma-AldrichP2443-250G 
Pá de lâmina expansível de PTFE, 8 mm de diâmetroAdaptador de vaso deSciQuip SP4018
, se encaixa em pá de 24/40, 8 mm de diâmetroAdaptador de Vaso de PTFE A480Monmouth ScientificPara uso com pá de lâmina expansível de PTFE
Resfriador de recirculaçãoClarkson696613Para uso com rotoevaporador
Condensador de refluxo, se encaixa em 24/40, 250 mmAce Glass5997-133
RotoevaporadorClarkson216949
Septos de borracha, se encaixa 24/40Ace Glass9096-56
Funil separatório com rolha, 250 mlFisher10-438E
Sulfato de sódio ACS reagente, ≥ 99,0%, anidro, granularSigma-Aldrich239313-500G 
Balão de fundo redondo de três pescoços, angular, 24/40 juntas, 500 mlAce Glass6948-16
Limpador ultrassônico bandeja perfuradaFisher15-335-20APara uso com limpador ultrassônico
Limpador ultrassônico, 2,8 LFisher15-335-20
Controlador de vácuoClarkson216639Para uso com rotoevaporador (opcional)
Vácuo bombaClarkson219959Para uso com rotoevaporador
PTFE da

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