Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

तरीके बैक्टीरियल Pyomelanin उत्पादन रोकना और ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता में इसी वृद्धि निर्धारित करने के लिए

Published: August 31, 2015 doi: 10.3791/53105
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

Protocol

संस्कृति, मीडिया, एंटीबायोटिक दवाओं के 1. तैयारी, और 2- [2-नाइट्रो-4- (trifluoromethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexanedione (NTBC)

  1. उचित मात्रा में लेग शोरबा (1% tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 0.25% सोडियम क्लोराइड एच 2 ओ में) और विभाज्य बनाओ। आटोक्लेव द्वारा जीवाणुरहित। कमरे के तापमान पर रखो।
  2. 100 मिलीलीटर लेग अगर (1% tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 0.25% सोडियम क्लोराइड, एच 2 ओ में 1.5% अगर) 250 मिलीलीटर बोतल में बनाओ। कमरे के तापमान पर आटोक्लेव और दुकान से जीवाणुरहित। अगर प्लेट में गिरने से पहले पिघल रहा है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: 4 प्लेटों निकलेगा लेग अगर की 100 मिलीग्राम से युक्त बोतल। लेग अगर की राशि परख के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या के अनुरूप बदला जा सकता है।
  3. (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 2 मिमी के.एच. 2 4 पीओ) 16 पीबीएस बनाओ। कमरे के तापमान पर आटोक्लेव या निस्पंदन और दुकान से जीवाणुरहित।
  4. जेंटामाइसिन के लिए एंटीबायोटिक शेयर समाधान तैयार, केनामाइसिन, एकडी tobramycin।
    1. पी के लिए उचित एंटीबायोटिक शेयर सांद्रता तैयार 100 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, 30 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन, और 10 मिलीग्राम / एमएल tobramycin युक्त aeruginosa उपभेदों। 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी, फिल्टर बाँझ (0.2 माइक्रोन), और दुकान में एंटीबायोटिक दवाओं भंग। अध्ययन किया जीवाणु के आधार पर एंटीबायोटिक दवाओं और सांद्रता में परिवर्तन।
  5. NTBC स्टॉक समाधान तैयार करें। DMSO के 400 μl में NTBC के 10 मिलीग्राम भंग। यह 75.9 मिमी NTBC की एकाग्रता पैदावार। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर NTBC स्टॉक समाधान। कमरे के तापमान पर पिघलना समाधान की जरूरत के रूप में।
    नोट: NTBC के विभिन्न स्रोतों घुलनशीलता में मतभेद हैं। निर्माता की सिफारिशों के आधार पर NTBC भंग करने और 1.5 चरण अनुसार समायोजित करने में जो उचित वाहन का निर्धारण करते हैं।

2. जीवाणु उपभेदों के NTBC अनुमापन

  1. स्ट्रेन के सेट अप रात भर संस्कृतियों परीक्षण किया जाना है। 2 मिलीलीटर लेग शोरबा के लिए 16 x 150 मिमी टेस्ट ट्यूब जोड़ेंएस (तनाव प्रति एक) और प्रत्येक तनाव से एक पृथक कॉलोनी के साथ टीका लगाना। एक हवाई इनक्यूबेटर में एक टिशू कल्चर रोटेटर पर वातन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. अगले दिन, लेग शोरबा में NTBC का अनुमापन तैयार करते हैं। विभिन्न प्रकारों NTBC के प्रति संवेदनशीलता में मतभेद हैं के बाद से 0 से 900 माइक्रोन NTBC के लिए एक प्रारंभिक सीमा का प्रयोग करें।
    1. तनाव के अनुसार 4 से 5 टेस्ट ट्यूब (16 x 150 मिमी) के लिए 1 मिलीलीटर लेग शोरबा जोड़ें।
    2. सांद्रता की एक श्रृंखला में टेस्ट ट्यूब (16 x 150 मिमी) को NTBC शेयर समाधान (75.9 मिमी) जोड़ें। लेग शोरबा के 1 मिलीलीटर में जोड़ने के लिए NTBC सांद्रता और इसी शेयर संस्करणों के लिए 1 टेबल देखें।
  3. रात भर संस्कृतियों के 600 आयुध डिपो उपाय। मीडिया में मौजूद pyomelanin को समाप्त करने के आयुध डिपो 600 रीडिंग लेने से पहले संस्कृतियों धो लें।
    1. 2 मिनट के लिए 16,000 XG पर एक microcentrifuge में संस्कृति के 1 मिलीलीटर centrifuging द्वारा संस्कृतियों धो लें। सतह पर तैरनेवाला और किसी भी शिथिल pelleted कोशिकाओं से निकालेंएक micropipettor और 1 मिलीलीटर लेग में ठोस सेल गोली resuspend
  4. आयुध डिपो के 600 0.05 पर अनुमापन नलियों टीका लगाना। नलियों टीका लगाना करने की जरूरत धोया संस्कृति की राशि की गणना।
    नोट: उपस्थित नहीं होना चाहिए pyomelanin के बाद से inoculations के लिए धोया संस्कृतियों का प्रयोग करें।
  5. वातन एक हवाई इनक्यूबेटर में एक टिशू कल्चर रोटेटर उपयोग करने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 24 घंटे के लिए अनुमापन ट्यूबों सेते हैं।
  6. अनुमापन नलियों फोटोग्राफ और एमआईसी और ऑक्सीडेटिव तनाव assays के लिए उपयोग करने के NTBC की राशि का निर्धारण करने के लिए भीतर और दबाव के बीच वर्णक उत्पादन की तुलना करें। सेल मुक्त संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में pyomelanin की राशि का निर्धारण करने के लिए और सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए आयुध डिपो 600 रीडिंग का प्रयोग करें।
    नोट: कोशिकाओं को संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में pyomelanin के आयुध डिपो 600 अनुपात NTBC साथ उपचार के बाद pyomelanin उत्पादन में मतभेद यों की गणना की जा सकती है।

3. एंटीबायोटिक न्यूनतम Inhibi96 अच्छी तरह से प्लेट्स में इतिहास एकाग्रता (एमआईसी) परख

  1. स्ट्रेन के सेट अप में रात भर संस्कृतियों के साथ और NTBC बिना पौंड में परीक्षण किया जाना है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल 300 माइक्रोन NTBC की प्रतिनिधि स्तर का उपयोग वर्णित है। प्रयोग की जाने वाली NTBC के उचित स्तर 2.6 चरण में चुना गया है।
    1. 2 मिलीलीटर पौंड के लिए 300 माइक्रोन NTBC जोड़ें कोई NTBC हालत के लिए 2 मिलीलीटर लेग के लिए वाहन (DMSO) के एक बराबर मात्रा में जोड़ें।
    2. बाँझ toothpicks का उपयोग करना, बैक्टीरिया से एक पृथक कॉलोनी के साथ ट्यूब टीका लगाना। NTBC साथ एक संस्कृति और प्रत्येक तनाव के लिए NTBC बिना एक संस्कृति की जाएगी। वातन एक हवाई इनक्यूबेटर में एक टिशू कल्चर रोटेटर उपयोग करने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. अगले दिन, एमआईसी परख की स्थापना के लिए पौंड + NTBC और पौंड + DMSO के मास्टर समाधान कर सकते हैं। Inoculum जोड़ा जाता है जब इस रूप में 600 माइक्रोन की एकाग्रता पर NTBC जोड़ें 300 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता से बेदखल दो गुना पतला हो जाएगा।
    1. एक antibi परीक्षण करने के लिएएक तनाव, 2 मिलीलीटर लेग करने के लिए 600 माइक्रोन NTBC जोड़ने और NTBC मास्टर समाधान बनाने के लिए मिश्रण के लिए कान का। 2 मिलीलीटर लेग के लिए वाहन (DMSO) के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और कोई NTBC मास्टर समाधान बनाने के लिए मिश्रण। एंटीबायोटिक शेयर समाधान बनाने के लिए और साथ ही 96 अच्छी तरह प्लेटों में कमजोर पड़ने श्रृंखला स्थापित करने के लिए इन समाधान का प्रयोग करें।
      नोट: मास्टर समाधान योगों pipetting त्रुटियों के लिए खाते में अतिरिक्त समाधान निकलेगा। परीक्षण किया एंटीबायोटिक दवाओं और दबाव की संख्या के आधार पर आवश्यक रूप में मास्टर समाधान ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है।
  3. पौंड + NTBC या पौंड + DMSO के मास्टर समाधान में एंटीबायोटिक समाधान तैयार करें।
    नोट: इन समाधानों में एंटीबायोटिक एकाग्रता डबल अंतिम वांछित एकाग्रता होनी चाहिए। पर्याप्त समाधान एक 96 अच्छी तरह से थाली में चार कुओं के लिए 100 μl हस्तांतरण करने के लिए बनाया जाना चाहिए।
    1. जेंटामाइसिन +/- 64 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में NTBC शेयर समाधान तैयार है। 450 जेंटामाइसिन शेयर की 0.288 μl (100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए, इस समाधान बनाने के लिएμl पौंड + NTBC या पौंड + DMSO के मास्टर समाधान।
      नोट: पी के लिए जेंटामाइसिन की अधिकतम एकाग्रता aeruginosa PAO1 32 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    2. केनामाइसिन +/- 256 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में NTBC शेयर समाधान करें। 450 μl पौंड + NTBC या पौंड + DMSO के मास्टर के समाधान के लिए केनामाइसिन शेयर की 3.84 μl (30 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए, इस समाधान बनाने के लिए।
      नोट: पी के लिए केनामाइसिन की अधिकतम एकाग्रता aeruginosa PAO1 128 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    3. Tobramycin +/- 8 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में NTBC शेयर समाधान तैयार है। इस समाधान बनाने के 450 μl पौंड + NTBC या पौंड + DMSO के मास्टर के समाधान के लिए tobramycin शेयर की 0.36 μl (10 मिलीग्राम / एमएल) को जोड़ने के लिए।
      नोट: पी के लिए aeruginosa PAO1, tobramycin की अधिकतम एकाग्रता 4 माइक्रोग्राम / एमएल है।
      नोट: बैक्टीरिया परीक्षण किया जा करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं और सांद्रता समायोजित किया जा सकता है।
  4. एक 96 अच्छी तरह से थाली में चार कुओं के लिए प्रत्येक 2x एंटीबायोटिक समाधान के 100 μl जोड़ें। Exampl के लिए पंक्ति ए में इन समाधान की जगहई, जेंटामाइसिन ए 4 के माध्यम से A1 में रखा जाना चाहिए, केनामाइसिन ए 8 के माध्यम से A5 में रखा जाना चाहिए, और tobramycin A12 के माध्यम से ए 9 में रखा जाना चाहिए। सेट अप एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक चित्र के लिए चित्रा 1 ए देखें।
    नोट: एकाधिक एंटीबायोटिक दवाओं के एक थाली में परीक्षण किया जा सकता है, लेकिन केवल एक ही तनाव अन्य तनाव से पार संदूषण के लिए संभावित को समाप्त करने के प्रति प्लेट परीक्षण किया जाना चाहिए।
  5. 96 अच्छी तरह से थाली के एच के माध्यम से पंक्तियों बी के लिए पौंड + NTBC या पौंड + DMSO के मास्टर समाधान के 50 μl जोड़ें। कि एक थाली सुनिश्चित पौंड + NTBC है और एक थाली पौंड + DMSO है। चित्रा 1 ए देखें।
    1. पौंड + NTBC में एंटीबायोटिक दवाओं के लिए पौंड + NTBC का प्रयोग करें। पौंड + DMSO में एंटीबायोटिक दवाओं के लिए पौंड + DMSO का प्रयोग करें।
  6. एक micropipettor pipet सुझावों को बदलने, बी मिक्स समाधान पंक्ति पंक्ति एक से समाधान के 50 μl हस्तांतरण से एंटीबायोटिक दवाओं के दो गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन का उपयोग करना, और पंक्ति बी से समाधान के 50 μl हस्तांतरण के लिए सी दोहराएँ पंक्ति remainiएनजी पंक्तियाँ। पंक्ति जी गिराए जाने के बाद, उस पंक्ति और त्यागने से समाधान के 50 μl हटा दें। बैक्टीरिया विकास के लिए एक नहीं, एंटीबायोटिक नियंत्रण के रूप में पंक्ति एच का प्रयोग करें। चित्रा 1 बी देखें।
    नोट: जी के माध्यम से हर अच्छी तरह पंक्तियों में एक अब 2X पर पौंड + NTBC या पौंड + DMSO में एंटीबायोटिक के 50 μl अंतिम वांछित एकाग्रता है। पंक्ति एच कोई एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग + NTBC या पौंड + DMSO में शामिल है।
  7. रात भर संस्कृतियों के 600 आयुध डिपो उपाय। मीडिया में मौजूद pyomelanin को समाप्त करने के आयुध डिपो 600 रीडिंग लेने से पहले सभी संस्कृतियों धो लें।
    1. 2 मिनट के लिए 16,000 XG पर एक microcentrifuge में संस्कृति के 1 मिलीलीटर centrifuging द्वारा संस्कृतियों धो लें। एक micropipettor साथ तैरनेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर लेग में सेल गोली resuspend
  8. लेग में 2.75x10 5 सीएफयू / एमएल के लिए रात भर संस्कृतियों पतला
    नोट: एक आयुध डिपो 600 यूनिट पी के लिए 1x10 9 सीएफयू / एमएल के बराबर है कि मान लें aeruginosa। सीएफयू / एमएल रूपांतरण के लिए आयुध डिपो घ हो सकता हैअन्य बैक्टीरिया में ifferent।
  9. उचित अच्छी तरह से करने के लिए पतला जीवाणु संस्कृति के 50 μl जोड़ें।
    नोट: NTBC में उगाया संस्कृतियों DMSO में उगाया NTBC और संस्कृतियों DMSO युक्त कुओं में जोड़ा जाना चाहिए युक्त कुओं में जोड़ा जाना चाहिए। चित्रा 1 बी देखें।
    1. प्रत्येक तनाव और एंटीबायोटिक एकाग्रता के लिए तीन कुओं के लिए बैक्टीरिया जोड़ें। जीवाणु संक्रमण के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए चौथे अच्छी तरह से करने के लिए लेग के 50 μl जोड़ें। चित्रा 1 बी देखें।
    2. कुओं टीका लगाना एक मल्टी चैनल micropipettor का प्रयोग करें। पड़ोसी कुओं के प्रदूषण को रोकने के लिए inoculum जोड़ने जब सुझावों के कुओं के तल के पास हैं कि pipet सुनिश्चित करें।
      नोट: कुओं के लिए जीवाणु संस्कृति को जोड़ने एंटीबायोटिक और NTBC सांद्रता दो गुना कमजोर होगी।
  10. Parafilm के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 24 घंटा सेते हैं। एक हवाई इनक्यूबेटर में, स्थिर रुप से 96 अच्छी तरह प्लेटें सेते हैं।
  11. जांच करनाकुओं में बैक्टीरिया विकास के लिए प्लेटें। एमआईसी कोई बैक्टीरिया विकास प्रत्येक तनाव के सभी तीन प्रतिकृति के लिए देखा जाता है, जिसमें एंटीबायोटिक की सबसे कम एकाग्रता है।
    1. दिखने में विकास के लिए प्लेट की जांच या 600 आयुध डिपो के लिए एक थाली पाठक सेट का उपयोग कर पढ़ा।

ऑक्सीडेटिव तनाव की प्रतिक्रिया के लिए 4. स्पॉट प्लेट परख

  1. 3.1 कदम के रूप में वर्णित स्ट्रेन के सेट अप रात भर संस्कृतियों NTBC साथ लेग में और बिना परीक्षण किया जाना है।
  2. अगले दिन, एक ऑक्सीडेटिव तनाव के रूप में एच 2 ओ 2 युक्त लेग अगर प्लेटें तैयार करते हैं। 0 से 1 मिमी घंटा की सीमा 2 ओ 2 सांद्रता एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
    1. लेग अगर बोतल पिघला। कमरे के तापमान पर लगभग 50 डिग्री सेल्सियस को शांत मीडिया।
    2. वांछित सांद्रता में ठंडा मीडिया के लिए सीधे ओ 2 एच 2 जोड़ें। भंवर बोतल मिश्रण करने के लिए। एच की सांद्रता के लिए 2 टेबल देखें 2 ओ 2और केंद्रित एच 2 ओ 2 की मात्रा जोड़ने के लिए। इन मूल्यों को लेग अगर के 100 मिलीलीटर के आधार पर कर रहे हैं।
    3. तुरंत बुलबुले को दूर करने के लिए एच 2 ओ 2 और लौ सतह जोड़ने के बाद प्लेटों डालो। उपज लेग अगर की 100 मिलीलीटर प्रति 4 प्लेटों है। एच 2 ओ 2 एकाग्रता के साथ प्लेटों के निशान।
    4. प्लेटों से अधिक नमी को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए चल प्रशंसक के साथ एक जैविक प्रवाह हुड में खुला प्लेटें प्लेस।
      नोट: प्लेटों वे तैयार कर रहे हैं एक ही दिन का प्रयोग करें। ऐसा करने में विफलता असंगत डेटा में हो सकता है।
      नोट: इस तरह के paraquat रूप ऑक्सीडेटिव तनाव इस परख में एच 2 ओ 2 के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अन्य ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता एच 2 ओ 2 के लिए इस्तेमाल की तुलना में अलग हो सकता है।
  3. धो और 3.7 चरण में वर्णित के रूप में आयुध डिपो रात भर संस्कृतियों के 600 मापने।
  4. सभी रात भर घन के आयुध डिपो 600 मानक के अनुसारस्ट्रेन के सेट के लिए न्यूनतम मूल्य को ltures का परीक्षण किया जा रहा है। पी aeruginosa आम तौर पर पौंड + NTBC या पौंड + DMSO में रातोंरात बड़े जब लगभग 2.5 के एक आयुध डिपो 600 है।
    1. 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा में सबसे कम 600 आयुध डिपो के लिए संस्कृति को कमजोर करने की जरूरत संस्कृति की मात्रा का निर्धारण करें। एक संस्कृति एक आयुध डिपो 3 के 600 और दबाव के सेट के लिए सबसे कम 600 आयुध डिपो है अगर उदाहरण के लिए, 2.5 है, निम्नलिखित गणना करते हैं: (2.5) (1 मिलीलीटर) = (3) (एक्स)। एक्स = 0.833 मिलीग्राम। संस्कृति के 0.833 मिलीग्राम एक microfuge ट्यूब में रखा जाएगा।
    2. 1 मिलीलीटर संस्कृति मात्रा लाने की जरूरत पौंड + NTBC (300 माइक्रोन) या पौंड + DMSO की राशि की गणना। कदम 4.4.1 में उदाहरण के लिए, पौंड + NTBC या पौंड + DMSO की राशि 0.167 मिलीग्राम (- 0.833 मिलीग्राम संस्कृति 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा) होगा संस्कृति के लिए कहा। पौंड + NTBC और पौंड + DMSO के शेयर समाधान सभी उपभेदों गिराए के लिए आवश्यक मात्रा के आधार पर इन dilutions के लिए उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. संस्कृति और पौंड + एन मिक्सVortexing द्वारा टीबीसी या पौंड + DMSO।
  5. NTBC या DMSO के एक निरंतर एकाग्रता में संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, पीबीएस + NTBC या पीबीएस + DMSO में सामान्यीकृत रात भर संस्कृतियों का दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करते हैं।
    1. पीबीएस + NTBC और पीबीएस + DMSO के शेयर समाधान करें। एक तनाव के लिए dilutions की एक सेट के लिए, 720 μl की कुल मात्रा उपज के लिए 300 माइक्रोन NTBC या पीबीएस के साथ DMSO के एक बराबर मात्रा मिश्रण। परीक्षण कर रहे हैं कि कितने उपभेदों के आधार पर ऊपर या नीचे इन शेयरों स्केल।
    2. 10 -7 धारावाहिक dilutions के माध्यम से 10 -1 के लिए लेबल microfuge ट्यूबों। उचित ट्यूबों के लिए पीबीएस + NTBC या पीबीएस + DMSO के 90 μl जोड़ें। पौंड + NTBC में उगाया उपभेदों के लिए पीबीएस + NTBC का प्रयोग करें और पौंड + DMSO में उगाया उपभेदों के लिए पीबीएस + DMSO का उपयोग करें।
    3. उचित 10 -1 कमजोर पड़ने ट्यूब को संस्कृति के 10 μl जोड़ें। Vortexing द्वारा मिक्स और 10 -2 कमजोर पड़ने ट्यूब के लिए 10 -1 कमजोर पड़ने के 10 μl हस्तांतरण। सभी dilutions perfo कर दिया गया है जब तक दोहराएँrmed। Dilutions के बीच pipet सुझावों बदलें।
  6. प्रत्येक तनाव के लिए दो प्रतियों में पौंड + एच 2 ओ 2 प्लेटों पर 10 -7 dilutions के माध्यम से 10 -3 के स्पॉट 5 μl। स्पॉट चढ़ाया जाता है, तो सबसे कम से कम तनु (10 -7 -3 10) को पतला से एक pipet टिप का प्रयोग करें। टिप या तरल थाली में सूख गया है, जब तक की थाली झुकाव नहीं है।
  7. तनाव के आधार पर, 37 डिग्री सेल्सियस (हवा इनक्यूबेटर) पर 24-48 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं।
    नोट: पी aeruginosa PAO1 ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद लेग पर अच्छा आकार कालोनियों होगा। वे कालोनियों PAO1 के रूप में लगभग एक ही आकार है जब तक उपभेदों सेते हैं।
  8. एक transluminator ऊपर एक सीसीडी कैमरे का उपयोग प्लेटों तस्वीर। वैकल्पिक रूप से, एक ही आकार के विपरीत और फसल के लिए फोटो संपादित करें। ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक स्थान में कालोनियों की संख्या की गणना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC अनुमापन

NTBC पी में pyomelanin उत्पादन को कम करने में सक्षम था, तो NTBC अनुमापन का निर्धारण किया गया aeruginosa, और भी समाप्त या अतिरिक्त assays में उपयोग के लिए उत्पादन pyomelanin कम कर देता है कि NTBC की एकाग्रता की पहचान। वहाँ विभिन्न अनुकरण में उत्पादित pyomelanin के स्तर में बदलाव हो सकता है, लेकिन सामान्य प्रवृत्तियों निरंतर बनी रह सकती हैं। NTBC अनुमापन परख भी अन्य बैक्टीरिया में वर्णक उत्पादन को प्रभावित कर सकता है कि अन्य यौगिकों का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। नेत्रहीन निर्धारित या मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि एक प्ररूपी परिवर्तन होता है तो यह केवल, हालांकि, काम करेंगे।

पी के pyomelanin उत्पादन उपभेदों का उपचार NTBC साथ aeruginosa वर्णक उत्पादन 12 में एक खुराक निर्भर कमी के परिणामस्वरूप। चित्रा 2 से पता चलता है कि पी के विभिन्न प्रकारों Pyo के स्तर से संकेत के रूप aeruginosa, NTBC के प्रति संवेदनशीलता में मतभेद हैंमेलेनिन उत्पादन। NTBC के उच्च सांद्रता प्रयोगशाला तनाव hmgA :: तमिलनाडु 18 (वाशिंगटन विश्वविद्यालय के PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय) की तुलना में (दारा फ्रैंक से प्राप्त) नैदानिक ​​अलग PA1111 17 में उत्पादन pyomelanin कम करने के लिए आवश्यक थे। NTBC उपचार के साथ रंजकता में कोई परिवर्तन नहीं दिखाई pyomelanin [18 (वाशिंगटन विश्वविद्यालय के PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय) तमिलनाडु (कैरी हारवुड से प्राप्त) PAO1 और HPD ::] की उपज नहीं है कि उपभेदों। उत्पादन pyomelanin काफी प्रयोगशाला तनाव hmgA में कम हो गया था, क्योंकि :: TN कि एकाग्रता (300 माइक्रोन 0 माइक्रोन NTBC तुलना) का उपयोग करते हुए हम अपने assays के लिए 300 माइक्रोन NTBC का उपयोग करने का फैसला किया। इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी उपभेदों 15% ग्लिसरॉल में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।

एंटीबायोटिक MICS

एंटीबायोटिक MICS कई अलग अलग तरीकों का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है। यहाँ वर्णित microtiter प्लेट विधि उपयोग की अनुमति देगाआर एंटीबायोटिक सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण करने और संसाधनों की एक न्यूनतम का उपयोग करने के लिए। परिणाम आसानी से दोहराया है और परख का परीक्षण किया जा करने के लिए जीव के एंटीबायोटिक संवेदनशीलता में मतभेद के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया जा सकता है। कुछ भिन्नता स्वतंत्र प्रयोगों के बीच देखा जा सकता है, लेकिन प्रवृत्तियों काफी संगत कर रहे हैं। तकनीकी प्रतिकृति ही एमआईसी का प्रदर्शन करना चाहिए।

3 टेबल विभिन्न पी के लिए परिणाम से पता चलता है aeruginosa उपभेदों के साथ और NTBC और विभिन्न aminoglycoside एंटीबायोटिक दवाओं के बिना इलाज किया। तीन स्वतंत्र कालोनियों वर्णित विधि निम्नलिखित तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया। MICS सभी तीन तकनीकी प्रतिकृति में बैक्टीरिया विकास हिचकते हैं कि एंटीबायोटिक की सबसे कम एकाग्रता के रूप में दर्ज किया गया। NTBC उपचार परीक्षण किया उपभेदों के लिए अमिनोग्लाईकोसाइड mics पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

ऑक्सीडेटिव तनाव मौके प्लेट परख

परीक्षण ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए मौके प्लेट परख reproducibl देता हैएच अन्य assays में इस्तेमाल उन लोगों की तुलना में 2 ओ 2 के निचले स्तर का उपयोग कर ई का परिणाम है। एच 2 ओ 2 के बिना प्लेट प्रत्येक तनाव के लिए कमजोर पड़ने श्रृंखला की सटीकता का निर्धारण, साथ ही तनाव oxidative करने के लिए कोशिकाओं को subjecting बिना कॉलोनी आकार और प्रत्येक स्थान में कालोनियों की संख्या निर्धारित करने के लिए एक नियंत्रण थाली है। पहले स्थान एच 2 ओ 2 स्वतंत्र मीडिया पर कालोनियों की एक बेशुमार संख्या में होगा, जबकि एक उचित कमजोर पड़ने श्रृंखला में अंतिम स्थान, बहुत कुछ कालोनियों होना चाहिए। एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के भीतर प्रत्येक स्थान में कालोनियों की संख्या में दस गुना अंतर नहीं होना चाहिए। सभी उपभेदों का परीक्षण के लिए, कालोनियों के समान संख्या एच 2 ओ 2 मुक्त नियंत्रण प्लेट पर एक ही कमजोर पड़ने में देखा जाना चाहिए।

के रूप में बैक्टीरिया के विभिन्न प्रकारों के ऑक्सीडेटिव तनाव को अलग संवेदनशीलता, 2 ओ 2 सांद्रता परीक्षण किया जाना चाहिए एच की एक श्रृंखला हो सकती है। एच 2 ओ की सांद्रता बढ़ 2 ओ 2 प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव एच के प्रति संवेदनशील हैं संभालने प्रत्येक स्थान में कॉलोनी आकार और संख्या में कमी के संकेत के रूप विकास के घटते मात्रा में, दिखाना चाहिए। विभिन्न जीवाणु उपभेदों के विकास विशेषताओं एक विशेष एच 2 ओ 2 एकाग्रता के तहत ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए तुलना की जा सकती। परख बैक्टीरिया ऑक्सीडेटिव तनाव के अधीन हैं जब एक ही बैक्टीरियल तनाव पर, इस तरह के NTBC के रूप में एक विशेष यौगिक या अभिकर्मक, के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। कालोनियों भी बैक्टीरियल कॉलोनी विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के बीच इकाइयों के गठन में प्रतिशत की कटौती निर्धारित करने के लिए गिना जा सकता है।

चित्रा 3 पी के pyomelanin और गैर pyomelanin उत्पादन उपभेदों के एक स्थान प्लेट परख से पता चलता है aeruginosa साथ और NTBC बिना इलाज और एच 2 ओ 2 प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से अवगत कराया। एक स्पष्ट विभिन्न नहीं हैऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता के उत्पादन बैक्टीरिया pyomelanin जब में nce NTBC के साथ व्यवहार किया है, और भी वर्णक का उत्पादन करते हैं कि उन लोगों की तुलना pyomelanin की उपज नहीं है कि बैक्टीरिया के बीच रहे हैं। Pyomelanin, तो स्वाभाविक रूप से या कारण NTBC उपचार करने के लिए उत्पादन नहीं किया है कि तनाव, pyomelanin उत्पादन किया है कि उपभेदों से ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशील थे।

चित्र 1
चित्रा 1:। एंटीबायोटिक एमआईसी परख 96 अच्छी तरह से थाली के योजनाबद्ध सेट अप (ए) उच्चतम शुरू एकाग्रता की 2x एंटीबायोटिक दवाओं के 100 μl एच के माध्यम से बी एल बी + NTBC या पौंड या तो 50 μl से भर रहे हैं पंक्ति ए पंक्तियों में हैं + एंटीबायोटिक दवाओं के बिना DMSO। (ख) दो गुना धारावाहिक dilutions प्रत्येक अच्छी तरह से 2x पर अंतिम वांछित एकाग्रता में पतला एंटीबायोटिक के 50 μl में जिसके परिणामस्वरूप, जी के माध्यम से पंक्तियाँ एक में प्रदर्शन कर रहे हैं। पंक्ति एच बी के लिए अच्छी तरह से एक नियंत्रण हैएंटीबायोटिक दवाओं के बिना acterial विकास। पौंड या inoculum के 50 μl अंतिम एकाग्रता के लिए एंटीबायोटिक दवाओं दो गुना गिराए, उचित कुओं में जोड़ा जाता है। पौंड एंटीबायोटिक दवाओं में जीवाणु संक्रमण के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। जीएम, जेंटामाइसिन; किमी, केनामाइसिन; तोब, tobramycin।

चित्र 2
चित्रा 2: pyomelanin उत्पादकों और पी के गैर-उत्पादकों के NTBC अनुमापन aeruginosa। NTBC प्रयोगशाला और नैदानिक ​​pyomelanin उत्पादकों में एक खुराक निर्भर तरीके से उत्पादन pyomelanin कम है, लेकिन pyomelanin की उपज नहीं है कि दबाव में वर्णक के उत्पादन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। संदर्भ 12 से संशोधित।

चित्र तीन
चित्रा 3: ऑक्सीडेटिव तनाव की प्रतिक्रिया के लिए स्पॉट प्लेट परख जीवाणु उपभेदों कमजोर थे।एक ही आयुध डिपो से 600 घ, धारावाहिक 10 गुना पतला, और एच 2 ओ 2 के विभिन्न सांद्रता वाले लेग प्लेटों पर देखा। 0 मिमी एच 2 ओ 2 प्लेट परिणाम विभिन्न प्रकारों के लिए एक ही कमजोर पड़ने के लिए स्थलों में से प्रत्येक में कालोनियों के एक समान संख्या से संकेत के रूप में सभी उपभेदों, ठीक से पतला थे कि पता चला है। उपभेदों एच 2 ओ 2 की एकाग्रता के रूप में ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशील थे कि एच 2 ओ 2 शो युक्त प्लेटों में वृद्धि हुई। यह कोई एच 2 ओ 2 हालत, साथ ही कॉलोनी आकार में कमी की तुलना में स्पॉट में कमी आई कॉलोनी मायने रखता ने संकेत दिया है। संदर्भ 12 से संशोधित।

NTBC (माइक्रोन) के अंतिम एकाग्रता NTBC (75.9 मिमी) जोड़ने के लिए (μl) की मात्रा
0 0
50 </ टीडी> 0.659
100 1.318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11.86

तालिका 1: इस तालिका में विभिन्न NTBC सांद्रता और NTBC शेयर की इसी राशि देता है पौंड में अनुमापन की स्थापना के लिए NTBC सांद्रता 1 मिलीलीटर लेग में जोड़ने के लिए

एच के अंतिम एकाग्रता 2 ओ 2 (मिमी) 9.79 महाराष्ट्र 2 ओ 2 (30% WT) की राशि में जोड़ने के लिए (μl)
0 0
0.2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10.21

तालिका 2:। एच 2 ओ 2 की सांद्रता ऑक्सीडेटिव तनाव मौके प्लेट परख के लिए लेग अगर में जोड़ने के लिए इस तालिका में विभिन्न एच 2 ओ 2 सांद्रता और 2 ओ 2 शेयर 100 मिलीलीटर लेग अगर में जोड़ने के लिए केंद्रित एच की इसी राशि देता है।

"L65> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC hmgA :: TN - NTBC hmgA :: TN + NTBC HPD :: तमिलनाडु - NTBC HPD :: TN + NTBC PA1111 - NTBC
जेंटामाइसिन 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
Kanamycin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramycin 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

तालिका 3: एंटीबायोटिक एमआईसी परिणाम तीन स्वतंत्र कालोनियों प्रत्येक रणनीति के लिए तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया।में। संदर्भ में 12 से अनुमति के साथ फिर से छपी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 102 सूक्ष्म जीव विज्ञान, Pyomelanin NTBC oxidative तनाव न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता
तरीके बैक्टीरियल Pyomelanin उत्पादन रोकना और ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता में इसी वृद्धि निर्धारित करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L.… More

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter