Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.
Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.
Forskere har anvendt en bred vifte af dyremodeller for at studere den normale funktion af det auditive system samt patofysiologien af høretab. Disse modeller er også meget nyttig for udførelse interventionsstudier mod forskellige patologiske processer og tjene som grundlag for translationelle applikationer i mennesker. For de fleste forskning, som involverer cochlea og associerede auditive veje, må en vis grad af skader eller forstyrrelser blive introduceret til systemet. Ofte er skaden med vilje havde til formål at oprette en specifik læsion, så efterforskerne at studere effekten af denne læsion på normale funktion, samt cochlear evne til at komme sig efter den. Ved valg af en bestemt dyremodel og / eller teknik (r) til indføring skader, skal en række faktorer anses for at opnå de bedst mulige resultater. Forskellige dyremodeller kan reagere forskelligt på indgreb, mens de direkte og indirekte virkninger af en teknik kan værehelt skadelige for det ønskede resultat. I de fleste tilfælde vil den ideelle indre øre skader protokollen undgå systemisk toksicitet, hurtigt og pålideligt at producere skader, skabe en præcis og konsekvent læsion og være overleves at tillade yderligere undersøgelse af funktionelle, cellulære og molekylære ændringer. Ideelt set ville disse metoder også bevare den fine mikroarkitektur og elektrokemiske gradienter af cochlea i størst muligt omfang.
Hidtil har forskere lykkedes at etablere en række teknikker til at fremkalde indre øre skade. De fleste af disse medfører at udsætte cochlea til en ototoksisk middel enten systemisk eller via kirurgisk tilgang. Teknikker omfatter parenteral injektion, intraperitoneal injektion, trans-tympaniske injektion, endolymfatiske sæk injektion, og cochleostomy med perilymfatisk perfusion. Disse teknikker er blevet anvendt til at indføre en række ototoksiske midler, såsom furosemid, gentamicin, ouabain og heptanol. 1-5Mens vellykket på at skabe konkrete cochlear læsioner, også de ovennævnte teknikker har erkendt begrænsninger. Systemiske injektioner kan være meget giftige for dyret og kan være forbundet med utilsigtede cochlear fornærmelser og inkonsistente resultater. Sidstnævnte svaghed har også været forbundet med trans-tympaniske injektioner. Teknikker, såsom cochleostomy og perilymfatisk perfusion, mens stand til at inducere hurtig og meget pålidelig læsioner, direkte invasiv indre øre struktur og funktion. Mange af de kirurgiske metoder er også forbundet med en høj grad af tekniske vanskeligheder og kan kræve forlader fremmedlegemer i dyret, såsom en mikropumpe infuser. 2-4,6-8 ikke nogen enkelt teknik er fri for mangler og undersøgere skal vælge metoder omhyggeligt for at passe deres eksperimentelle behov. Her beskriver vi, i detaljer, det runde vindues fordybning (RWN) påføringsteknikken til topisk levering af ototoksiske stoffer i voksne mus.
Fiførste beskrevet af Husmann et al i 1998, mens han studerede gentamicin virkning på sensoriske hår celledegenerering i en aviær model blev denne teknik vist sig at være stand til at producere væsentligt mere pålidelige læsioner end systemisk gentamicin anvendelse, og samtidig undgå associerede toksiciteter. 9 Siden da en Antallet af andre forskere, herunder vores laboratorium, har udnyttet denne teknik til stor succes. I 2004 Heydt et al. tilpasset det til en musemodel og beskrevet en forbedret evne til at styre læsionsstørrelse ved at fylde RWN med absorberbare gelatine svamp i varierende koncentrationer af gentamicin. 10 Palmgren et al., i 2010, studerede de ototoksiske virkninger af beta-Bungarotoxin, en potent element i giften taiwanske stribede kasse, ved anvendelse af en vandig form af den til RWN af voksne rotter. 11 Desuden har en række tidligere undersøgelser fra vores laboratorium udnyttet det runde vindues tilgang til at studere ototoksiske virkninger af furosemide, ouabain og heptanol. 5,6,12-15 Resultaterne af disse undersøgelser har vist, hvor vigtigt det cochlear væske og ion-homeostase på normal hørelse, opdagede celle proliferativ evne i spiral ganglion og cochlear laterale væg, og fremmet vores forståelse af aldersrelateret høretab.
Den følgende fremgangsmåde involverer kirurgisk adgang til mellemøret via en postauricular snit og delvis unroofing af den benede tympaniske bulla. Dette muliggør en fremragende eksponering af RWN og membranen som et udvalgt ototoksiske middel kan anvendes direkte. Den flydende middel derefter pools i koplignende hule af RWN (eller langsomt dræner fra en mættet absorberbar gelatinesvamp bærer pakkes i RWN) og diffunderer gennem det runde vindues membran ind i perilymfatisk rum cochlear vestibule. Ingen direkte cochleostomy der i denne tilgang. Fordele ved denne teknik omfatter bevarelse af indre øre mikroarkitektur, undgåelseaf systemisk toksicitet, godtgørelse på et intra-animalsk kontrol øre, hurtig indsættende effekt, selektiv degeneration i visse cochlear celletyper (f.eks., type I spiral ganglion neuroner med ouabain eksponering og cochlear type II fibrocytter induceret af behandlingen af heptanol), og reproducerbare / pålidelige resultater. Denne teknik kan anvendes med få ændringer mellem andre gnaver arter, herunder rotter, marsvin og ørkenrotter. Ulemper omfatter en stejl teknisk indlæringskurve og den relative begrænsning af ototoksiske insult der er begrænset til et enkelt tidspunkt.
Protokollen og repræsentative resultater, der er beskrevet ovenfor, blev opnået i en CBA / CaJ musemodel herunder begge køn. Denne indavlet stamme er veletableret som en "god hørelse" standard og "normal aldring" model i at høre forskning. 16-23 Beskrivelse af brugen af denne protokol i andre pattedyr modeller er uden for rammerne af denne tekst. Læseren bør dog bemærkes, at RWN påføringsteknik giver flere fordele til at studere pattedyrs indre øre. Af disse er den mest bemærkelsesværdige er, at man undgår direkte forstyrrelse af den fine anatomisk struktur og biokemiske gradienter, der findes inden for væggene af otiske kapsel. Procedurer såsom cochleostomy og implantation af infusionspumper har tilbøjelighed til direkte krænke indre øre strukturer, der fører til permanente tærskel forskydninger; et faktum, der skal tages i betragtning, når man analyserer resultater. Afbrydelse af cochlear sidevæg strukturer ved invasive methods kan også begrænse brugen af ototoksiske midler såsom furosemid eller heptanol, hvis specifikke zone af effekt er begrænset til denne placering. 15,24 Alternative ikke-invasive metoder såsom trans-tympaniske injektion og parenteral injektion er blevet plaget af upålidelige resultater og / eller systemisk toksicitet for dyremodel. Denne påføringsmetode har vist sig at undgå begge disse mangler, at opnå en vis ensartethed, der nærmer sig de mere invasive metoder diskuteret ovenfor.
Andre fordele ved denne teknik omfatter dens brede anvendelighed til en række dyremodeller og muligheden for at inkorporere en eksisterende laboratoriefaciliteter. Med hensyn til sidstnævnte er der ingen specialiserede reagenser eller kemikalier kræves bort fra de valgte ototoksiske midler, anæstetika og analgetika. Ototoksiske midler anvendes typisk ved en fast koncentration og blandes i et tilstrækkeligt stort volumen af opløsning (5 ml) til at vare lange perioder overvejeing hvert program bruger omkring 10 pi (i mus). Således efter den indledende indkøb af forsyninger og instrumenter, efterforskere er relativt fri for tidskrævende løsning forberedelse eller hyppig udskiftning af materialer. Denne teknik giver også reduktioner i operativ tid, som kan være væsentlig i forhold til procedurer, der involverer implantation af perilymfatisk infusionspumper eller cochleostomies. Efter at have nået et niveau af tekniske færdigheder, vores gennemsnitlige færdiggørelse tid fra indledende snit til lukningen var typisk 20 min til 1,5 timer afhængigt af længden af eksponeringen ønskes for ototoksiske middel. Tre eller fire operationer kan nemt være afsluttet i en enkelt dag, der giver mulighed for øget effektivitet og øget potentiale for at opnå succesfulde resultater. Som beskrevet ovenfor er denne metode kan også nemt anvendes til en række af gnavermodeller herunder mus, rotter, marsvin og hoppemus.
Begrænsninger af denne metode er centreret påmoderat stejl indlæringskurve er nødvendig for at mestre det og faldt forventede resultater indtil tekniske færdigheder er nået. Som det vil blive diskuteret mere detaljeret nedenfor, vil små fejl under kirurgiske metode eller utilstrækkelig visualisering af det kirurgiske område næsten uvægerligt føre til en dårligt resultat. Subtile fund, som en novice kan undlader at anerkende, såsom en sub-millimeter tyk luftboble blokerer adgang af midlet til det runde vindue membran eller interstitielle væske fortynde agenten, tage tid til at værdsætte og udvikle de psykomotoriske færdigheder, der kræves for at rette dem. Men med gentagen kapacitet af proceduren disse hindringer overvindes let og udgør en mindre skræmmende teknisk udfordring for forskere end nogle af de førnævnte invasive metoder. Endelig er denne teknik forbundet med den relative begrænsning, at cochlear skade kun kan induceres på et enkelt tidspunkt under det kirurgiske eksponering. Dette kan overvindes til en vis grad, Ved at fylde RWN med absorberbare gelatine svamp i middel som blev beskrevet af Heydt et al. 10. absorberbar gelatinesvamp vil resorberes over tid, men kan give mulighed for en længere eksponeringstid, end det er opnåeligt ved anvendelse af en vandig opløsning alene.
For at en efterforsker til at realisere de fulde fordele ved denne teknik og undgå faldgruber, er det afgørende at anerkende de to kritiske elementer i denne teknik: 1) konsekvent fastholde visualisering af mellemøret plads og RWN; og 2) evne til at holde operationsfeltet fri for interstitiel væske og / eller blod. At opnå den førstnævnte af disse, kan betydningen af en ordentlig head-indehaveren ikke overvurderes. Sikker fiksering af dyrets hoved sikrer en stabil visning under mikroskop; hvis betydning bliver let indlysende, når subtile instrumentering drastisk ændrer positioneringen af strukturer under forstørrelse. En god hEAD holder, der kan rotere om dyrets rostral-caudale akse letter også vigtige dynamiske ændringer i investigators linje af webstedet. Ofte kan et par millimeter rotation omkring denne akse betyde forskellen mellem visualisering af RWN og visualisering af kun otiske kapsel knogle. Evnen til konstant at ændre opfattelse er også afgørende at sikre interstitiel væske fjernes ordentligt fra dybet af den niche, og også at den ototoksiske middel er fuldt fjernes mellem applikationer som diskuteret i del 5. Det er vores erfaring, blod, kondens eller interstitielle væske der kommer ind i mellemøret plads har evnen til at forstyrre hele forsøget. Dette er ikke overraskende, da den lille mængde af ototoksiske middel påføres det runde vindues (~ 10 pi) kan let fortyndes ved at komme i kontakt med selv små mængder af uvedkommende væske. Af denne grund, omhyggelig kirurgisk dissektion stykkevis hætten tages Trommehulens bulla og omhyggelig preservation af stapedial arterie er ensbetydende med en vellykket eksperimentelle resultater.
Hvis der observeres ovenstående kritiske trin og forventede resultater stadig ikke nået, bør fejlfinding påbegyndes. Det er vores erfaring, er det ofte nyttigt at udføre forsøg variationer af to proceduremæssige elementer. Den første er at ændre den hyppighed, hvormed det ototoksisk middel er genopfyldes i den runde vindue. Afhængigt af det middel, der anvendes, den samlede eksponeringstid er mellem 30 minutter og 1 time, med komplet vægevirkning og efterfølgende udskiftning af midlet hver 10 min. Hvis udsætte for kortere varigheder, kan øge den samlede eksponering tillade agenten mere tid til at diffundere over det runde vindues membran. Yderligere eksponering og efterfyldning kan også bidrage til at undgå uønsket fortynding af ototoksiske middel ved blod, kondensation eller interstitiel som beskrevet ovenfor. Forsigtighed bør opretholdes, når du bruger denne metode, men som det har en tendens til at øge risikoen for utilsigtetly at beskadige stapedial arterie og / eller indfører interstitiel fluid til RWN.
Denne teknik er signifikant i, hvad det giver til undersøgelser af cochlear fysiologi og patofysiologi. Dette minimalt invasiv teknik tillader detaljeret undersøgelse af sarte biokemiske processer og har været ensbetydende med at fremme vores forskning til formål at vurdere cochlear regenerativ potentiale. 12,24 Denne kirurgisk tilgang og eksponering også gengives på tværs af en række andre aflægger, teknikker, og vellykkede resultater ved hjælp af denne metode er blevet rapporteret i studier af cochlear stamcelle implantation. 14 En stor del stadig er ukendt om cochlea, men denne teknik, sammen med den bredere armamentarium rådighed for efterforskerne, vil støtte i at indsnævre denne viden hul.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.
1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
250ML | |||
Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
(Ketamine HCl) | 10ml | Schedule CIII controlled substance | |
Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
(Xylazine) | |||
Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3mg/ml |
(Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
(Povidone-Iodine) | |||
0.9% Sterile Saline | Variable | N/A | For mixing solutions and injections |
Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | N/A | |
Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
Medical University of South Carolina | |||
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20mm |
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | N/A (Vintage Item) | |
Scalpel Handle Size6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
Via ACE Surgical Supply Code | |||
Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4×8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
Cotton pellets #3 4mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
Precision Hair Clippers | Wahl | N/A | Multiple models may be substituted |
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 | |