El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

Resumen

Existen varios métodos para introducir agentes ototóxicos en las cócleas de modelos animales. Se presenta un protocolo quirúrgico para la administración de agentes ototóxicos en el nicho de ventana redonda. El procedimiento es fiable, crea lesiones intracocleares específicas y evita daños mecánicos en la microarquitectura. Es posible examinar la autorreparación/regeneración coclear.

Resumen

Los investigadores han utilizado una amplia gama de modelos animales y técnicas de investigación para estudiar el sistema auditivo de los mamíferos. Gran parte de la investigación básica relacionada con la cóclea y sus vías neuronales asociadas implica la exposición de las cócleas modelo a una variedad de agentes ototóxicos. Esto permite a los investigadores estudiar los efectos del daño dirigido a las estructuras cocleares y, en algunos casos, la autorreparación o regeneración de esas estructuras. Existen varias técnicas para la administración de agentes ototóxicos a la cóclea. Al seleccionar una técnica en particular, los investigadores deben considerar una serie de factores, incluyendo la inducción de toxicidad sistémica inadvertida, la cantidad de daño coclear producido por el procedimiento quirúrgico en sí, el tipo de lesión deseada, la capacidad de supervivencia del animal y la reproducibilidad/confiabilidad de los resultados. Las técnicas actualmente establecidas incluyen la inyección parenteral, la inyección intraperitoneal, la inyección transtimpánica, la inyección del saco endolinfático y la cocleostomía con perfusión perilinfática. Cada uno de estos métodos se ha utilizado con éxito y está bien descrito en la literatura; Sin embargo, cada uno tiene varias deficiencias. Aquí, presentamos una técnica para la aplicación tópica de agentes ototóxicos directamente en el nicho de la ventana redonda. Esta técnica no es invasiva para las estructuras del oído interno, produce una rápida aparición de lesiones dirigidas de forma fiable, evita la toxicidad sistémica y permite un control intraanimal (el oído contralateral). Los resultados derivados de este enfoque han ayudado a una comprensión más profunda de la fisiopatología auditiva, la degeneración de las células cocleares y la capacidad regenerativa en respuesta a una lesión aguda. Las investigaciones futuras pueden utilizar este método para realizar estudios de intervención que involucren terapia génica y trasplante de células madre para combatir la pérdida auditiva.

Introducción

Los investigadores han utilizado una amplia variedad de modelos animales para estudiar la función normal del sistema auditivo, así como la fisiopatología de la pérdida de audición. Estos modelos también son muy útiles para la realización de estudios de intervención en contra de diversos procesos patológicos y sirven de base para aplicaciones de traslación en sujetos humanos. Para la mayoría de la investigación con la cóclea y sus vías auditivas asociadas, algún grado de daño o interrupción debe ser introducido en el sistema. A menudo, el daño está dirigido intencionadamente para crear una lesión específica, permitiendo a los investigadores a estudiar el efecto de que la lesión en la función normal, así como la capacidad coclear para recuperarse de ella. Cuando se selecciona un modelo en particular de los animales y / o de la técnica (s) para la introducción de daños, una serie de factores deben ser considerados para lograr los mejores resultados posibles. Varios modelos animales pueden responder de forma diferente a las intervenciones, mientras que los efectos directos e indirectos de una técnica puede serenteramente perjudicial para el resultado deseado. En la mayoría de los casos, el protocolo de daño al oído interno ideal sería evitar la toxicidad sistémica, rápidamente y producir de forma fiable daños, cree una lesión precisa y consistente, y ser de supervivencia para permitir un mayor estudio de los cambios funcionales, celulares y moleculares. Idealmente, estos métodos también preservarían la microarquitectura y electroquímicos delicados gradientes de la cóclea en la mayor medida posible.

Hasta la fecha, los investigadores han tenido éxito en establecer una serie de técnicas para inducir la lesión en el oído interno. La mayoría de ellas implican la exposición de la cóclea a un agente ototóxico sistémica o mediante abordaje quirúrgico. Las técnicas incluyen la inyección parenteral, inyección intraperitoneal, inyección trans-timpánica, inyección saco endolinfático y cocleostomía con perfusión perilinfática. Estas técnicas se han usado para introducir una variedad de agentes ototóxicos, tales como la furosemida, gentamicina, ouabaína, heptanol y ^1-5.Mientras éxito en la creación de lesiones cocleares específicas, las técnicas anteriores también han reconocido limitaciones. Inyecciones sistémicas pueden ser altamente tóxicos para el animal y puede ser asociado con insultos cocleares no deseados y los resultados inconsistentes. Este último inconveniente también se ha asociado con las inyecciones de trans-timpánica. Técnicas como cocleostomía y la perfusión perilinfática, mientras que capaz de inducir lesiones rápidos y altamente fiables, son directamente invasiva a la estructura del oído interno y función. Muchos de los enfoques quirúrgicos también están asociados con un alto grado de dificultad técnica y pueden requerir dejar objetos extraños en el animal, como un infusor microbomba. ^2-4,6-8 Ninguna técnica es libre de defectos, y los investigadores deben elegir métodos cuidadosamente para adaptarse a sus necesidades experimentales. Aquí se describe, en detalle, el nicho de ventana redonda (RWN) técnica de aplicación para la administración tópica de agentes ototóxicos en ratones adultos.

Fiprimero descrito por Husmann et al en 1998 mientras se estudia el efecto de la gentamicina en sensorial degeneración de las células del cabello en un modelo aviar, esta técnica se encontró que era capaz de producir lesiones significativamente más fiables que la aplicación de gentamicina sistémica, evitando al mismo tiempo las toxicidades asociadas. ⁹ Desde entonces, una número de otros investigadores, incluyendo nuestro laboratorio, han utilizado esta técnica con gran éxito. En 2004, Heydt et al. adaptado a un modelo de ratón y descrito una mayor capacidad para controlar el tamaño de la lesión llenando el RWN con la esponja de gelatina absorbible empapado en concentraciones variables de gentamicina. ¹⁰ Palmgren et al., en 2010, estudiaron los efectos ototóxicos de beta-bungarotoxina, un potente elemento en el veneno de los taiwaneses bandas cajón, mediante la aplicación de una forma acuosa de la misma al RWN de ratas adultas. ¹¹ Además, un número de estudios previos de nuestro laboratorio han utilizado el enfoque de ventana redonda para estudiar los efectos ototóxicos de furosemidae, ouabaína, y heptanol. ^5,6,12-15 Los resultados de estos estudios han demostrado la importancia de fluido coclear y la homeostasis de iones en la audición normal, descubierto capacidad proliferativa de células en el ganglio espiral y la pared lateral coclear, y promovido nuestra comprensión de relacionada con la edad la pérdida de audición.

El siguiente enfoque implica el acceso quirúrgicamente el oído medio a través de una incisión retroauricular y destechamiento parcial de la bulla timpánica ósea. Esto permite una excelente exposición de la RWN y la membrana a la que un agente ototóxico seleccionado puede ser aplicado directamente. El agente líquido luego piscinas en el hueco en forma de copa del RWN (o lentamente drena desde un soporte de esponja de gelatina absorbible saturada lleno en el RWN) y se difunde a través de la membrana de la ventana redonda en el espacio perilinfático del vestíbulo coclear. No cocleostomía directa se hace en este enfoque. Ventajas de esta técnica incluyen la preservación de oído interno microarquitectura, la evitaciónde toxicidad sistémica, la asignación de una oreja de control intra-animal, rápido inicio del efecto, la degeneración selectiva en ciertos tipos de células coclear (por ejemplo., tipo I espiral neuronas ganglionares con exposición ouabaína y tipo coclear II fibrocitos inducidas por el tratamiento de heptanol), y resultados reproducibles / fiables. Esta técnica se puede aplicar con pocas alteraciones entre otras especies de roedores, incluyendo ratas, cobayas, y jerbos. Las desventajas incluyen una curva de aprendizaje empinada técnica y la limitación relativa de insulto ototóxico que está limitado a un solo punto en el tiempo.

Protocolo

Se llevaron a cabo todos los aspectos de la investigación con animales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo apropiado. Todos los procedimientos experimentales con animales vertebrados descritos aquí fueron aprobados bajo los lineamientos de la Universidad Médica de Comité (MUSC) Institucional Cuidado de Animales y el empleo de Carolina del Sur (IACUC).

Selección 1. Modelo

1. Mantener el modelo animal en un vivero bajo ruido con cuidados de rutina por los protocolos institucionales hasta que esté listo para su uso. En la investigación animal instalaciones (FIA), mantener la estabilidad de las vibraciones, el ruido de amortiguación, la iluminación diurna, el espacio de preparación, acabados superficiales, sellado y calafateo, y ventilación que cumplen con los estándares de NIH.
   Nota: Institutos Nacionales de Salud (NIH) directrices para ARF y mantenimiento de un vivero bajo nivel de ruido pueden ser revisados ​​en: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
2. Para todos los experimentos, utilice la oreja derecha como el oído experimental. La oreja izquierda sirve como un control intra-animal y no se ve alterada quirúrgicamente.
3. Inspeccione el modelo animal antes de la cirugía para detectar signos de infección del oído medio o externo. Signos potenciales pueden incluir drenaje de líquido o pus del oído, el tejido inflamado pabellón auricular, y / o letargo del animal. Esto es inusual, pero si se ha señalado, evitar la cirugía más allá y tratar al animal adecuadamente.

2. Los procedimientos preoperatorios

1. Anestesiar al animal de 30 min antes de la cirugía y cualquier procedimiento perioperatorias a través de la inyección intra-peritoneal (IP) de ketamina (100 mg / kg IP) y xilazina (20 mg / kg IP). Complementar la anestesia según sea necesario, como se juzga por un reflejo toe-pinch positivo, con una dosis más baja de ketamina (25 mg / kg IP) y xilazina (5 mg / kg IP). Determinar la dosificación en el cumplimiento de los protocolos institucionalmente permitidos para los ratones con la edad los ajustes apropiados de la dosis.
2. Compruebe completa sedation del modelo. Compruebe si hay un 3 avión etapa de anestesia para la totalidad del protocolo descrito marcada por una tasa de respiración regular, la falta de reflejo de enderezamiento (en ratones), y la falta de pedal y palpebral (toe-pinch) reflejos. Mantener el animal en este nivel de anestesia. Esto es de suma importancia para la minimización del dolor y el movimiento intraoperatoria, sangrado, y las fugas de fluidos intersticiales durante la cirugía.
3. Mantener la temperatura corporal del animal en 37,5 ° C con una almohadilla térmica en bucle cerrado.
4. Administrar analgesia a través de la inyección subcutánea de la buprenorfina. Entregar buprenorfina (0,1 mg / kg SQ una vez 30 min antes de la cirugía) como analgesia para minimizar cualquier incomodidad quirúrgica. Base de dosificación y las alternativas adecuadas para el modelo seleccionado en protocolos aprobados institucionalmente. Antibióticos uso no es necesario si una buena técnica aséptica se ha practicado. Los animales reciben analgesia postoperatoria si hay signos de dolor y angustia.
5. Realizar phpruebas ysiologic preoperatorio. Realización de pruebas y / o producto de distorsión pruebas de emisiones optoacústica (DPOAE), tanto antes de la cirugía y justo antes auditiva respuesta del tallo cerebral (ABR) a sacrificar el animal sirve como una medida objetiva para el efecto del agente ototóxico elegido en la audición del ratón.

3. Preparación quirúrgica y Posicionamiento

1. Esterilice todos los instrumentos antes de la operación por las normas institucionales. Preparar instrumentos y campo quirúrgico de una manera consistente, estéril, y organizados para evitar esfuerzos innecesarios y el movimiento durante el procedimiento. Instrumentos típicos requieren incluye tijeras de disección afilados, varios pares de pinzas metálicas con puntas de joyero, una recogida otológica, una cureta otológica, y una unidad de electrocauterio bipolar (Figura 1).
2. Preparar y esterilizar mechas de papel hechas de labwipes adelantado cortando una pequeña pieza triangular de la toallita (~ 0,7 in x 1.25 in x 1.75 in) y girando firmemente entre el pulgar y el dedo índice de una mano (~ 1,25 in). Creación de una mecha bien trenzado, extremadamente delgada es de suma importancia para el éxito del procedimiento. Preparar un total de 15-20 mechas antes de la cirugía (Figura 2).
3. Use un taladro dental para perforar rápidamente el hueso de la bulla timpánica de una manera controlada. El uso de un taladro de mano dental accionado por correa con una punta de 1 o 2 mm cónica es preferible. Un microscopio operatorio es necesario para completar el protocolo. (ver Paso 4.7)
4. Pre-dibujar 0,2 ml de una solución acuosa que contiene el agente ototóxico seleccionado en una jeringa de 1 ml de tuberculina con una, 1/2 'aguja 28 G. Típicamente 1 gota (~ 10 l) del agente es suficiente para llenar completamente el RWN ratón. Un metálico, aguja de la jeringa de punta roma facilita la administración del agente al tiempo que evita daños a estructuras subyacentes por una punta afilada en bisel. Expulsar el aire dentro de la jeringa en forma de burbujas pueden llenar inadvertidamente la RWN y / o prevenir adecuadola aplicación del agente a la propia ventana redonda.
5. Retire la piel de la piel de post-auricular utilizando tijeras de aseo eléctricos. Retire la piel en una zona que se extiende desde el pliegue-aurículo cefálica rostral al caudal cintura escapular. Extender la depilación de la dorsal, la línea media sagital al ángulo mandibular lateralmente. La eliminación adecuada de la piel es fundamental para el mantenimiento de un campo quirúrgico limpio y claro. Cepille suavemente recortes de la zona quirúrgica prevista.
6. Esterilizar la piel del área preparada por protocolos institucionales. Aplicar betadine (povidona / yodo) alternado con etanol por vía tópica de una manera circular durante 2 min. Otros agentes pueden ser sustituidos por las directrices institucionales.
7. Colocar el animal sobre una superficie plana para mantener la posición del cuerpo constante durante el procedimiento. Use una pequeña almohadilla de calentamiento colocado por debajo del cuerpo a la plataforma para controlar la temperatura corporal durante el procedimiento para mantener la temperatura corporal del animal a 36-38ºC. No overheat el animal ya que esto puede conducir a daños en la piel de leve a grave y / o la eutanasia temprano.
   1. Asegure la cabeza del animal a través de un aparato de soporte de bloque de mordida / cabeza. Utilizar un 0,5 cm por 2 cm de mordida mecanizada de latón con 2-4 mm de diámetro agujeros perforados a través de él a intervalos de 5 mm a lo largo del eje largo. Abra la boca del animal alrededor de este aparato y adaptarse a los incisivos centrales superiores en uno de los agujeros, dependiendo del tamaño del animal. Apriete suavemente una pequeña pinza sobre el dorso del hocico del animal para mantenerlo en su lugar (Figura 3).
   2. Confirmar que el soporte del bloque / cabeza bocado está conectado rígidamente al centro de un brazo de articulación en forma de U (Figura 3). Asegure una vara de ancho de 1 cm en el brazo izquierdo de la "U" y el uso de la barra como una cabeza resto de la izquierda (la derecha es siempre la parte dispositiva).
   3. Una vez firmemente asegurado en el soporte de la cabeza, gire el ratón a una posición de decúbito lateral izquierdo. Coloque el carefu cuerpoLLY en la superficie plana de operación para asegurarse de que será estable durante todo el procedimiento y evitar el estrés torsional indebida en las vértebras cervicales.
8. Coloque un microscopio quirúrgico capaz de 4x, 10x, y 20x aumentos sobre el campo quirúrgico. Confirmar que el microscopio puede mantener su posición de una manera manos libres, ya que es ideal para el protocolo quirúrgico de dos manos se discute a continuación.
9. Coloque una unidad de cauterio bipolar habilitado con pieza de mano fina del joyero de punta en una posición que está inmediatamente disponible para la ayuda en la cauterización de pequeños vasos y la disección de tejidos. Esto también puede ser necesario debe encontró sangrado más abundante.

4. Enfoque Quirúrgico

1. Bajo magnificación microscópica, utilice tijeras afiladas o una hoja de bisturí para crear una incisión retroauricular 1-1,5 cm, aproximadamente 6.8 mm caudal al pliegue auriculocephalic. En el ratón adulto, una incisión en la línea media dorsallateralmente a un punto cerca del ángulo de la mandíbula es adecuado. Evitar cuidadosamente cortando profundamente para preservar las estructuras vasculares subyacentes.
2. Llevar a cabo una cuidadosa disección roma a través de la capa de grasa subcutánea que puede ser de espesor variable. La grasa se puede quitar con seguridad si es necesario para una mejor exposición. Tome precaución cuando la disección en una dirección medial-ventral como la vena yugular externa atraviesa esta zona y el daño a esta estructura puede causar grandes cantidades de pérdida de sangre y la inundación del campo quirúrgico. Controlar cualquier sangrado excesivo con las esponjas de gelatina absorbible y / o pellets de algodón. Utilice cauterio bipolar para un sangrado más abundante.
3. Una vez que la capa de grasa se divide correctamente, exponer la musculatura cervical. Nota estructuras importantes incluyendo el cuerpo músculo grande de los cleidomastoideus centralmente dentro del campo quirúrgico expuesto, la vena yugular externa ventralmente, y el tejido parotídeo rostral que recubre el ángulo de la mandíbula. Un hito importante es una pequeña branc nervioh (del XI par craneal) que se envuelve alrededor del borde posterior / dorsal del cleidomastoideus extender rostral hacia el pabellón auricular (Figura 4).
4. Retraer con suavidad el cuerpo muscular cleidomastoideus en una dirección posterior / dorsal (Figuras 4, 5). Dividir suavemente la fascia transparente que envuelve el cuerpo muscular. De una manera similar, retraiga suavemente la parótida y la vena yugular externa en el (anterior / ventral) dirección opuesta (Figura 5).
5. Con una buena retracción del cuerpo muscular cleidomastoideus, la cúpula brillante del periostio bulla timpánica vendrá a la vista (Figura 6). En el aspecto caudal de la bulla, la inserción de un músculo cervical profunda, la sternomastoideus, vendrá a la vista (Figura 6). Preservar el nervio facial, que se hace visible en el aspecto dorsal y rostral de la cúpula bulla. Coloque un retractor auto-retención (de titanio estéril shaft-- incrustado en silicona desechablepegar) antes de la perforación.
6. Con la técnica a dos manos, dividir suavemente el periostio bulla con diatermia bipolar para exponer el hueso subyacente. El uso de fórceps o una cureta otológica, elevar suavemente y empuje el periostio en una dirección periférica para exponer ampliamente la cúpula bulla.
   Nota: El paso 4,6 es crítico para maximizar la vista quirúrgica del espacio del oído medio. Utilizar la manipulación de los tejidos blandos meticuloso y suave para evitar el sangrado y / o pérdida de líquido intersticial en la cavidad bulla después de la perforación.
7. Tras una cúpula bulla correctamente expuesta, perfore un agujero piloto de 2 mm a través del hueso bulla con un taladro quirúrgico dental entre el margen caudal de la cúpula y la línea visiblemente opaco (que representa la membrana timpánica) que se extiende a través del aspecto rostral de la ampolla (Figura 7). Tenga cuidado para perforar sólo a través del hueso de preservar las estructuras subyacentes, como la arteria estapedial. Perforar un segundo agujero piloto cercana para facilitar un-material para techos del hueso bulla ( Figura 7).
8. Con un par de pinzas de punta de joyero, destape el hueso bulla en una dorsal y dirección caudal (Figura 8). Retire el hueso de una manera gradual a alta magnificación. No perfore la arteria estapedial, que se encuentra directamente debajo de la tapa de bulla, como sangrado de esta arteria puede comprometer el procedimiento. Minimizar la cantidad de hueso eliminado para evitar la entrada excesiva de líquidos en el oído medio al tiempo que permite una excelente visualización y acceso al nicho de ventana redonda (Figura 8).

5. Ronda Aplicación ventana del Agente ototóxicos

1. Haga los ajustes rotacionales sutiles en el soporte de cabeza para llevar el RWN de lleno a la vista. La RWN se encuentra normalmente en el aspecto dorsal y caudal del espacio del oído medio y aparece como una indentación en forma de copa del hueso cápsula ótica. En la mayoría de los casos, la arteria estapedial se ejecuta 1-2 mm ventral / rostral a esto. La RWN veces puede ser tucked periféricamente bajo una angulación aguda de la cúpula bulla. En tales casos, una colocación cuidadosa de la cabeza del animal es primordial.
   1. El uso de las mechas de papel preparadas antes de la operación, retirar todo el líquido visible en el oído medio y RWN hasta que se visualiza el hueso seco.
      Nota: Este es el paso más crítico de todo el protocolo, como el ~ 10 l (1 gota) de agente ototóxico aplica a la RWN puede ser fácilmente diluida por este líquido.
2. Bajo ampliación máxima, utilice una aguja de calibre fino en una jeringa de tuberculina de 1 ml para aplicar una gota (~ 10 l) de agente ototóxico directamente a la RWN, llenando por completo. Tenga cuidado de no perturbar la arteria estapedial y observar de cerca para la sustitución de una pequeña reflexión de la luz en la base de un nicho en seco con un aburrido y nebulosos menisco de fluidos como un indicador de que el nicho está llenando correctamente.
   1. Deje que el agente para descansar dentro del RWN durante aproximadamente 10 minutos el tiempo de exposición. Después de esto, completamente wick a cabo el agente y sustituirla por una nueva aplicación del mismo agente. Determinar repeticiones de aplicación de acuerdo con las especificaciones de agente. El tiempo total de exposición en este procedimiento varía típicamente entre 30 a 60 min.
   2. Al final del procedimiento, completamente absorber la que el agente una última vez y aplicar agente fresca a la RWN. Deje la bulla destapado y el uso de fórceps para cerrar el tejido blando sobre el sitio quirúrgico.
3. Sello de sitio quirúrgico a nivel de la piel con una de 4-0, sutura con monofilamento no absorbible. Colocar el animal en una jaula de recuperación / estación. Monitorear la condición clínica del animal con regularidad después de la operación. Mantener el animal en condiciones ambientales adecuadas, incluida la vivienda con ropa de cama suave y suplementación con alimentos blandos, para minimizar el estrés. Determinar los procedimientos futuros y condiciones postoperatorias acuerdo con los protocolos del IACUC institucionales.
4. Utilice protocolos IACUC institucionales para esterilizar instrumentoss antes de su uso en el siguiente animal. Va a necesitar tiempo enfriamiento adecuado entre el uso del instrumento.

6. Procedimientos postoperatorios y cosecha de tejidos Coclear

1. Como se describe en el paso 2.5, lleve a cabo las pruebas fisiológicas de la audición después de la operación en los puntos deseados y antes del sacrificio. Realizar procedimientos postoperatorios de acuerdo a los objetivos experimentales. Sacrificar al animal en cualquier día del postoperatorio deseado.
2. Tras la anestesia completa a través de la inyección IP, como se requiere por los protocolos del IACUC institucionales, sacrificar al animal. Con unas tijeras afiladas, decapitar a los animales justo caudal al occipucio. Abrir bruscamente la bóveda craneal con tijeras a lo largo de la línea media dorsal y ventral y difundido ampliamente. Recoger suavemente el tejido cerebral para exponer los huesos temporales.
   Nota: Una serie de procedimientos para la investigación de los cambios de puestos de exposición en la cóclea puede ramificar desde este punto y se menciona en la sección de discusión. Determinar el método de investigación más relevant para los fines experimentales. Si se planea microscopía electrónica después de la cóclea se secciona, utilice el cateterismo cardíaco comprobar la validez de fijar el tejido. Esto está más allá del alcance de este debate y se ha cubierto en profundidad en otro lugar. ¹³
3. Cortar los huesos temporales fuera de la base del cráneo con las tijeras y se coloca inmediatamente en solución fijadora. Sumergir los huesos directamente en paraformaldehído al 4% durante 1,5 h a TA. Supervisar tiempo de fijación, como mayor duración puede limitar el resultado del análisis histológico en los pasos posteriores. Descalcificar diseccionó los huesos por un período variable de tiempo a través de la inmersión en 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Resultados

En un reciente estudio de Stevens et al utilizar el protocolo anterior, ratones adultos CBA / CaJ de ambos sexos fueron expuestos a través de la difusión de la ventana redonda de heptanol. ¹⁵ Heptanol es una brecha de la salida un-acoplador conocidos por producir apuntado, lesión recuperable a las células del pared lateral coclear. El propósito del estudio fue producir un modelo fiable para daño coclear específica, lo que permite la investigación de la regeneración post-quirúrgica de los elementos dañados. Umbrales de audición pre-quirúrgica y post-quirúrgicos servido como un criterio de valoración funcional. Microscopía y técnicas de tinción inmunohistoquímica se utilizaron para estudiar los cambios morfológicos. Los aumentos significativos en los umbrales de ABR se observaron en los ratones tratados con heptanol (Figura 9). Los animales de control que recibieron cirugía simulada, con la entrega de la solución salina en lugar de heptanol, no demostraron cambios significativos umbral en cualquier frecuencia probadas.

La inmunotinción contra un interiormente rectificarcanal de potasio (Kir) 4,1 sirvió como un método indirecto para la visualización de los daños / recuperación de estructuras cocleares. Esto demostró diferencias altamente reproducibles entre el tratamiento y control de las orejas. En general, la intensidad de tinción se redujo notablemente dentro de la estría vascular (StV) y entre los fibrocitos del ligamento espiral (SLF) 1-3 días después de la exposición heptanol, denotando grandes cantidades de daño dirigida a estas áreas. Hubo una disminución en particular en Kir intensidad 4.1 manchas en las áreas de tipo II y tipo IV SLFs (Figura 10) y STV (Figura 11). Evidencia de la integridad y la condensación nuclear interrumpido cromosómica / ampollas típicas de la apoptosis celular también fue visto en contratinciones nucleares en estas áreas cocleares (Figura 10). Zonas vacuolados de Kir 4,1 tinción resueltos marcadamente a los 7 días y estaban ausentes por completo a los 14 días. Cuando Kir 4,1 intensidad de la tinción se cuantificó en las áreas de StV, oídos tratados demostraron una inial canal seguido por un cambio significativo (p <0,05) de nuevo hacia la intensidad de control de 7 días después de la exposición heptanol (Figura 12).

Figura 1. Instrumento para este compromiso. Representación de pre-quirúrgica puesta a punto de la instrumentación. Todo el equipo debe ser de fácil acceso dentro del campo quirúrgico estéril. Instrumentación típica incluye 2 tijeras de disección, 2-3 recta y / o fórceps de joyero punta curvada con curetas oído, picos otológicos eje curvo (más tarde sustituido con Rosen recoge - no se muestra), y una unidad de electro-cauterización con unas pinzas finas de joyero punta curvada casco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Suministros quirúrgicos. Suministros adicionales para mantener el medio ambiente RWN. Recortes labwipe esterilizados para la formación de mecha de papel (izquierda), papel firmemente formada mechas hechas de toallitas esterilizadas laboratorio (centro), y 4 bolitas mm algodón (derecha) se utilizan para limpiar el exceso de líquido y las inundaciones de sangre en el nicho de ventana redonda. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. soporte de cabeza de animal. Imagen que representa el soporte de la cabeza y el bloque de mordida. Los agujeros en el bloque en forma y asegurar los incisivos centrales superiores. Una abrazadera se aprieta suavemente sobre el hocico dorsal para asegurar el animal en su lugar. El uso de un soporte para la cabeza es fundamental para OUTC quirúrgica exitosaome. Idealmente, esto debería ser capaz de girar en torno al eje rostral-caudal del animal para optimizar vistas quirúrgicos de la bulla durante el procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Cleidomastoideus m.. Gráfico esquemático que representa la anatomía básica de la musculatura cervical roedor y su asociación con la vena yugular externa. El músculo cleidomastoideus es el músculo más fácilmente identificados durante el abordaje quirúrgico. La liberación de la fascia envolvente seguido de retracción posterior / dorsal del cuerpo muscular dirigirá disección quirúrgica hacia la bulla timpánica (círculo negro). Haga clic aquí para ver alVersión Arger de esta figura.

Figura 5. Área de la exposición quirúrgica. Representa la exposición después de la disección a través de las capas de grasa cutáneos y subcutáneos. Puntos de referencia estructurales de la nota incluyen una rama de la XI par craneal que recubre el músculo cleidomastoideus (A), la vena yugular externa (B), y el tejido parótida expuesta (C). La rama XI par craneal se asocia a menudo con una pequeña embarcación y debe dividirse antes de continuar. De derecha a izquierda en la imagen corresponde al eje rostral-caudal del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. La exposición de la bulla. La exposición de la bulla timpánica después de la retracción de la cleidomastoideus y las estructuras circundantes. Hitos notables incluyen el cuerpo muscular cleidomastoideus (A) refleja posterior / dorsal, el nervio facial (B), y la cúpula brillante del periostio bulla timpánica (C). También, tenga en cuenta la inserción del músculo sternomastoideus en la cara caudal izquierda de la bulla timpánica (asterisco). La presencia del nervio facial en la cara dorsal y rostral de la bulla es un punto de referencia fundamental para la verdadera identificación de la bulla. De derecha a izquierda en la imagen corresponde al eje rostral-caudal del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. La exposición de nicho de ventana redonda I. Imagen que representa la tympanic bulla totalmente expuesta después de la disección del periostio suprayacente. El agujero piloto es el mejor situado en el punto medio entre el borde caudal de la cúpula de bulla y una línea opaca sutil visualizado dentro del aspecto rostral la bulla (en representación de la membrana timpánica). Un segundo agujero, piloto adyacente puede facilitar más fácil un-material para techos del hueso bulla. Evitar la perforación profunda se debe tomar para no lesionar la arteria estapedial subyacente. El objeto metálico oscuro en la parte inferior de la imagen es el retractor de tejido blando de titanio. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. La exposición de nicho de ventana redonda II. Bulla timpánica destapado con la exposición del nicho de ventana redonda (flecha) y la arteria estapedial (estructura roja1-2 mm lateral al nicho), como se observa bajo 20 aumentos. El nicho menudo pone en una posición escondido bajo el ángulo agudo formado por la cúpula bulla con la cápsula ótica en la cara caudal de la cúpula. Es imperativo que la visualización completa del nicho lograrse antes de la aplicación del agente ototóxico o con efecto de mecha. Eliminación de hueso excesiva durante destapar también debe ser evitado como líquido intersticial / la sangre tiende a inundar la cavidad cuando se crearon grandes agujeros. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. Los resultados representativos -. Heptanol pérdida de audición inducida y recuperación media la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) umbrales (dB SPL) trazan en función del tono pipfrecuencia. Las medidas se agrupan en función de pre-exposición (Negro-Control) y el día después de la operación (POD) 1, 7 y 14 (rojo). Las barras de error representan SEM. La figura fue re-trazado de Stevens et al. 2014. ¹⁵ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10. Los resultados representativos - Targeted daño coclear después de la exposición heptanol parte I. Los cambios en potasio rectificador interno (Kir) Canal 4.1 tinción dentro de la estría vascular (STV) de los oídos tratados con heptanol y controlar los oídos. (A) normal Kir 4,1 tinción típica de los oídos de control con una fuerte afinidad de células strial de Kir 4.1 (verde). (B) del oído Tratamiento en POD1. Grandes zonas vacuolized de decraliviado Kir 4,1 afinidad son vistos dentro del StV (puntas de flecha), junto con una disminución global de StV Kir 4,1 intensidad de la tinción. Los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo) (B). La barra de escala = 15 micras. La figura fue re-trazado de Stevens et al, 2014. ¹⁵ Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11. Los resultados representativos - Targeted daño coclear después de la exposición heptanol parte II Los cambios en el ligamento espiral (SL) de la oreja tratada heptanol comparación con el control auditivo.. (A) normal Kir 4.1 tinción (verde) dentro de la SL típica de la oreja de control con tipo de apariencia normal II fibrocitos ligamento espiral (II). (B) Heptanol toreja reated con marcada disminución de la intensidad de Kir 4,1 tinción en el área de tipo II fibrocitos del ligamento espiral, interrupción nuclear y condensación cromosómica / ampollas en consonancia con la apoptosis (flechas). Los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo). La barra de escala = 15 micras. La figura fue re-trazado de Stevens et al, 2014. ¹⁵ Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12. Los resultados representativos. - Recuperación de la intensidad de la tinción coclear después de la exposición heptanol La media de luminancia relativa de Kir 4.1 tinción representa como una función de días post-exposición. Luminancia relativa se calcula como Kir 4,1 intensidad reflexiva bajo microscopía confocal en tratar heptanoloídos ed tomados como un porcentaje de la misma en los oídos de control. Nota POD14-28 datos se agrupan como un solo punto de la curva. Los círculos sólidos representan los valores medios, mientras que las barras de error representan el error estándar de la media. Una recuperación significativa de luminancia relativa se demostró entre POD 7 y las fechas posteriores (prueba de la t de Student p <0,05, asterisco). La figura fue re-trazado de Stevens et al., 2014. ¹⁵ Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los resultados de protocolo y representativas descritas anteriormente se obtuvieron en un modelo de ratón CBA / CaJ incluyendo ambos géneros. Esta cepa endogámica está bien establecido como un estándar "buen oído" y el modelo "envejecimiento normal" en la investigación de la audición. ^16-23 Descripción del uso de este protocolo en otros modelos de mamíferos está más allá del alcance de este texto. El lector debe tener en cuenta, sin embargo, que la técnica de aplicación RWN ofrece varias ventajas a estudiar el oído interno de los mamíferos. De éstos, el más notable es que evita la interrupción directa de la estructura anatómica delicado y gradientes bioquímicos que existen dentro de las paredes de la cápsula ótica. Los procedimientos tales como cocleostomía e implantación de bombas de infusión tienen la propensión a violar directamente las estructuras del oído interno que conducen a cambios de umbral permanentes; un hecho que debe ser tenido en cuenta a la hora de analizar los resultados. La interrupción de estructuras de paredes laterales cocleares por metho invasivads también puede limitar el uso de agentes ototóxicos como furosemida o heptanol, cuya específica zona de efecto se limita a ese lugar. ^15,24 enfoques no invasivos alternativos tales como la inyección trans-timpánica y la inyección parenteral se han plagado de resultados poco fiables y / o toxicidad sistémica para el modelo animal. Este método de aplicación ha demostrado evitar tanto de estas deficiencias, el logro de un nivel de consistencia próxima a la de los métodos más invasivos discutidos anteriormente.

Otras ventajas de esta técnica incluyen es su amplia aplicabilidad a una serie de modelos animales y la viabilidad de incorporar en una infraestructura de laboratorio existente. Respecto a esto último, no hay reactivos o productos químicos especializados se requieren, aparte de los elegidos agentes ototóxicos, anestésicos, analgésicos y. Agentes ototóxicos se utilizan típicamente a una concentración fija y se mezclan en un gran volumen suficiente de solución (5 ml) para durar largos períodos de tiempo en cuentaing cada aplicación utiliza alrededor de 10 l (en ratones). Así, después de la adquisición inicial de suministros e instrumentos, los investigadores están relativamente libres de tiempo de preparación solución o reemplazo frecuente de los materiales. Esta técnica también ofrece reducciones en el tiempo operatorio, que pueden ser significativa cuando se compara con los procedimientos que implican la implantación de bombas de infusión perilinfáticos o cocleostomías. Al llegar a un nivel de competencia técnica, nuestro tiempo promedio de finalización de la incisión inicial hasta el cierre era típicamente 20 minutos a 1,5 horas en función de la duración de la exposición deseada para el agente ototóxicos. Tres o cuatro cirugías pueden realizar fácilmente en un solo día, lo que permite una mayor eficiencia y un mayor potencial para la obtención de resultados exitosos. Como se describió anteriormente, esta técnica también se puede aplicar fácilmente a una variedad de modelos de roedores incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y jerbos.

Las limitaciones de este método se centran en lamoderadamente empinada curva de aprendizaje necesaria para dominarlo y la disminución de los resultados esperados hasta que se alcance el dominio técnico. Como se discutirá en mayor detalle a continuación, los pequeños errores durante el abordaje quirúrgico o visualización insuficiente del campo quirúrgico se casi invariablemente conducir a un mal resultado. Hallazgos sutiles que un novato puede dejar de reconocer, como una espesa burbuja de aire que bloquea el acceso sub-milimétrica del agente a la membrana de la ventana redonda o líquido intersticial diluir el agente, se toman el tiempo para apreciar y desarrollar las habilidades psicomotoras necesarias para corregirlos. Sin embargo, con la actuación repetida del procedimiento de estos obstáculos se superan fácilmente y constituyen un desafío técnico menos desalentador para los investigadores que algunos de los métodos invasivos mencionados. Por último, esta técnica está asociado con la limitación relativa que la lesión coclear sólo puede ser inducida en un único punto en el tiempo durante la exposición quirúrgica. Esto se puede superar, hasta cierto punto, Llenando el RWN con la esponja de gelatina absorbible empapado en el agente como fue descrito por Heydt et al. ¹⁰ La esponja de gelatina absorbible se reabsorberá en el tiempo, pero puede permitir un período de exposición más largo que se puede lograr mediante la aplicación de una solución acuosa sola.

Para que un investigador para darse cuenta de las ventajas de esta técnica y evitar cualquier escollo, es fundamental reconocer los dos elementos críticos de esta técnica: 1) el mantener constantemente la visualización del espacio del oído medio y RWN; y 2) la capacidad de mantener el campo quirúrgico libre de líquido y / o sangre intersticial. En la consecución de la primera de ellas, la importancia de una cabeza titular adecuada no puede dejar de enfatizarse. Fijación segura de la cabeza del animal asegura una vista estable bajo el microscopio; la importancia de que se convierte fácilmente evidente cuando la instrumentación sutil cambia drásticamente el posicionamiento de estructuras con una lupa. Un buen htitular de ead que puede girar alrededor del eje rostral-caudal del animal también facilita importantes cambios dinámicos en línea del investigador del sitio. A menudo, unos pocos milímetros de rotación alrededor de este eje pueden significar la diferencia entre la visualización de la RWN y visualización de sólo el hueso cápsula ótica. La capacidad de cambiar constantemente de vista también es de suma importancia para asegurar el fluido intersticial se elimina correctamente desde las profundidades del nicho y también que el agente ototóxicos se elimina totalmente entre las aplicaciones como se discutió en la Parte 5. En nuestra experiencia, la sangre, la condensación, o líquido intersticial que entra en el espacio del oído medio tiene la capacidad de interferir con toda experimento. Esto no es sorprendente, ya que la pequeña cantidad de agente ototóxico aplica a la ventana redonda (~ 10 l) pueden ser fácilmente diluida al entrar en contacto con incluso pequeños volúmenes de líquido extraño. Por esta razón, la disección quirúrgica meticulosa, desoperculación fragmentario de la bulla timpánica y cuidadoso preservation de la arteria estapedial es equivalente a un éxito de los resultados experimentales.

Si se observan los pasos críticos anteriores y los resultados esperados aún no se logran, la resolución de problemas debe comenzar. En nuestra experiencia, a menudo es útil para realizar variaciones de prueba de dos elementos de procedimiento. El primero es modificar la frecuencia con la que el agente ototóxico se repone en la ventana redonda. Dependiendo del agente utilizado, el tiempo de exposición total es de entre 30 min y 1 h, con efecto de mecha completa y la posterior sustitución del agente de cada 10 min. Si la exposición para las duraciones más cortas, el aumento de la exposición global puede permitir que el agente más tiempo para difundirse a través de la membrana de la ventana redonda. La exposición adicional y reposición también pueden ayudar a evitar la dilución no deseada del agente ototóxico por la sangre, la condensación, o intersticial como se mencionó anteriormente. Se debe tener precaución cuando se utiliza este mantuvo enfoque, sin embargo, ya que tiende a aumentar el riesgo de inadvertidaly lesionar la arteria estapedial y / o la introducción de líquido intersticial a la RWN.

Esta técnica es significativo en lo que ofrece a las investigaciones de la fisiología y la fisiopatología coclear. Esta técnica mínimamente invasiva permite el estudio detallado de los procesos bioquímicos delicados y ha sido equivalente en la promoción de nuestra investigación destinada a evaluar el potencial regenerativo coclear. ^12,24 Este abordaje quirúrgico y la exposición también se reproduce a través de una variedad de otras técnicas de vástago, y los resultados exitosos de utilizar este método se han reportado en los estudios de la implantación de células madre coclear. ¹⁴ Mucho se desconoce acerca de la cóclea, sin embargo, esta técnica, junto con el arsenal más amplio a disposición de los investigadores, ayudará en la reducción de esta brecha de conocimiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-Heptanol 98%	Sigma-Aldrich	H2805	PubChem ID de sustancia 24895536
Ketaset Inyectable	Patterson Veterinaria	07-803-6637	Concentrado 100mg/ml
(Ketamina HCl)	10 ml	Cédula CIII sustancia
Anased Inyectable	Lloyd Laboratories	NADA# 139-236	Concentrado 20mg/ml
Buprenex Inyectable	Patterson Veterinaria	07-850-2280	Concentrado 0,3 mg/ml
(Buprenorfina HCl)	5 ampollas por caja	Cédula CIII sustancia
Betadine Skin Prep Solution	Medline	MDS093941	1 Botella con tapa de rosca
0.9% Solución salina estéril	variable Para		mezclar soluciones e inyecciones
Microscopio de operación	Carl Zeiss	32192
Acústica controlada Ambiente Cabina de sonido	Acoustics Company
Soporte de cabeza quirúrgica	Hecho a medida –	Consulte la Figura 3
de la Universidad Médica de Carolina
(espéculo de alambre, titanio) 1,75 pulgadas	World Precision Instruments	555801L	Extensión máxima 20 mm
Incrustado en masilla desechable para fijar dinámicamente al soporte
90N Taladro manual accionado por cinturón dental	Emesco	Vintage Item
Mango de bisturí tamaño 6	Bard-Parker	MEDC-011990
#15c Hoja de bisturí quirúrgico de acero inoxidable	Bard-Parker	SKU: 097-7215	50 cuchillas/caja
a través de ACE
Pinzas de joyero de punta recta	Bernell	MIL17304
Tijeras de Iris Curvo	Medline	DYND04026
Tijeras de Iris Rectas Medline		DYND04025
Stevens Tijeras de Tenotomía Rectas Medline		MDG3222111
Rosen Aguja de Oreja Eje Recto, Punta Ligeramente Curvada	MytaMed	Artículo# 6.56.00	La Figura 1 muestra selecciones de eje en ángulo. Esto fue sustituido más tarde por las selecciones
Rosen Aguja de oreja Rosen Eje recto, punta fuertemente curvada	MytaMed	Artículo# 6.56.01
Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas	CÓDIGO DE CIENCIA	DE KIMTECH 34155	Blanco, tamaño 4.4x8.4 pulgadas. Cortar en triángulos y enrollar en mechas de punta fina.
Cureta de orejas de casa, eje de 6", ángulo de luz	Medline	MDG0396486
Gelfoam (esponja de gelatina absorbible) Tamaño 100	Medline	IIS34201	Se pueden hacer sustituciones
Pellets de algodón #3 4 mm		Richmond Código de Fabricación 100108
Unidad ElectroQuirúrgica 100 E M/M	Lista Elmed	No. 52-5770	Capacidad Bipolar y Monopolar
1cc Jeringa de Insulina U-100 28G, aguja de 0.5" de longitud	BD	Número de producto: 329410	Opcional para la entrega de agente ototóxico
23G, punta roma, 1" longitud de la aguja	Kendall	Código de producto 8881202397	Para la administración controlada de agente ototóxico con menos riesgo de dañar la arteria estapedial
Mascarilla quirúrgica	U-line	S-10478
Guantes quirúrgicos de nitrilo de grado de examen	U-line	S-12549
Cortapelos de precisión Wahl			Varios modelos pueden ser sustituidos
5-0 Sutura de monofilamento negro de nailon en PC-1  Aguja circular de 13 mm 3/8	Ethilon	1855G	Se pueden hacer sustituciones.
Bolsa de esterilización de sellado instantáneo	Fisher	01-812054
Esterilizador en seco	ROBOZ	Germinador TM 500

controladacontrolada Industrial Retractor de tejidos blandos para el cuello del Surde la cabezaCódigo de suministro quirúrgico