Protocol
Etik erklæring: Den menneskelige placenta undersøgelse blev udført prospektivt, med godkendelse af Institutional Review Board for den menneskelige forskning af Korea Universitet (AN09085-001). Alle forsøg blev udført i en Clean Germ værelser facilitet på Korea University Medical Center. Det eksperimentelle design og procedurer ved hjælp hPSCs blev godkendt af Institutional Review Board af Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Fremstilling af instrumenter, Kultur Medier og fade
- Coat alle dyrkningsskålene med 0,1% gelatine. Autoklave phosphatbufret saltvand (PBS) og pincet. Sterilisere kirurgiske sakse, mikrocentrifugerør og gaze ved 121 ° C under £ 15 psi i mere end 15 min.
- Forberedt forvarmet 0,25% trypsin-ethylenamin tetra-eddikesyre (trypsin-EDTA) og forvarmet filtreret dyrkningsmedium (DMEM) indeholdende 20% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 g / ml streptomyci før påbegyndelse procedurer.
2. Cell Isolation fra human placenta
- Opnå placentavæv efter kejsersnit levering, fra sunde gravide kvinder gennemgår normal eller terapeutisk abort ved 7-32 ugers svangerskab efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke.
- Har den obstetriske specialist kirurgisk særskilte menneskelige placenta chorion plader (HPCs) fra placenta; inkubere disse i 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 20 minutter, og derefter skylles med 5 ml PBS.
- Isoler chorionvilli fra HPC'er med en saks; hakkekød villi og vaske dem tre gange med 1 ml PBS. Efter hakning, placere chorionvilli i et mikrofugerør med en pipette tip; vaske prøverne med 500 pi PBS ved pipettering op og ned, og centrifugeres rørene i 120 x g i 3 min. Vask væv to gange med 500 pi foropvarmet dyrkningsmedium.
- Dyrke celler i medium på gelatine-overtrukne plader ved 37 ° C, i 5% CO2
- Udveksle medium hver 2-3 dage, indtil den tredje passage. Under dyrkning, fjernelse af cellerester flydende i dyrkningsmediet; voksende placentale fibroblaster vil lægge til pladen. Kultur de fibroblastlignende celler afledt af HPC op til 10 th passage og derefter høste dem for hESC kulturer efter trypsinbehandling og mitomycin-C (10 ug / ml) behandling.
- Før frysning HPC'er som stock prøver, anvender revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at bekræfte, at HPC'er ikke er kontamineret med patogener, der almindeligvis inficerer placenta, herunder mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginin, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,og M. capricolum), og de bakteriearter, Ureaplasma urealyticum, ved anvendelse af et mycoplasma detektion kit.
- Følge producentens instruktioner for at udføre RT-PCR, bruge alle primere og en blanding i kittet. Brug supernatanterne af de celler, der er blevet dyrket i 36 dage for mycoplasma detektion. Tilsæt 3 pi af disse prøver til PCR-blandinger og udfører 1. PCR-procedure i 35 cykler, hver bestående af 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 2 min og 72 ° C i 1 min.
- Derefter tilsættes forsigtigt 0,5 pi af 1. PCR-produktet til PCR-blandingen og udfører 2. PCR-procedure i 30 cykler under anvendelse af de samme betingelser som før. Analysere de amplificerede produkter af 1% agarose gelelektroforese; anvende 10 pi af hver af 1 og 2. PCR-produkter til geler.
- Hvis der findes HPCs at være forurenet med sygdomsfremkaldende, fjerne disseanvendelse af en kombination af antibiotika (BM-cyclin) efter producentens anvisninger. Tilføj nyt medium indeholdende 10 ug / ml BM-cyklin 1 i 3 dage, og derefter behandle cellerne med 5 ug / ml BM-cyklin 2 i yderligere 4 dage. Gentag denne cyklus to gange og derefter tjekke for mycoplasma forurening igen.
3. Høst human placenta-afledte celler konditioneret Medium (hPCCM)
- Efter at udelukke kontaminering, behandle de vedhæftede celler (85-90% konfluens, (1,5 × 10 7 celler / kolbe) med mitomycin-C (10 ug / ml) i 2 timer og 30 min, og vaskede cellerne tre gange med 10 ml PBS. Inkubér cellerne med foropvarmet medium uden mitomycin-C i 24 timer.
- En dag efter behandling, inkuberes celler i 10 ml medium (DMEM-F12 suppleret med 20% Knock-Out Serum Replacement [KOSR], 0,1 mM β-mercaptoethanol, 1% NEAA og 1% penicillin-streptomycin). Efter 24 timers inkubation, høst CM i en 15 ml konisk rør ogforetage CM anvendelse af et 0,22 um sprøjtefilter.
- Tilføj yderligere 10 ml nyt medie og inkubation. Indsamle alle supernatanter fra kulturerne hver dag i 1 uge og fryse det høstede medium ved -80 ° C. Undgå gentagne fryse-tø-cykler.
4. Kultur humane embryonale stamceller (hESCs) og Induktion af pluripotente stamceller (iPSCs)
- Opnå Humane embryonale stamcellelinjer, H1 og H9-celler (opført i NIH embryonale registreringsdatabasen under navnet WA01 og WA09, henholdsvis) og induceret pluripotente stamceller IPSC-1: iPS (forhud) -1 og iPSC-2 (IISH1i- BM) fra WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). Celler skal optøs og dyrkes efter fabrikantens anvisninger.
- For kontrolgruppen, kultur celler på basalmembranmatrix-overtrukne skåle i vid udstrækning anvendes feeder-fri og serum-frit defineret dyrkningsmedium ved 37 ° C og i 5% CO2. I første omgang, frø 80-100 klumper af hPSCs jegn 35-mm-retter. Grow celler i disse retter indtil 70-80% konfluens og rutinemæssigt passage celler til sub-dyrkning gang hver 5-6 dage, ved hjælp af mekaniske eller enzymatiske metoder (Dispase). Vask cellerne to gange med medium og plade dem i et forhold på 1: 4. Udskifte mediet med frisk medium hver dag.
- For de eksperimentelle grupper, kultur celler i hPCCM på skåle præ-coatet med 0,1% gelatine og udføre rutinemæssig passage én gang hver 5 dage, enten mekanisk eller enzymatisk. Plate celler ved forhold i området fra 1: 6-1: 10. hPSCs tillægger gelatinen inden for 2 dage efter overførslen. Udskifte mediet med frisk medium hver dag.
5. Karakterisering af humane pluripotente stamceller
BEMÆRK: Karakterisere hPSCs ved hjælp af flere metoder, såsom alkalisk phosphatase-farvning, immunocytokemi, Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR), og western blotting.
- Immunofluorescensfarvning
- For immunofluorescence farvning kultur hPSCs og fikseres cellerne i 8 brønde slide kamre med 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd i 10 minutter; derefter, permeabiliseret af cellerne med 0,1% (volumen / volumen) Triton-X100 i 15 minutter, og blokere cellerne i 1 time med 3% (vol / vol) normalt hesteserum i PBS indeholdende 0,1% (volumen / volumen) Tween- 20. Vask PBS to gange i 5 min mellem hvert trin.
- Cellerne inkuberes med det primære antistof (OLT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, fortynding på 1: 1.000) O / N ved 4 ° C, og med det sekundære antistof.
- Inden montering, inkuberes cellerne med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 minutter i mørke. Vask cellerne stringent tre gange i 5 minutter hver og tørre cellerne fuldstændigt, i mørke. Bevar celler i fluorescens montering medium og observere dem under et fluorescens mikroskop.
- QRT-PCR
- Isolere total RNA fra celler under anvendelse af et RNeasy mini kit ifølge fabrikantens specifikationer og kvantificere det ekstraherede RNA ved anvendelse af en Nano Drop spektrofotometer. Syntetisere cDNA ved tilsætning af 2 ug af det totale RNA til en 20-pi reaktionsblanding indeholdende oligo (dT) primere og Superscript II revers transkriptase; Følg producentens anvisninger i denne procedure.
- Opformere syntetiserede cDNA med en Bio-Rad iCycler iQ system, ved hjælp iQ SYBR Green qPCR Master Mix og primersekvenserne beskrevet i Supplemental Tabel S1. Normalisere cyklus tærskelværdierne for generne af interesse for dem af glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH).
- Alkalisk phosphatase (AP) farvning
- Detect AP aktivitet under anvendelse af ES Cell Karakterisering Kit ifølge producentens protokol.
- På dag 5, aspireres medierne og fastsætte hPSCs med 4% paraformaldehyd i PBS i 12 min. Må ikke overfix; fastsættelse celler i mere end 2 minutter, vil resultere i inaktivering af alkalisk phosphatase. Aspirer fiksativ og skyl med 1x Rinse Buffer. Må ikketillade brønde tørre mellem trin.
- Tilsæt så farvningsopløsning at dække hver brønd (1 ml pr brønd af en 35 mm skål). Pladerne inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Efter inkubation vaskes retter med 1x Rinse Buffer. Cover celler med 1x PBS for at forhindre udtørring og undersøge og billedet de farvede celler ved hjælp af et Olympus mikroskop.
- Western Blot
- Udføre Western blot-analyse som tidligere beskrevet i 9. Kort beskrevet bestemme proteinkoncentrationer i cellelysater. Løse lige store mængder protein på en natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overføre proteinerne til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
- Blokere blottet og sonde det O / N med forskellige primære antistoffer ved 4 ° C; efterfølgende inkubere blottet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time. Vask membranen tre gange i 10 minutter hver gang mellem inkubationer. Opfange signaler under anvendelse af en ECL-reagens.
- Short Tandem Repeat (STR) Analyse
- hPSCs blev høstet fra kontrolgruppen og forsøgsgrupper på samme passage. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af et DNA Micro kit, ifølge producentens instruktioner.
- Amplificere genomisk DNA i 16 forskellige genetiske loci under anvendelse af AMPF / STR PCR Amplification Kit ifølge producentens specifikationer og kapillar elektroforese blev udført under anvendelse af en Genetic Analyzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fordel ved denne hPSC formering metode er, at den anvender komponenter udskilt fra humane celler. En mest ciritical trin i protokollen er isolering og dyrkning af humane placenta-afledte celler. Dette kræver og præcis dissektion fra en præcis del af HPC plade villi. Figur 1 viser proceduren for human placenta-afledt celle isolation. Denne proces er enkel og praktisk til isolering af celler, og kan nemt udføres inden for 1 time. Som beskrevet i figur 2, væv fastgjort til gelatineovertrukne dish og fibroblastlignende celler spirede robust. Fjernelse af affald og ødelagte væv under passager ved trypsinisering tillader selektion af celler og sikrer en homogen kultur. Disse celler kan anvendes til at frembringe konditioneret medium til hPSC proliferation af efter bekræftelse manglende kontaminering. Optimale betingelser blev defineret som dem, der tillod cellerne at vokse til 80-85% konfluens, hvorefter the vækst kunstigt stoppet (data ikke vist).
hPSCs dyrket på fødeceller eller syntetiske matricer kan overføres til gelatine-overtrukne skåle i hPCCM. Figur 3 viser, at hPSC linjer kan opretholdes i hPCCM på et niveau svarende til den, der er observeret for Matrigel-coatede plader (figur 3A og B). 0,1% gelatine er ikke blevet uesd for hPSC kultur indtil nu. I vore betingelser, hPSCs udvidet og vedligeholdt pluripotens, ligner hPSCs i kontrolgruppen. At bekræfte, at hPCCM adgang andre matricer i hPSC kultur, hPSCs blev sub-dyrket på laminin, vitronectin og ikke-overtrukne skåle. hPSC knyttet og voksede i hPCCM på laminin- og vitronectin-coatede retter. Men efter flere passager blev mange kolonier differentieret og ikke opretholde, i modsætning til dem på gelatineovertrukket gruppe. Efter overførsel til de ikke-coatede skåle blev ingen binding observeret for hPSCs (figur 3C). Til confirm at hPSCs var genetisk identiske med kontrolgruppen efter langtidsbehandling kultur i hPCCM, hPSCs dyrket i parallel fra begge grupper blev analyseret under anvendelse af en kort tandemgentagelse (STR) teknik til 16 genomisk loci (figur 3D og E).
En bredt accepteret begreb om ex vivo kultur hPSCs er, at bFGF er nødvendig for at fremme selv-fornyelse. I mangel af bFGF, hPSCs mister deres selvfornyelse evne og differentiere 12,13. I hPCCM tilstand, gjorde hPSCs ikke mister deres selvfornyelse evne og stabilt udtrykt pluripotens markører under langvarig kultur (figur 4A - C).
Evnen til differentiering til celler af 3 kim lag er en unik iboende egenskab ved hPSCs. Hver hPSC bør testes for at kontrollere bevarelsen af denne evne. Som vist i figur 5, hPSCs spontant differentieret i celles af de 3 kimlag efter 2 ugers induktion i hPCCM (figur 5A og B). Disse data indikerer, at hPCCM er optimal til klinisk anvendelse.
Fastgørelsen tid på gelatine-overtrukne skåle under hPSC overførslen er længere end det er på skåle coatet med kommercielt syntetiske matricer til hPSC formering. Normalt celler fastgjort inden for en dag efter belægning med syntetiske substrater. Figur 6 viser vedhæftet fil på 0,1% gelatine samt om kontrolforanstaltninger plader. Efter 24 timers sub-dyrket hPSCs vedhæftet lidt mere på gelatine end om kontrol (figur 6A). hPSCs skal håndteres med forsigtighed. Efter 48 timer blev hPSCs fuldstændigt fastgjort og begyndte ekspansion på gelatine-overtrukne skåle (figur 6B). Endvidere hPSCs syntes at vokse effektivt og dannede pakkede kolonier på dag 5 efter subkultur på gelatine (figur 6C). I den periode, vedhæftet fil for hPSCs, omhyggelige behandlit er vigtig og kan påvirke overlevelse og selv-fornyelse. I hPCCM betingelser, er en 48 timers periode stærkt anbefales til fastgørelse af hPSCs.
Figur 1: Cell isolation fra human placenta chorionvilli (A) Frisk placenta chorion væv blev vasket i PBS efter trypsinbehandling.. (B) I villi blev skåret i stykker med steriliserede kirurgiske sakse. (C) Villi blev vasket flere gange i PBS for at fjerne snavs og fartøjer. (D - E) Villi blev overført til en mikro-centrifugerør, hakket (maksimum) og vasket. (F) Væv blev centrifugeret under anvendelse af en bordcentrifuge. (G) Denne fremgangsmåde blev gentaget tre gange i PBS og to gange i forvarmet dyrkningsmedium. (H) Celler og væv blev podet sammen på en forud overtrukket gelatine kolbe og inkuberet i 5-7 dage. Cellerne fastgøres og spirede.
Figur 2: Dyrkning af human placenta-afledte celler (A) Ca. 1 uge efter isolering, human placenta væv og celler bundet til gelatine-coatede kolber og fibroblastlignende celler spirede.. (B) Efter den første subkultur passage blev vævene fjernet. Blev mediet erstattet med frisk medium hver anden dag. (C) Efter den tredje passage, dukkede celler mere homogen. Scale barer:. 200 um Klik her for at se en større version af dette tal.
es / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
Figur 3:. Humane pluripotente stamceller i hPCCM på gelatine-overtrukne skåle Efter 13 passager, hPSCs, dyrket i hPCCM på gelatine-overtrukne skåle, udviste høj alkalisk phosphatase (AP) aktivitet. (A) H1 og iPSCs blev dyrket i kontrolbetingelser (mTeSR1 om Matrigelcoatede retter). (B) H1 og iPSCs blev dyrket i hPCCM på gelatine-overtrukne skåle. Venstre panel: lyse område; Højre panel: alkalisk phosphatase farvning. (C) H1 og iPSC blev overført og dyrket på flere matrix-coatede skåle til sammenligning. Som vist efter 5 passager hPSCs blev dyrket. Laminin-overtrukne skåle, vitronectin-coatede skåle, ikke-overtrukne skåle. (D - E) STR analyse for hPSCs dyrkes i hPCCM sammenligning med kontrol hPSCs. Scale barer:. 10 um venligst cslikke her for et større version af dette tal.
Figur 4:. Menneskelig pluripotente stamceller formering kræver ikke bFGF (A) H1 celle immunofluorescensfarvning med antistoffer mod SSEA-4, oktober-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, og TRA-1-81 efter 14 passager på gelatineovertrukket retter hPCCM. Målestok: 10 um. (B) RT-PCR-analyse blev anvendt til at måle ekspressionen af stemness markører, OCT4, NANOG, og Rex1 i de forskellige cellelinjer i eksperimentelle og kontrolbetingelser. (C) De protein ekspressionsniveauer af pluripotens markører, OCT4, SOX2 og FGF2 i hPSCs blev bestemt ved Western blotting. Klik her for at se en større version af denne figure.
Figur 5: Analyse af pluripotens in vitro. (A) QRT-PCR-analyse blev anvendt til at måle ekspressionen af stemness markører, OCT4 og NANOG og ekspressionen af tre kimlag markører i differentierede celler og udifferentierede celler dyrket i hPCCM betingelser. Som det fremgår af grafen, målinger blev normaliseret til ekspressionsniveauerne observeret i kontrol dyrkningsbetingelser (Oct4) T, HNF3 β de:. Mesoderm, nestin, SOX1: ectoderm, AFP, GATA3: endoderm. Fejlsøjlerne angiver middelværdier ± SD. (B) H1 og IPSC linjer, der blev dyrket i 10 passager under forsøgsbetingelser dannede embryoide legemer efter 2 uger, der indeholdt mesoderm (desmin), ektoderm (TUJ1),og endoderm (AFP, GATA4), som målt ved immunofluorescens-farvning. Scale barer:. 100 um, 200 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Sammenligning af hPSC tilknytning mellem to matrix-coatede plader H1 og iPSC-1 blev overført til forskellige forhold, 0,1% gelatine i hPCCM og kontrolgruppen. (A) 1 dag efter hPSC subkultur. (B) 2 dage efter hPSC subkultur. (C) 5 dage efter hPSC subkultur. Scale barer:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne model blev udviklet med succes udbrede hPSCs og samtidig bevare deres egenskaber, i humaniserede fødefri dyrkningsbetingelser uden tilsætning af exogene rekombinante vækstfaktorer, såsom bFGF eller insulin, hvilket muliggør manipulation af hPSCs i et humaniseret mikromiljø. Exogent bFGF tilskud er almindelig, og anvendelsen af substrata såsom Matrigel eller laminin er afgørende for feeder-fri dyrkning af hPSCs 14.
Denne protokol er enkel og let at gennemføre. Men nogle trin er afgørende for dens succes. Det vigtigste skridt er den aseptiske isolation af chorion celler fra moderkagen. På grund af fremgangsmåderne til placenta indsamling, er risikoen forurening af patogener såsom mycoplasma er høj. Derfor patogen undersøgelse og forvaltning i isoleringen af celler er meget vigtige. Derudover skal alle de procedurer, der skal udføres aseptisk. Indsamlingen af conditioned medier fra kulturen af humane placenta celler er generelt let. Imidlertid er erfaring i hPSC kulturer nødvendig, fordi deres håndtering er noget vanskeligt. Som et andet vigtigt punkt, skal forskeren bruger denne protokol huske på, at det forhold, at den nødvendige tid til fastgørelse af hPSCs i denne protokol er længere (36-48 timer) end populære dyrkningsmetoder (ca. 24 timer). Denne forskel påvirker ikke levedygtighed eller proliferation af hPSCs. Tværtimod væksten af hPSCs dyrkes i henhold til denne protokol er mere robust end celler dyrket ved anvendelse af traditionelle protokoller.
Desuden er denne protokol har applikationer til induktion af afstamning differentiering. For eksempel kan human embryonale kim-lignende celler eller progenitorceller omdannes til nyttige celler eller væv ved anvendelse eller modifikation af denne protokol. Det giver en mere tilgængelig platform for at identificere specifikke eksogene kosttilskud i forskellige forhold.En begrænsning af denne protokol er afhængighed af hPCCM produktion på placenta overtagelsen. Derfor er der behov for en kontinuerlig human placenta forsyning.
Denne protokol er vigtigt, fordi det giver en ex vivo feeder-fri humaniseret miljø for hPSC formering uden yderligere eksogene syntetiske substrater. Fremtidige retninger efter mastering denne teknik kan anvendes på dyr og kliniske undersøgelser af produkter afledt af hPSCs dyrket i hPCCM, og til at bestemme de mekanismer, der påvirker spredningen og fastgørelse af hPSCs. Dette er den første detaljerede protokol for en vellykket udbredelse af hPSCs i hPCCM. Især kan denne protokol åbne nye horisonter i stamcelleforskning og yderligere undersøgelser vedrørende dets applikationer og tilhørende resultater er berettiget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne angiver nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., lektor, Institut for Obstetrik og Gynækologi, Medical College Korea Universitet) for at levere placenta væv. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud (R1211902) fra Grundforskningsfonden Korea (NRF), Republikken Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
