Protocol
Etik bildirimi: İnsan plasenta çalışması Kore Üniversitesi (AN09085-001) insan araştırma için Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, ileriye dönük olarak. Tüm deneyler Kore Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Temiz Germ-Alerjik Oda tesis yapıldı. deneysel tasarım ve hPSCs kullanarak prosedürleri Kore Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (AN12277-003) tarafından onaylanmıştır.
Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık
- % 0.1 jelatin ile kaplayın tüm kültür yemekleri. Otoklav fosfat tamponlu tuz (PBS) ve forseps. Birden fazla 15 dakika £ 15 psi altında 121 ° C 'de, cerrahi makas, mikrosantrifüj tüpleri, gazlı bez sterilize edin.
- Hazırlanan önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-etilen amin tetra-asetik asit (tripsin-EDTA) ve önceden ısıtılmış, süzülmüş kültür ortamı (DMEM)% 20 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin içeren ve 100 ug / ml streptomycprosedürleri başlamadan önce.
Insan plasentasından 2. Hücre İzolasyonu
- Yazılı onam alındıktan sonra gebelik 7-32 haftalık normal veya terapötik kürtaj geçiren sağlıklı gebe kadınların sezaryen doğumdan sonra plasenta dokusu, edinin.
- Plasenta obstetrik uzman cerrahi ayrı insan plasenta koryonik plakaları (HPC) var; 20 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA, bu inkübe, ve daha sonra 5 ml PBS ile yıkayın.
- Makas kullanarak HPC gelen koryonik villus izole edin; villus kıyma ve 1ml PBS ile onları üç kez yıkayın. Ufalamadan sonra bir pipet kullanarak bir mikrofüj tüpü içine koryonik villi yer; aşağı yukarı pipetleme ve 500 ul PBS ile numuneler yıkayın ve 3 dakika boyunca 120 xg için tüpler santrifüj. Önceden ısıtılmış kültür ortamında 500 ul iki kez dokuları yıkayın.
- 37 ° C 'de, jelatin-kaplanmış plakalar üzerinde ortam içinde kültür hücreleri,% 5 CO2 içinde
- Üçüncü pasaj kadar her 2-3 günde bir orta değiştirin. Kültür sırasında, kültür ortamı içinde yüzen hücre birikintilerinin ayrılmasıyla; büyüyen plasental fibroblastlar plaka eklenecektir. Kültür daha sonra 10. geçide HPC kadar elde edilen ve fibroblast-benzeri hücreler tripsinizasyon ve mitomisin-C (10 ug / ml) tedavi sonrası HESC kültürleri için hasat.
- Hisse senedi örnekleri olarak HPC dondurmadan önce, HPC genellikle (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginin, M mikoplazma dahil plasentayı, enfekte patojenler ile kontamine olmadığını teyit etmek için ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanımı . Orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,ve M. capricolum) ve bakteriyel türler, Ureaplasma urealyticum, bir mikoplazma belirleme kiti kullanılarak.
- RT-PCR gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun kitte sağlanan tüm primerler ve karışımları kullanmak. Mycoplasma tespiti için 36 gün süre ile kültive edilmiştir hücre süpernatantlar kullanın. PCR karışımı, bu örneklerin 3 ul ekleyin ve 30 saniye, 2 dakika için 55 ° C ve 1 dakika süre ile 72 ° C'de her biri 94 ° C kapsayan 35 çevrim için 1 st PCR prosedürü uygulayın.
- Dikkatle PCR karışımı 1 st PCR ürünü, 0.5 ul ve daha önce olduğu gibi aynı şartlar kullanılarak 30 çevrim için 2. PCR prosedürü uygulayın. % 1 agaroz jel elektroforez işlemi aracılığı ile amplifiye ürünlerin analiz; jeller 1 ve 2. PCR ürünlerinin her birinin 10 ul geçerlidir.
- HPC patojenler ile kontamine olduğu tespit edilmiştir, bu ortadan kaldırmaküreticinin talimatlarına göre, bir antibiyotik kombinasyonu (BM-siklin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 3 gün BM-siklin 1 10 ug / ml ihtiva eden yeni ortam ekleyin ve daha sonra başka bir 4 gün için 5 | ig / ml BM-siklin 2 ile hücreleri tedavi. Iki kez bu döngüyü tekrarlayın ve sonra tekrar Mycoplasma kirlenme kontrol edin.
3. Hasat İnsan Plasenta türetilmiş hücreler Orta (hPCCM) Klima
- Kirlenme hariç sonra, bağlanmış hücreler (85-90% konfluansa tedavi (1.5 x 10 7 hücre / 2 saat ve 30 dakika boyunca mitomisin-C (10 ug / mi) ile bir şişe) ve 10 ml hücreler üç kez yıkandı PBS ile yıkandı. 24 saat, mitomisin-C olmayan önceden ısıtılmış ortam ile inkübe hücreleri.
- Bir gün tedaviden sonra, 10 mi ortam içinde hücrelerin inkübe (DMEM-F12,% 20 nakavt serum Değiştirilmesi [KOSR] ile takviye edilmiş, 0.1 mM β-merkaptoetanol,% 1 NEAA ve% 1 penisilin-streptomisin). 15 ml konik bir tüp içinde 24 saat inkübasyon, hasat CM sonra ve0.22 um şırınga filtresi kullanılarak cm filtre.
- Yeni orta ve inkübasyon bir 10 ml ekleyin. 1 hafta boyunca her gün kültürlerden tüm süpernatantlar toplayın ve -80 ° C'de hasat aracı madde dondurularak. Tekrarlanan donma-erime döngülerinden kaçınmak.
4. Kültür İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) ve Pluripotent Kök Hücre İndüksiyon (iPSCs)
- İnsan embriyonik kök hücre hatları elde etmek, (sırasıyla, isim WA01 ve WA09 altında NIH HESC kayıt defterinde listelenen) H1 ve H9 hücreleri ve uyarılmış pluripotent kök hücre-iPSC-1: iPS (sünnet derisi) -1 ve iPSC-2 (IISH1i- WiCell Araştırma Enstitüsü (Madison, WI, ABD) BM). Hücreler, üreticinin talimatları izlenerek çözündürüldükten ve kültüre olmalıdır.
- Kontrol grubu için, 37 ° C 'de yaygın olarak kullanılan besleyici içermeyen ve serum içermeyen tanımlanmış bir kültür ortamı içinde Bazal Membran Matrisi-kaplı kaplar üzerinde ve% 5 CO2 kültür hücreleri. Başlangıçta, hPSCs 80-100 kümeleri tohum in 35 mm yemekleri. 70-80% izdiham ve rutin geçiş hücreleri kadar bu yemekleri hücreleri büyümek alt kültüre, her 5-6 günde bir, mekanik veya enzimatik yöntemler (Dispase) kullanarak. Ortam ile hücreler iki kez yıkanır ve 1 arasında bir oranda bunların plaka: 4 arasındadır. Her gün taze ortam ile orta değiştirin.
- Deney grupları için, yemekler hPCCM kültür hücreleri ya mekanik ya da enzimatik olarak,% 0.1 jelatin ile ön-kaplanmış ve bir kez 5 günde, rutin ile gerçekleşen pasajlanmasını da yerine getirir. 6-1: 10: 1 aralığı içinde oranlarında plakası hücreleri. hPSCs transferden sonra 2 gün içinde jelatin ekleyin. Günlük taze ortam ile orta değiştirin.
İnsan Pluripotent Kök Hücre 5. Karakterizasyonu
Not: alkalin fosfataz boyama, İmmünositokimya, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve western blotting gibi çeşitli yöntemler kullanılarak hPSCs karakterize eder.
- İmmünfloresan boyama
- Immunofluorescenc içinE boyama, kültür hPSCs% 4, 10 dakika boyunca (ağırlık / hacim) paraformaldehid ile 8 oyuklu kayıcı odaları hücreleri gidermek; Daha sonra, (v / v) Triton-X100, 15 dakika boyunca, ve% 0.1 içeren PBS içinde% 3 (h / h), normal at serumu ile 1 saat boyunca bloke edilir (h / h),% 0.1 ile hücrelerin geçirgen Tween 20. Her adım arasında 5 dakika boyunca iki kez PBS yıkayın.
- 4 ° C 'de ve sekonder antikor ile O / N: Primer antikor (1000 1 Ekim-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 seyreltme) ile inkübe hücreleri.
- Montaj önce, karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile hücrelerin inkübe edin. Yıkama hücresi sıkı karanlıkta her kuru hücrelerin tamamen 5 dakika için üç kez. Floresan montaj ortamına hücreleri korumak ve flöresanlı bir mikroskop altında gözleyin.
- Mah-PCR
- Üreticinin talimatlarına göre bir RNeasy Mini kiti kullanılarak hücrelerden toplam RNA izole ve Nano Bırak Spektrofotometre kullanılarak ekstre RNA ölçmek. 20 ul reaksiyon karışımı ihtiva eden oligo toplam RNA 2 ug ekleyerek cDNA sentez (dT) primerleri ve Superscript II ters transkriptaz; Bu prosedürde üreticinin talimatlarına uyun.
- IQ SYBR Green qPCR Master Mix ve Ek Tablo S1 tarif edilen primer sekanslar kullanılarak, bir Bio-Rad iCycler iQ sistemi ile sentezlenen cDNA yı çoğaltmak. Gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kişilerce ilgi genlerinin döngüsü eşik değerlerini normalize.
- Alkalen fosfataz (AP) boyama
- Üreticinin protokolüne uygun olarak, ES hücre Karakterizasyonu Kiti kullanılarak AP aktivitesi algılar.
- 5. günde, ortam aspire ve 12 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile hPSCs düzeltin. Overfix etmeyin; daha uzun bir süre, 2 dakika için hücrelerin sabitlenmesi alkalin fosfataz inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır. Fiksatif aspire ve 1x Durulama Tampon ile durulayın. Yapamazkuyu adımları arasında kurumasını bekleyin.
- Her çukurun (35 mm çanak oyuk başına 1 mi) karşılamak için yeterli boyama solüsyonu ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, 1x Durulama Tamponu ile bulaşıkları yıkama. 1x PBS ile Kapak hücreleri kurumasını önlemek ve Olympus mikroskop kullanılarak boyanan hücrelerin incelenmesi ve görüntü için.
- Western Blot
- Daha önce 9'da tarif edildiği gibi Western blot analizi yapın. Kısaca, hücre lizatları içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel ile ilgili protein eşit miktarlarda gidermek ve poliviniliden flüorür (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın.
- Leke Blok ve 4 ° C'de farklı primer antikorlar ile G / Ç N o prob; Daha sonra 1 saat HRP-konjuge sekonder antikor ile leke inkübe edin. 10 dakika inkubasyon arasındaki her zaman için membranı üç kez yıkayın. Bir ECL reaktifi kullanılarak sinyalleri algılar.
- Kısa tekrar dizisi (STR) analizi
- hPSCs aynı pasajda de deney ve kontrol grupları toplandı. Genomik DNA üreticinin talimatlarına göre, bir DNA Mikro kiti kullanılarak ekstre edilmiştir.
- Üreticinin talimatlarına ve kapiler elektroforez göre AmpF / STR PCR Amplifikasyonu kiti kullanılarak 16 farklı genetik lokus için genomik DNA'yı büyütmek Genetik Analiz cihazı kullanılarak gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu hPSC yayılım yöntemin bir avantajı insan hücrelerinden salgılanan bileşenleri kullanmasıdır. Protokolde en çok ciritical aşama insan plasentası türetilen hücrelerin izolasyonu ve kültürü. Bu gerektirir ve HPC plaka villus kesin bir kısmından doğru diseksiyon. 1 insan plasenta kaynaklı hücre izolasyonu için prosedürü göstermektedir. Bu işlem, basit ve hücrelerin izolasyonu için uygun olan ve kolay 1 saat içerisinde gerçekleştirilebilir. Şekil 2'de tarif edildiği gibi, doku sağlam filizlenmiş jelatin kaplı tabak ve fibroblast-benzeri hücrelere eklenmiş. Tripsinizasyon ile pasajlar sırasında enkaz ve çürümüş dokuların çıkarılması hücrelerinin seçimine izin verir ve homojen bir kültür sağlar. Bu hücreler, kontaminasyon olmaması onayladıktan sonra bir hPSC proliferasyonu için koşullandırılmış ortam üretmek için kullanılabilir. Optimal koşullar, hücreler% 80-85 ortak akışa kadar büyümeye bırakıldı olanlar olarak tanımlanmış olan bu inci sonrae büyümesi yapay (veriler gösterilmemiştir) durduruldu.
besleyici hücreler ya da sentetik matrisler üzerinde kültürlenmiş hPSCs hPCCM jelatin kaplı tabaklara transfer edilebilir. 3 hPSC hattı Matrigel kaplı plakalar (Şekil 3A ve B) için gözlenene benzer bir seviyede hPCCM muhafaza edilebileceğini göstermektedir. % 0.1 jelatin, şimdiye kadar hPSC kültür uesd edilmemiştir. Bizim koşullarda, hPSCs genişletilmiş kontrol grubunda hPSCs benzer pluripotensini muhafaza. HPCCM hPSC kültürü için, diğer matrisler erişilebilir olduğunu doğrulamak için, hPSCs laminin, vitronektin ve non-kaplı kaplar üzerinde alt-kültürlenmiştir. hPSC eklenmiş ve Laminin ve vitronektin-kaplı kaplar üzerinde hPCCM büyüdü. Ancak, birkaç geçişten sonra, birçok koloniler ayırt edildi ve jelatin kaplı grup benzemeyen, korumak vermedi. Olmayan kaplı tabaklara transfer edildikten sonra, herhangi bir ek hPSCs (Şekil 3C) için gözlenmiştir. C ilaonfirm hPSCs hPCCM uzun süreli kültürden sonra kontrol grubuna genetik olarak özdeş olduğu, her iki grupta da paralel bir şekilde kültürlendi hPSCs 16 genomik lokus (Şekil 3D ve E) için kısa ikili tekrar (STR) tekniği kullanılarak analiz edilmiştir.
HPSCs ex vivo kültürü ile ilgili bir yaygın kabul gören bir kavram bFGF kendini yenileme desteklemek için gerekli olmasıdır. BFGF yokluğunda, hPSCs kendi kendini yenileme yeteneğini kaybeder ve 12,13 ayırt. HPCCM durumunda, hPSCs kendi kendini yenileme yeteneğini kaybeder ve stabil uzun süreli kültür (Şekil 4A - C) sırasında pluripotency belirteçler ifade vermedi.
3 germ hücrelerine farklılaşma yeteneği hPSCs eşsiz bir iç özelliğidir. Her hPSC Bu yetenek korunması doğrulamak için test edilmelidir. Şekil 5'te gösterildiği gibi, hPSCs kendiliğinden hücreye farklılıkhPCCM içinde indüksiyon 2 hafta (Şekil 5A ve B) sonra 3 germ s. Bu veriler, hPCCM klinik kullanım için uygun olduğuna işaret etmektedir.
hPSC aktarımı sırasında jelatin kaplı kaplar üzerinde bağlanma süresi, hPSC yayılma için ticari olarak sentetik matrisler ile kaplanmış tabaklar üzerinde daha uzundur. Genellikle hücreler. Sentetik yüzeyler ile kaplandıktan sonra bir gün içinde bağlı% 0.1 jelatin ve kontrol plakaları üzerinde 6 göstermektedir eki Şekil. 24 saat sonra, alt-kültürlenmiş hPSCs kontrol (Şekil 6A) üzerine daha jelatin üzerinde biraz daha fazla bağlı. hPSCs dikkatle ele alınmalıdır. 48 saat sonra, hPSCs tamamen bağlanmış ve jelatin kaplı kaplar (Şekil 6B) üzerine genişleme başlandı. Ayrıca, hPSCs jelatin üzerinde alt-kültür (Şekil 6C) 5 gün sonra etkin ve oluşan paketlenmiş koloniler büyümesi ortaya çıktı. HPSCs dikkatli Terbiyede için ek süre boyuncat önemli olduğunu ve hayatta kalma ve kendini yenileme etkileyebilir. HPCCM koşullarda 48 saatlik bir süre kuvvetli bir hPSCs bağlanması için tavsiye edilir.
Şekil 1: İnsan plasentası koryonik çıkıntı Hücre izolasyonu (A) Taze plasental koryonik doku tripsinizasyon sonra PBS içinde yıkandı.. (B) villus sterilize cerrahi makas kullanarak parçalar halinde kesildi. (C) Villi artıkları ve damarları çıkarmak için PBS içinde birçok kez yıkandı. (D - D) villi, bir mikro santrifüj tüpüne transfer edilmiştir (en fazla) kıyılmış ve yıkanmıştır. (F) Dokular, bir masa üstü santrifüjü kullanılarak santrifüj edildi. (G) Bu proses, önceden ısıtılmış bir kültür ortamı içinde, PBS içinde üç kez ve iki kez tekrar edildi. (H) Hücreler ve dokular, bir önceden kaplanmış jelatin şişeye birlikte ekildi ve 5-7 gün süre ile inkübe edildi. Hücreler eklenmiş ve filizlenmiş.
Şekil 2: İnsan plasentası türetilmiş hücreler yetiştirme (A) izolasyondan sonra yaklaşık 1 hafta, filizlenmiş jelatin kaplı şişeler ve fibroblast-benzeri hücrelerin bağlı insan plasentası dokuları ve hücreleri bulunur.. İlk alt-kültür geçişi sonra (B), dokular çıkarıldı. ortamı her gün taze ortam ile değiştirildi. (C) bir üçüncü geçişten sonra, hücreler daha homojen ortaya çıktı. Ölçek çubukları:. 200 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
es / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
Şekil 3:. Jelatin kaplı kaplar üzerinde hPCCM İnsan pluripotent kök hücreler, jelatin kaplı kaplar üzerinde hPCCM kültürlenen 13 pasajlar, hPSCs sonra, yüksek alkali fosfataz (AP) aktivitesini göstermiştir. (A), H1 ve iPSCs (Matrigel kaplı kaplar üzerinde mTeSR1) kontrol koşullarında kültürlenmiştir. (B) H1 ve iPSCs jelatin kaplı kaplar üzerinde hPCCM içinde kültürlenmiştir. Sol panel: parlak bir alan; Sağ paneli: alkalin fosfataz boyama. (C) H1 ve iPSC transfer ve karşılaştırma için çeşitli matris kaplı yemekler kültüre edildi. 5 geçitler hPSCs kültürlenmiştir sonra gösterildiği gibi. Laminin kaplı yemekler, vitronektin kaplı yemekler, sigara kaplı yemekler. (D - D) hPSCs için STR analizi, kontrol hPSCs kıyasla hPCCM kültürlenebilir. Ölçek çubukları:. 10 mikron Lütfen cBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak.
Şekil 4:. 14 pasajlar sonra SSEA-4, Ekim-4, Sox2, NANOG, TRA-1-60 ve TRA-1-81 karşı antikorlar İnsan pluripotent kök hücre çoğalma bFGF gerektirmez (A) H1 hücre immunofloresan boyama üzerinde hPCCM yemekleri jelatin kaplı. Ölçek çubuğu: 10 mikron. (B) RT-PCR analizi, deney ve kontrol koşullarında farklı hücre hatlarında stemness belirteçleri, Oct4, NANOG ve Rex1 ekspresyonunu ölçmek için kullanılmıştır. (C) Pluripotency belirteçlerinin protein ekspresyon düzeyleri, Oct4, Sox2 ve FGF2, western blot ile belirlenmiştir hPSCs içinde. Bu figur büyük halini görmek için tıklayınıze.
Şekil 5: in vitro pluripotensin analizi. (A) QRT-PCR analizi hPCCM koşullarında yetiştirilen stemness belirteçleri, Oct4 ve Nanog'un ekspresyonunu ve farklılaşmış hücreler üç germ tabakası markerlerinin ifadesi ve farklılaşmamış hücreleri ölçmek için kullanılmıştır. . Mezoderm, Nestin, SOX1: ektoderm, AFP, GATA3: endoderm grafikte görüldüğü gibi, ölçüm kontrol kültürü koşullarında (Oct4) T HNF3 β gözlenen ekspresyon düzeylerine normalleştirildi. Hata çubukları ± SD araçları göstermektedir. (B) H1 ve mezoderm bulunan 2 hafta (desmin), ektoderm (Tuj1) sonra embriyoid organları oluşmuş deneysel koşullar altında 10 pasajlar için kültüre edildi iPSC hatları,ve endoderm (AFP, GATA4), imüno-lekeleme ile ölçüldüğü gibidir. Ölçek çubukları:. 100 mikron, 200 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:. İki matris kaplı plakaları arasında hPSC eki karşılaştırılması H1 ve iPSC-1, farklı koşullara aktarılan% 0.1 jelatin hPCCM ve kontrol grubu alındı. (A) hPSC alt-kültürden sonra 1 gün. 2 gün hPSC alt-kültürden sonra (B). 5 gün hPSC alt-kültürden sonra (C). Ölçek çubukları:. 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu model, örneğin bFGF veya insülin gibi eksojen rekombinant büyüme faktörlerinin ilavesi olmadan insanlaştınlmış besleyici içermeyen kültür koşullarında özelliklerini muhafaza eden bir insanlaştırılmış mikroçevresinin hPSCs manipülasyonu sağlarken başarıyla hPSCs yaymak için geliştirilmiştir. Ekzojen bFGF takviyesi yaygındır ve Matrigel veya laminin gibi alt tabakalarının uygulanması hPSCs 14 besleyici içermeyen kültür için gereklidir.
Bu protokol, basit ve uygulanması kolaydır. Ancak, bazı adımlar onun başarısı için kritik öneme sahiptir. En önemli adım plasenta koryon hücrelerinin aseptik izolasyonu olduğunu. Plasenta için toplama yöntemleri sayesinde, örneğin mikoplazma gibi patojenlerin bulaşma riski yüksektir. Bu nedenle, hücrelerin izolasyonu sırasında patojen muayene ve yönetimi çok önemlidir. Buna ek olarak, tüm prosedürler, aseptik olarak gerçekleştirilmelidir. conditione toplanmasıİnsan plasenta hücreleri kültüründen d ortamı genellikle kolaydır. Onların işleme biraz zor çünkü Ancak, hPSC kültürlerde deneyim gereklidir. Bir başka önemli nokta olarak, bu protokolü kullanarak araştırmacı akılda tutmak gerekir bu protokolde hPSCs bağlanması için gereken zaman popüler kültür yöntemleri (yaklaşık 24 saat) daha (36-48 saat) daha uzun olması. Bu fark hPSCs canlılığı veya proliferasyonunu etkilemez. Aksine, Bu protokole göre kültürlenmiştir hPSCs büyümesi klasik protokoller kullanılarak kültürlenmiş hücrelerin daha daha sağlamdır.
Bundan başka, bu protokol nesilli farklılaşmasının indüklenmesi için uygulamalar vardır. Örneğin, embriyonik germ benzeri hücreler veya progenitör hücreler, insan bu protokolün uygulanması veya modifikasyonu ile yararlı hücrelere veya dokulara dönüşebilir. Bu farklı koşullarda belirli dışsal takviyeleri belirlemek için daha erişilebilir bir platform sağlar.Bu protokolün bir sınırlama plasenta edinimine hPCCM üretiminin bağımlılığıdır. Bu nedenle, sürekli insan plasenta kaynağına gerek yoktur.
Ilave ekzojen sentetik derz hPSC yayılması için bir ex vivo besleyici içermeyen insanlaştırılmış bir ortam sağlar, bu protokol, önemlidir. Bu teknik hakim sonra gelecek tarifi hayvan ve hPCCM kültüre hPSCs türetilen ürünlerin klinik çalışmalar tatbik edilebilir ve hPSCs proliferasyonu ve ek etki mekanizmaları belirlenmesi. Bu hPCCM bölgesindeki hPSCs başarılı yayılımı için, ilk ayrıntılı bir protokoldür. Özellikle, bu protokol kök hücre araştırma ve uygulamaları ile ilgili bulgular konusunda yapılan çalışmalara yeni ufuklar açabileceğini garantilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları gösterir.
Acknowledgments
Yazarlar plasental doku sağlamak için Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Doçent, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Medical College Kore Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK), Kore Cumhuriyeti hibe (R1211902) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
