Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

Summary

Relatamos melhorias significativas para a medição reprodutível de mutações somáticas de células-tronco colônicas após a exposição de camundongos a potenciais agentes prejudiciais ao DNA.

Abstract

A capacidade de medir mutações de células-tronco é uma ferramenta poderosa para quantificar em uma população de células crítico se, e em que medida, um produto químico pode induzir mutações que potencialmente levam ao câncer. O uso de um ensaio enzimático para a determinação de mutações de células estaminais no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato ligado ao X foi previamente relatada. ¹ Este método requer a preparação de secções congeladas e incubação do tecido seccionado com uma mistura de reacção que produz um cor azul, se as células de produzir uma enzima funcional da desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PD). Se não, as células parecem esbranquiçado. Modificou-se a mistura de reacção óptima utilizando o Composto Temperatura de corte (OCT) forma em lugar de álcool de polivinilo. Isto facilita a medição de pH, aumenta a solubilização dos componentes de coloração G6PD e restringe a difusão da enzima G6PD. Para demonstrar que a mutação ocorreu em uma célula estaminal, toda a cripta tem falta de G6PD enzimáticaactividade. Somente se uma célula-tronco abriga uma mutação G6PD fenotípica serão todos da descendência na cripta falta atividade enzimática da G6PD. Para identificar criptas com uma mutação de células-tronco, quatro cortes congelados adjacentes consecutivos (um nível) foram cortados em 7 mm espessura. Esta abordagem de fazer cortes adjacentes conformação que proporciona uma cripta foi completamente mutado desde o mesmo cripta mutado será observado nas secções adjacentes. As lâminas com amostras de tecido que eram mais do que 50 mm de intervalo, foram preparados para avaliar um total de> 10 ⁴ criptas por rato. A frequência de mutação é o número de mutantes (branco) criptas ÷ observados pelo número de tipo selvagem (azul) criptas em um grupo de tratamento.

Introduction

O cancro do cólon é pensado para envolver exposição a agentes ambientais e componentes da dieta que podem danificar DNA e produzir mutações ativadoras somáticas em oncogenes (por exemplo, ß-catenina) ou inativação de mutações em genes supressores de tumores (por exemplo, a APC). Supõe-se que estas mutações ocorrem em críticos células estaminais do cólon. Devido à arquitectura única cripta do epitélio do cólon, é possível medir as mutações de células estaminais no cólon após a exposição dos animais a produtos químicos associados com a carcinogénese do cólon. Várias enzimas ligadas ao cromossoma X pode servir como indicadores de mutações que ocorrem e....

Protocol

Os procedimentos experimentais e tratamento ético dos animais foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh IACUC (protocolo nº 1104674).

1. Preparação de G6PD Coloração Mistura

NOTA: Certifique-se de que a concentração final de cada um dos reagentes é a seguinte; 5 mM de glicose-6-fosfato (G6P); NADP 2 mM, 5 _mM de MgCl2, 0,35 mM de 1-metoxi-5-methylphenazinium sulfato de metilo (MMPMS) e 0,8 mM de NBT ^1,8,9 Para cada reagente a concentração inicial foi derivado para um volume final de 40 ml.. As soluções foram preparados e utilizados a cada dia.

1. Adicionar 2 ml de mM pH 7,4 tampão de fosfato 200 (PB....

Results

A capacidade de medir mutações de células-tronco de cólon em animais oferece uma maneira única de correlacionar mutações para indução de cancro. Normalmente, presume-se que o passo crítico na carcinogénese envolve a activação de mutações em oncogenes e / ou inactivação de mutações em genes supressores de tumores. Nós injectados ratinhos C57BL / 6 com 200 ul de PBS ou 10 mg / kg OMA em 200 ul de PBS. OMA é uma substância cancerígena conhecida cólon. ^5-7 Aos 90 dias os dois pontos foram analisados ​​para mutaçõ.......

Discussion

Muitas vezes a efeitos genotóxicos de um composto é determinada pela sua capacidade de modificar o ADN. Isso normalmente é feito pelo isolamento do tecido e medindo o nível global do adutos de DNA. Para AOM, isso envolveria quantificar O ⁶ -metilguanina adutos no cólon. Usando esta abordagem informações sobre os danos dentro tipos celulares específicos, tais como no nicho de células estaminais, é perdido. Além disso, um produto de adição de ADN não é o mesmo que uma mutação uma vez que apenas um pequeno subco.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagentes
nitroazul tetrazólio
NADP
glicose-6-fosfato
1-metoxi-5-metilfenazinium metil sulfato
dimetil formamida
pH 7,4
Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT)
Equipamento
microscópio de luz equipado com câmera
criostato
sala quente