Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

Resumo

Descritos são protocolos para quantificar interações mecânicas entre células aderentes e substratos microestruturados. Essas interações estão intimamente ligadas a comportamentos celulares essenciais, incluindo migração, proliferação, diferenciação e apoptose. Os protocolos apresentam um software de análise de imagem de código aberto chamado MechProfiler, que permite a determinação das forças envolvidas para cada micropost.

Resumo

Substratos de cultura de células com micropostes flexíveis integrados permitem que o usuário estude as interações mecânicas entre as células e seus arredores imediatos. Particularmente, as interações célula-substrato são o principal interesse. Hoje, as matrizes de micropós-produção são um método bem caracterizado e estabelecido, com uma ampla gama de aplicações que foram publicadas na última década. No entanto, parece haver uma reserva entre os biólogos para adaptar a técnica devido ao longo e desafiador processo de fabricação de micropostes, juntamente com a falta de software facilmente acessível para analisar imagens de células interagindo com micropostes.

A leitura de força de microposts é surpreendentemente fácil. Um microposte age como uma mola com a célula idealmente presa em sua ponta. Dependendo do tamanho, uma célula aplica força de seu citoesqueleto através de um ou vários pontos de adesão focal ao microposte, desviando assim o microposte. A quantidade de deflexão se correlaciona diretamente com a força aplicada em direção e em magnitude. O número de micropostes cobertos por uma célula e os padrões de pós-deflexão são característicos e permitem a determinação de valores como força por pino e muitos parâmetros biologicamente relevantes que permitem o "perfil mecânico" dos fenótipos celulares.

Um método conveniente para o mecano-profiling é descrito aqui, combinando a primeira geração de microposts disponíveis comercialmente prontos para uso com um pacote de software desenvolvido internamente que agora está acessível a todos os pesquisadores. Como demonstração de aplicação típica, imagens únicas de células de câncer ósseo foram tiradas em microscopia de campo claro para perfil mecânico de modelos de linha celular de metástase. Essa combinação de sensores de força de tração comerciais e software de código aberto para análise permite, pela primeira vez, uma rápida implementação da técnica de micropós-array em trabalhos de laboratório de rotina feitos por usuários não especialistas. Além disso, um processo de análise robusto e simplificado permite que um usuário analise um grande número de imagens de micropós-produção de maneira altamente eficiente em termos de tempo.

Introdução

Ensaios baseados em células sensíveis de Mecano-permitir que células aderentes para investigar, com uma ampla gama de aplicações, que reflectem o papel central que a mecânica pode desempenhar na biologia celular. Estas aplicações costumam se concentrar sobre os mecanismos subjacentes que impulsionam processos subcelulares ou comportamento de células inteiras. Por um lado, os factores ambientais externos tais como a composição da matriz extracelular ou a rigidez da matriz pode afectar dramaticamente a resposta mecânica e biológica de uma célula. ¹ O mesmo pode ser observada após a utilização de diversas classes de compostos farmaceuticamente activos, os efe....

Protocolo

1. As células de cultura em micropost matrizes

Nota: Todas as etapas devem ser executadas em um gabinete de biossegurança para garantir a esterilidade. Os volumes dadas aqui são para T25 frascos de cultura celular. A cultura de células meio de receita e semeadura de células densidade são otimizados para linhas celulares de cancro do osso HuO9 e M132.

1. Preparar uma cultura de células para a semeadura em uma matriz micropost.
   1. Inspeccionar a qualidade de cultura de células, colocando o frasco de cultura sobre um microscópio de luz padrão. Certifique-se de que as células mostram um crescimento e morfologia típicas por estim....

Resultados

A principal vantagem da técnica descrita reside na sua simplicidade e potencial para integração rápida e eficaz para o trabalho de laboratório de rotina. A combinação de alta qualidade conjuntos de sensores comerciais combinados com software de código aberto fornece informações sobre mecano-sensibilidade que seria de outra forma exige o acesso a instalações de salas limpas e conhecimento em profundidade de análise de imagem e desenvolvimento de software. A figura 1 ilustra o fluxo de trabalho do método .......

Discussão

Este trabalho visa avançar no campo da microscopia de força de tração, diminuindo substancialmente os obstáculos técnicos e práticos à entrada. Estas barreiras vêm de dois lados. Primeiro e mais importante são os inúmeros desafios técnicos não triviais que devem ser superados para a fabricação reprodutível e comissionar uma matriz micropost experimentalmente. Em segundo lugar, é a necessidade de forma semelhante não trivial para uma análise semi-automatizado de confiança de forças de células únicas - tendo em mente que .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de cultura de células T25	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0,5% Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400054
Médio DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS América do Sul	Life Technologies	10270106
Penicilina-Estreptomicina 100x	Sigma	P4333
Frascos de centrífuga de 15 ml	Sarstedt	62.554.502
Matriz de micropostes pré-revestida com Colágeno I/Fibronectina	MicroDuits	MPA-col1/FN	Dimensões do microposte: Ø=6.4  µ m, l = 18,2 µ m; grade = 13 µ m, kcorr=2.87  nN/µ m
Etanol abs p.A.	Merck	100.983
Placa de 12 poços	Nunc	150628
Solução de formalina, tamponado neutro 10%	Sigma	HT5011
Azul brilhante G-250	Sigma	27815	Azul de Coomassie
Metanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Ácido acético	Sigma	695092
prato de fundo de vidro	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm de diâmetro, abertura 22  mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Microscópio invertido
D3-L3	Nikon	n/a	Câmera controler
DS Fi2	Nikon