Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Resumo

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Resumo

Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela secreção de matriz extracelular e são um componente essencial de muitos órgãos e tecidos. Fibroblastos fisiologia e patologia subjacente um espectro de entidades clínicas, incluindo fibroses em múltiplos órgãos, cicatrizes hipertróficas seguintes queimaduras, perda da função cardíaca após isquemia, e a formação de estroma cancro. No entanto, os fibroblastos continuam a ser um tipo de célula mal caracterizada, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. Métodos para o isolamento de fibroblastos existentes requerem tempo em cultura de células que influencia profundamente o comportamento das células e fenótipo. Consequentemente, muitos estudos que investigam a biologia de fibroblastos confiar manipulação in vitro e não capturar com precisão o comportamento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, desenvolveu-se um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos a partir de pele dorsal de ratinhos adultos que não necessita de cultura de células, assim preserving a transcrição fisiológico e proteômica perfil de cada célula. Nossa estratégia permite a exclusão de linhagens não-mesenquimais através de um portão negativo linhagem (Lin ^-) em vez de uma estratégia de seleção positiva para evitar a pré-selecção ou enriquecimento de uma subpopulação de fibroblastos expressando marcadores de superfície específicos e ser o mais abrangente possível através deste heterogêneo tipo de célula.

Introdução

Os fibroblastos são frequentemente definidas morfologicamente como células fusiformes que aderem aos substratos de plástico. Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela síntese e remodelação da matriz extracelular em embrionárias e adultas órgãos ^1. Os fibroblastos são, portanto, essencial para o desenvolvimento dos mamíferos e contribuir substancialmente para o meio extracelular, que influencia o comportamento do vizinho tipos de células presentes em cada tecido e órgão.

Os fibroblastos são também o tipo de célula principal por trás de um conjunto diversificado de condições médicas que causam enorme fardo clínico. Actividade patológica de fibroblastos prejudica a função do tecido normal e inclui tecido e fibrose dos órgãos (tais como fígado e pulmão), a cicatrização a seguir a cicatrização cutânea da ferida, aterosclerose, esclerose sistémica, e a formação de placas de ateroma após a lesão do vaso sanguíneo ^2-5. Cicatrização de feridas em particular, tanto de forma aguda e crônica, envolve deposition de tecido cicatricial que nem se assemelha nem funções como o tecido normal circundante ele, e leva a morbidade significativa em diversos estados patológicos. Após lesão, existe uma transição de fibroblastos para miofibroblastos, em seguida, que segregam os componentes da ECM estruturais, exercem efeitos parácrinos em tipos de células vizinhas, e restabelecer a estabilidade mecânica através do depósito de tecido cicatricial ^6.

Em tecidos cutâneos existe variação significativa na qualidade de reparação de feridas através do tempo de desenvolvimento e entre os locais anatômicos. Nos dois primeiros trimestres de vida do feto cura sem cicatrizes; No entanto, a partir do terceiro trimestre e em toda a vida adulta, cura dos humanos com uma cicatriz. , Para além específica para a idade, cicatrização de feridas em diferenças existem específica do local. Feridas na cavidade oral remodelar com formação de cicatriz mínima ^7,8, enquanto a deposição de tecido cicatricial dentro de feridas cutâneas é significativa ^9. A controvérsia persiste concerning a influência relativa do ambiente contra as propriedades intrínsecas dos fibroblastos locais sobre os resultados da cicatrização de feridas em relação à idade e localização ^10,11. Dadas as diferenças significativas na cicatrização de rato oral versus derme cutâneas e embrionário antes (E15) vs. depois embrionário (E18) derme, é provável que existem diferenças intrínsecas nas populações de fibroblastos em determinadas idades e de desenvolvimento entre os vários locais anatômicos .

Em 1986, Harold F. Dvorak postulou tumores são feridas que não cicatrizam ^12. Dvorak concluir-se que os tumores se comportam como feridas no corpo e induzir a sua estroma através da activação da ferida resposta do hospedeiro de cura. Numerosos estudos têm investigado uma vez que a contribuição de fibroblastos para a progressão de carcinomas ^13-15, mas, como no caso da cicatrização de feridas, a identidade e origem embrionária dos fibroblastos que contribuem para o compartimento estromal da CA cutânearcinomas não foi adequadamente definido. A resposta a esta questão não tem relevância médica dada estudos recentes expondo a fibroblastos associado ao tumor como um alvo potencialmente eficaz para a terapia anti-câncer ^16.

Identificar e prospectivamente isolar linhagens de fibroblastos dotados de potencial fibrogenic in vivo é um passo essencial para efetivamente manipular sua resposta à lesão através de uma ampla gama de estados agudos e crônicos. Em 1987, Cormack demonstrou duas subpopulações de fibroblastos, uma residindo dentro de uma e a papilar na derme reticular ^17,18. Uma terceira subpopulação foi encontrado associado com folículos pilosos na região papila dérmica do folículo ^19,20. Quando cultivadas, essas diferenças subtipos de fibroblastos apresentam em potencial de crescimento, morfologia e crescimento / fator de citocinas perfis ^21-24.

Até o momento, estudos examinando fibroblastos eleterogeneity pela maior parte não caracterizar adequadamente a diversidade de desenvolvimento e funcional entre fibroblastos in vivo. Isto é, em parte, é um resultado de uma dependência de populações fibroblastos cultivadas e o efeito de homogeneização de cultura de células ou selecção positiva sobre a base de um receptor da superfície da auto não expresso por todos os fibroblastos ^25. Um estudo recente de nosso laboratório demonstraram um marcador de superfície profunda e mudança de transcrição em fibroblastos incultos cultivadas vs. isoladas pela metodologia de isolamento à base de FACS apresentada neste manuscrito ^26.

Subsequentemente, foi identificada uma linhagem de fibroblastos específica no interior da derme dorsal de murino e determinaram que esta linhagem, definida pela expressão embrionária de Engrailed-1, é o principal responsável pela deposição de tecido conjuntivo na pele dorsal. As funções de linhagem durante ambas as formas aguda e crônica da fibrose incluindo a cicatrização de feridas, formação de estroma câncer, eradiação induzida fibrose ^27. A caracterização de linhagens de fibroblastos distintas tem implicações críticas para terapias destinadas a modulação do comportamento fibrogenic.

Ao invés de usar protocolos existentes que se baseiam em manipulação in vitro, para obter o isolamento de células ^28,29, o protocolo de colheita (Figura 1) descrito aqui vai ajudar análises informativos rendimento de fibroblastos que capturam mais precisamente fenótipo e o comportamento in vivo.

Protocolo

Este protocolo segue métodos aprovados pelo Painel Administrativo da Universidade de Stanford em Laboratory Animal Care.

1. Digestão de murinos Derme

1. Eutanásia ratinhos por deslocamento cervical depois de anestesia com uma injecção intraperitoneal de cetamina 100 mg / kg + xilazina 20 mg / kg de acepromazina + 3 mg / kg.
   Nota: Várias idades e origens podem ser usados.
2. Raspar e depilar a pele dorsal. Aproximadamente 100.000 células podem ser isoladas a partir de um pedaço de pele dorsal 60 mm x 100 mm.
3. Mergulhe o mouse em etanol 70% e coloque em uma superfície limpa e estéril para secar.
4. Colher imediatamente a pele do rato dorsal usando tesouras de dissecção estéreis. Em camundongos fêmeas, evitar incluindo o tecido mamário.
5. A partir da base da cauda, ​​utilize uma pinça para tenda a pele e fazer um corte transversal antes de dissecar ao longo do plano supra-fascial.
6. Evitar cuidadosamente incluindo qualquer gordura subcutânea durante a colheitaa pele. Examine a pele colhidas para qualquer gordura subcutânea e cuidadosamente raspá-lo usando a ponta chanfrada de um bisturi.
7. Lavar a pele colhidas em betadine seguido de 5x lavagens PBS em gelo.
   Nota: É importante manter a pele tão perto quanto possível estéril para evitar contaminação.
8. Picar a pele usando lâminas de barbear e tesouras de dissecação em um prato estéril até que a amostra é de uma consistência uniforme com 2-3 mm peças.
9. Preparar tubos de 50 mL cónico contendo 20 ml de colagenase IV a uma concentração de 1 mg / ml em DMEM. Dividir a derme para os tubos na base de cinco ratinhos por tubo.
10. Agitar vigorosamente enquanto incubando amostras a 37 ° C durante 1 hora em banho-maria ou uma ou forno.
11. Retirar amostras da incubadora e passar através de uma seringa de 10 ml, sem uma agulha 3-5x num hote estéril.
12. Coloque as amostras de volta na incubadora a 37 ° C e agitar vigorosamente durante mais 30 min.
13. Em um capuz estéril, Pipetar as amostras cima e para baixo 3-5x com uma pipeta 10 ml. Pipetar a amostra através de um filtro de 100 um para um novo tubo de 50 ml.
14. Passa 20 ml de meio DMEM FBS a 10% através do mesmo filtro de maximizar o rendimento celular e levar o volume total a 40 ml. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
15. Remover o sobrenadante com uma pipeta de vidro estéril, tomando muito cuidado para primeiro remover a camada superior de gordura antes da restante sobrenadante.
    Nota: Esta etapa é fundamental para reduzir a contaminação dos adipócitos.
16. Ressuspender as pelotas em 20 ml de DMEM FBS a 10%.
17. Passar a suspensão de célula / meio DMEM por meio de um filtro de 70 um.
18. Lavar o filtro com 10 ml de DMEM FBS a 10% e centrifuga-se a suspensão foi filtrada a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
19. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de vidro estéril, mais uma vez tendo o cuidado de remover qualquer primeira camada de gordura restante.
20. Se há contaminação significativa de RBC (o sedimento é visivelmente vermelho), re-suspender as pelotasem 20 ml de tampão de lise ACK e incubar durante 5 min à TA. Caso contrário, pule para a etapa 24.
21. Adicionar um volume igual (20 ml) de tampão de FACS (PBS, 10% de FBS, 0,1% de azida de sódio), em seguida, misturar, e de lado manter uma alíquota de 5 ml, como um controlo não corado. Centrifuga-se o restante amostra a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
22. Remover o sobrenadante e colocar pellet no gelo. As células podem ser congeladas para baixo neste ponto, se o tempo de FACS não está disponível.

2. Isolamento de fibroblastos por FACS

1. Faça 500 mL de mistura de incubação de anticorpos para cada linhagem pellet. Para fazer isso, em primeiro lugar a adição de 475 ul de tampão FACS contendo ADNase (10 ug / ml) para um tubo, e em seguida, adicionando-fluororo conjugado CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), e EpCAM (1: 100) de anticorpos para alcançar a respectiva diluição para cada anticorpo.
2. Re-suspender cada sedimento em 500 ul de mistura de incubação de anticorpo e linhagem esta suspensão incubar em gelo durante 20 min.
3. Adicionar 5ml de FACS tampão contendo DNase (10 ug / ml) à amostra e misturar suavemente. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
4. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento de células com tampão de SCAF contendo 5 ml de ADNase (10 ug / ml) e centrifuga-se utilizando as mesmas condições que no passo 26.
5. Ressuspender o sedimento em tampão FACS contendo 500 ul de ADNase (10 ug / ml) e posto de lado de uma alíquota de 50 ul de controlo como um corante de viabilidade.
6. Adicionar corante de viabilidade de escolha para a amostra que permanece na concentração indicada para o corante escolhido.
7. Realizar análise FACS ³¹ e triagem para a viabilidade Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- células / EpCAM- (ver Figura 2A). Ordenar directamente em tampão de SCAF.

Resultados

A validade desta abordagem (Figura 1) foi verificada em um número de maneiras, que podem ser examinados em pormenor na nossa publicação recente ^27. Estes incluem imunocitoquímica de células classificadas e célula de massa e análise de transcrição única célula de células recém-ordenados. Classificando fibroblastos diretamente, em vez de depender de cultura com mais precisão capta a sua in vivo fenótipo. Usando uma abordagem de linhagem negativa depleção (Figura 2A), em vez de uma abordage...

Discussão

O protocolo descrito neste manuscrito oferece um meio para isolar fibroblastos pela triagem baseada em FACS, em comparação com os métodos existentes, o que quer para seleccionar uma subpopulação ou necessitam de tempo em cultura de células antes de análises subsequentes. O tempo necessário desde a colheita da pele para a triagem de fibroblastos é de cerca de 6 horas; No entanto, o número de ratos utilizados na colheita vai influenciar esta estimativa.

Vários pontos do protocolo requer um cui...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fórceps cirúrgico	Kent Scientific	INS650916
Micro-tesoura	Kent Scientific	INS600127
Solução de preparação de iodopovidona	Dynarex	1415
Nair (creme depilatório)	Church and Dwight Co.
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Elastase	Abcam	ab95133
DMEM	Life Technologies	A14430-01
Soro bovino fetal	Gibco	16000-044
Tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK)	Gibco	A10492-01
40 μ m filtros	Fisher Scientific	08-771-1
70 μ m filtros	Fisher Scientific	08-771-2
100 μ Filtros	Fisher Scientific	08-771-19
CD31	BioLegend	102421
CD45	BioLegend	103125
Tie2	BioLegend	124005
Ter-119	BioLegend	116233
EpCAM (CD326)	eBioscience	48-5791
DAPI	Invitrogen	D3571
iodeto de propídio (coloração de viabilidade PI)	BioLegend	421301

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