Method Article

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

DOI:

10.3791/53447

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March 1st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Abstract

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A engenharia de tecidos cardíacos humanos pode impactar fundamentalmente a descoberta terapêutica por meio do desenvolvimento de novos sistemas de triagem específicos de espécies que replicam a biofidelidade do miocárdio humano nativo tridimensional, ao mesmo tempo em que permitem um nível controlado de complexidade biológica e permitem o monitoramento longitudinal não destrutivo da função contrátil do tecido. Inicialmente, os tecidos cardíacos humanos projetados (hECT) foram criados usando toda a população de células obtida a partir da diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes humanas, que normalmente produziam menos de 50% de cardiomiócitos. No entanto, para criar modelos preditivos confiáveis do miocárdio humano e elucidar os mecanismos de interação heterocelular, é essencial controlar com precisão a composição biológica em tecidos projetados.

Para resolver essa limitação, utilizamos a classificação de células vivas para o marcador de superfície cardíaca SIRPα e o marcador de fibroblastos CD90 para criar tecidos contendo uma proporção de 3:1 desses tipos de células, respectivamente, que são então misturados e adicionados a uma solução de matriz à base de colágeno. Os hECTs resultantes são, portanto, completamente definidos em sua composição de matriz celular e extracelular.

Aqui descrevemos a construção de hECTs definidos como um sistema modelo para entender os mecanismos de interações célula-célula em terapias celulares, usando um exemplo de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana (hMSC) que estão atualmente sendo usadas em ensaios clínicos em humanos. A composição do tecido definida é imperativa para entender como as hMSCs podem estar interagindo com os tipos de células cardíacas endógenas para melhorar a função do tecido. Também é descrito um sistema de biorreator que cultiva simultaneamente seis hECTs em paralelo, permitindo o uso mais eficiente das células após a triagem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Engenharia de tecido cardíaco avançou muito na última década, com vários grupos editoriais resultados de tecidos totalmente funcionais, batendo feitos a partir de ambos os cardiomiócitos murinos 1-6 e, mais recentemente, derivadas de células-tronco miócitos cardíacos humanos 7-12. O campo de engenharia de tecido cardíaco é impulsionado por dois objetivos primários e essencialmente independentes: 1) para desenvolver enxertos exógenos que podem ser transplantados para não corações para melhorar a função 4-6; e 2) para desenvolver modelos in vitro para estudo da fisiologia e da doença, ou como ferramentas de rastreio para o desenvolvimento terapêutico 2,7.

Tridimensional de cultura de células (3-D) é considerado essencial para o desenvolvimento de ferramentas de rastreio da próxima geração, como a matriz 3-D reflecte um microambiente cardíaca mais natural do que a cultura de células em monocamada de 2-D tradicional; na verdade, alguns aspectos da biologia celular são fundamentalmente diferentes em 2-D culturas vs. 3-D 13,14 . Além disso, os tecidos cardíacos modificadas são construídas a partir de componentes completamente definidas: uma matriz extracelular, e uma população de células. Para tecidos cardíacos humanos modificados tradicionais, enquanto a composição da matriz extracelular (geralmente fibrina 9 ou colagénio 7,8,10) é rigorosamente controlada, a composição celular de entrada é menos bem definido, com toda a mistura de células a partir de uma diferenciação cardíaca dirigido de qualquer das as células estaminais embrionárias (ESC 7,9) ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC 10,12) sendo adicionado aos tecidos. Dependendo da linha celular específica e a eficiência da diferenciação protocolo usado, a percentagem de cardiomiócitos resultante pode variar de menos do que 25% a mais de 90%, o fenótipo de cardiomiócitos específica (isto é, ventricular-, atrial-, ou pacemaker-like) também pode variar, mesmo a fracção não cardiomiócitos pode ser altamente heterogénea 15,16 e alterar a maturidade do diferenciada m cardíacayocytes 17.

Trabalhos recentes em engenharia de tecidos cardíaco tem tentado controlar a população de células de entrada, quer com uma superfície repórter cardíaca linha de células estaminais embrionárias humanas, ou células 8 marcadores de 18 a ser usado para isolar o componente miócitos cardíacos da diferenciação. Embora inicialmente um tecido composto por apenas miócitos cardíacos parece ser o ideal, este não é de facto o caso; hects compostas unicamente de miócitos cardíacos deixar de compactar em tecidos funcionais, com alguns grupos encontrar uma proporção de 3: 1 de miócitos cardíacos: fibroblastos que produzem a maior força de contração 8. Usando vários métodos de seleção de células, incluindo marcadores de superfície para triagem de células vivas, é possível criar hects com populações de células definidas. Enquanto que os marcadores de células estromais não cardíacas têm estado disponíveis durante algum tempo, tal como o marcador de fibroblastos putativo CD90 19,20, marcadores de superfície de miócitos cardíacos foram mais difícilpara identificar. SIRPα foi um dos primeiros marcadores de superfície cardíacas identificados para os miócitos cardíacos humanos 18 e foi mostrado ser altamente selectiva para a linhagem cardíaca. Recentemente, descobrimos que double-ordenação para SIRPα + e CD90 - células produz cardiomiócitos quase puros, com o CD90 + população exibindo um fenótipo de fibroblastos-like (Josowitz, observações não publicadas). Com base nestes resultados coletados, aqui nós descrevem a criação hects usando um 3: Combinação 1 de SIRPα + / CD90 - cardiomiócitos e CD90 + fibroblastos.

A capacidade de projetar um tecido cardíaco humano completamente definida é essencial não só para a criação de ferramentas de rastreio robustas, mas também para o desenvolvimento de sistemas de modelo para investigar cell- emergentes e terapias cardíacas baseadas em genes. Em particular, as numerosas terapias celulares para a insuficiência cardíaca, utilizando tipos de células, incluindo células-tronco mesenquimais (MSC) 21 , as células estaminais e células cardíacas 22 mononucleares de medula óssea 23-25, foram testados em ensaios clínicos. Embora muitos dos resultados iniciais têm sido promissores 21,23,25, o benefício inicial, muitas vezes diminui ao longo do tempo 26-29. Uma tendência semelhante foi relatado em murino engenharia tecidos cardíacos, que apresentam um benefício funcional significativa, devido à suplementação MSC, mas o benefício não é sustentada durante a cultura de longo prazo 1. Subjacente ao desempenho abaixo do ideal é o nosso conhecimento limitado dos mecanismos que regem as terapias celulares. Uma compreensão mais profunda de como as células terapêutica exercer a sua influência benéfica, bem como potenciais consequências negativas das interações miócitos-nonmyocyte, permitiria o desenvolvimento de terapias melhoradas produzindo benefícios clinicamente significativa e sustentada, com efeitos colaterais mínimos, para pacientes com insuficiência cardíaca.

Aqui, descrevemos o uso de hects definidos para interrogComeram mecanismos da terapia à base de células. A composição do tecido controlada é essencial para identificar os fatores específicos que afetam o desempenho dos cardiomiócitos. Diretamente completando hects com o tipo de célula terapêutica de interesse (por exemplo, MSCs), pode revelar os efeitos sobre o desempenho dos miócitos cardíacos, como já demonstrado em ECTs de ratos 1.

O seguinte protocolo multi-passo começa com a diferenciação de células estaminais cardíaca dirigida, seguida de fabricação do bioreactor multi-tecido, e concluindo com uma descrição da construção do tecido e análise funcional. Nossos experimentos são realizados utilizando a linha de células estaminais embrionárias humanas NIH-aprovado H7 (hESC). No entanto, os protocolos seguintes também foram testados utilizando uma linha de células estaminais embrionárias humanas adicionais e três linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) com resultados semelhantes. Verificou-se que a eficiência na diferenciação de cardiomiócitos e sucesso no HECT fabricação pode ser dependente de células de linha, especialmente folinhas r hiPSC derivadas de pacientes individuais. Seguindo este protocolo, os dois pratos de 6 poços foram semeadas com um total de 1,68 milhões de hESCs (140.000 células por poço), que produz cerca de 2,5 milhões de miócitos depois diferenciar durante 20 dias e separação, o suficiente para fazer seis tecidos definidos.

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Protocol

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Nota: executar todas as manipulações de células em condições assépticas, usando uma câmara de segurança biológica filtrado HEPA-classe II e esterilizar todas as soluções, filtrando-os através de um filtro de 0,2 um. Realizar a construção de tecido e teste de função quer nas mesmas condições assépticas ou uma câmara de fluxo laminar.

1. Plantio de H7 hESCs em Preparação para Diferenciação Cardíaca

  1. (Dia 1) Preparação da membrana basal Matrix
    1. Descongelar 150 uL de aliquota da matriz da membrana basal qualificada células estaminais embrionárias humanas em gelo durante a noite a 4 ° C.
  2. (Dia 0-4) chapeamento de hESCs em placas revestidas
    1. Dilui-se a matriz descongelada em 12 ml de gelo-frio DMEM / F12 e misturar bem.
    2. Transferir 1 ml da solução / F12 de DMEM-matriz em cada poço de um de 6 poços de cultura de tecidos tratados prato. Cada alíquota de matriz pode revestir duas placas de 6 poços.
    3. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
      Nota: Nonossa experiência, placas revestidas seladas com parafina pode ser armazenado em solução de matriz, a 4 ° C durante até 10 dias antes da utilização.
    4. Em aproximadamente 75% de confluência, dissociar o H7 hESCs do prato de 10 centímetros utilizando 6 ml de reagente de dissociação não enzimática. Depois de 5 minutos, suavemente raspar as células a partir da superfície da cultura usando um raspador de células descartável e transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril.
    5. Remover 0,5 mL da solução de dissociação com as células a partir do tubo de 15 ml e de transferência para uma nova estéril 15 ml de tubo (deixando 5,5 ml do reagente de dissociação para dissociar ainda mais o hESCs) para a propagação de linha de células estaminais.
    6. Agregar as 0,5 ml de células a 300 xg durante 5 min a 20 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente em 8 ml de meio de células estaminais pluripotentes contendo uma penicilina-estreptomicina%, em seguida, transferir para um novo, revestido, de 10 cm de cultura de tecidos e manter a 37 ° C e 5% de CO 2 para manter a linha de células estaminais.
      Nota: Mantenha a mídia de células-tronco pluripotentes em gelo durante as mudanças de mídia.
    7. Enquanto isso, adicionar 5,5 mL de 10 mM de inibidor ROCHA Y-27632 para a dissociação de 5,5 ml de solução restante e continuar a incubar à temperatura ambiente durante mais 5-10 minutos. Misturar suavemente as células com uma pipeta de 5 ml serológico. Continue a incubar até obter uma suspensão de célula única é conseguido, em seguida, sedimentar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    8. Ressuspender as células em 5 ml de meio de células estaminais pluripotentes e executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro.
    9. Semente de cada poço da placa de 6 poços a uma densidade de 140.000 células por poço. Semente duas placas de 6 poços para criar um total de seis tecidos definidos. Dispor de quaisquer células remanescentes após o plaqueamento.
    10. Encha as bem para 1 ml com meio de células estaminais pluripotentes e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Vinte e quatro horas depois, remova a mídia e adicionar 2 ml de meio de células-tronco pluripotentes fresco a cada poço (Figura 1A ).
    11. Verifique a confluência das placas de cada dia e iniciar a diferenciação Uma vez que as células atingirem aproximadamente 75% de confluência (Figura 1B - D).

2. (dia 4-24) diferenciação de células estaminais embrionárias humanas para Cardiomyocytes 30,31

  1. (Dia 4-7, Diferenciação Dia 0-3) Mesoderma Indução
    1. Prepare meios RPMI diferenciação I (Tabela 1) por combinação de 500 mL de RPMI 1640 com suplemento de 10 ml de B27 (sem insulina) e 5 ml de solução de reserva de penicilina-estreptomicina (10000 UI / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina). Aliquota, em gelo, em tubos de 50 ml e armazenar a 4 ° C.
    2. (Dia 4, Diferenciação Dia 0) Prepare a mídia de indução mesoderme, adicionando 2,4 ul da CHIR99021 pequena molécula inibidor de GSK3 (estoque 10 mM, 6 mM de concentração final) a 12 ml de meios de diferenciação RPMI I. Remova a mídia de células-tronco pluripotentes de cada poço umaND substitua com 2 ml de meio de indução da mesoderme por poço. Retornar a placa para a incubadora.
      Nota: a morte celular significativa, tipicamente, com a adição de CHIR99021 (Figura 1E). A monocamada irá recuperar, mas é importante para lavar as células mortas de distância com a lavagem de DMEM / F12.
    3. (Dia 5, Dia Diferenciação 1) Preparar meio de indução mesoderme frescos como descrito acima. Remover os meios de idade a partir de cada cavidade e lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço. Adicionar 2 ml de meio de indução mesoderme fresco a cada poço.
      Nota: Lavar a cada dia desde o dia 0-10 aumenta consideravelmente o rendimento ea pureza dos miócitos cardíacos.
    4. (Dia 6, Diferenciação Dia 2) Remova a mídia de indução cardíacos e lave uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço. Substituir a lavagem com 2 ml RPMI media diferenciação I (há pequenas moléculas adicionado mas ainda com o B27 (sem insulina) suplemento) e retornar à incubadora.
  2. (Dia 13/07, Diferenciação Day 3-10) Cardiac Mesoderma Indução
    1. (Dia 7, Dia Diferenciação 3) Prepare meios de indução mesoderme cardíaca através da adição de 6 ul do inibidor de molécula pequena de Wnt IWR-1 (10 mM, 5? M final) a 12 ml de meio RPMI diferenciação I.
    2. Remova a mídia de cada poço, lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço e substituir com 2 ml de meio de indução mesoderme cardíaca por poço.
    3. (Dia 8, Dia Diferenciação 4) Preparar um adicional de 12 ml de meio de indução mesoderme cardíaca, tal como descrito acima. Remova o material adicionado no dia anterior, lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço e substituir com 2 ml de meio fresco diferenciação mesoderme cardíaca por poço e voltar para a incubadora.
    4. (Dia 10/09, Diferenciação Dia 5-6) Em ambos os dias, remova a mídia de indução mesoderme cardíacos e lavar cada poço com 1 ml de DMEM / F12.
    5. Adicionar 2 ml de meio fresco diferenciação RPMI I (há pequenas moléculas adicionado mas ainda com o B27 (sem insulina) suplemento)a cada poço e a placa de regresso para a incubadora.
  3. (Dia 11-24, Diferenciação Dia 7-20) HES-derivado Cardiac Organização miócitos / Maturação
    1. Prepara-se o meio RPMI diferenciação II (Tabela 1) por combinação de 500 mL de RPMI 1640 com suplemento de 10 ml de B27 (com insulina) e 5 ml de solução de reserva de penicilina-estreptomicina. Aliquota, em gelo, em tubos de 50 ml e armazenar a 4 ° C.
    2. (Dia 11, Dia Diferenciação 7) Remover RPMI meios de diferenciação (sem insulina) a partir de cada cavidade e lavar com 1 ml de DMEM / F12. Substituir com 2 ml de meio RPMI a nova diferenciação II (com a insulina) a cada poço e voltar para a incubadora.
      Nota: o batimento espontâneo deve primeiro ser observado entre os dias 7 e 10. Se bater não é observado durante este tempo, ele geralmente indica baixa eficiência diferenciação. O protocolo pode ser continuada até ao dia 15, em um esforço para observar surra, mas se nenhuma batida é observado por dia 15 é melhor starte uma nova diferenciação.
    3. (Dia 12-24, Diferenciação Dia 8-20) Todos os dias, retire a velha mídia de diferenciação e substituir com 2 ml de RPMI fresco media diferenciação II por poço para permitir a maturação celular e organização da monocamada batida (Figura 1F, Vídeo Figura 1 ).
      Nota: Dependendo da morte celular residual, pode ser necessário lavar com 1 ml de DMEM / F12 até ao dia 10 de diferenciação.

3. (Dia 24, Dia 20 Diferenciação) Isolamento de cardíacos miócitos e células semelhantes a fibroblastos

  1. Separar as Células da monocamada
    1. Remova a mídia de diferenciação e lave uma vez com 1 ml PBS.
    2. Dissociar as monocamadas com 1 ml da solução de dissociação enzimática (0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA) a cada poço.
    3. Mover placa na incubadora durante 10 min. Enquanto isso, adicionar 12 ul de inibidor ROCHA a 6 ml de solução de tripsina neutralização.
    4. gentlY adicionar 1 ml da solução de tripsina de neutralização que contém o inibidor ROCHA a cada poço da placa para neutralizar a solução de tripsina.
    5. Usando uma pipeta de transferência estéril, misture delicadamente cada poço para quebrar os aglomerados de células.
    6. Transferir todos os 12 ml a partir da placa de 6 poços para um tubo de centrífuga de 15 ml.
      Nota: Uma vez que duas placas de 6 poços são usados ​​neste protocolo, serão necessários dois tubos de 15 ml.
    7. Transferência de 3 ml de PBS a um poço da placa, e, em seguida, transferir sequencialmente os mesmos 3 ml a cada poço subsequente para recolher quaisquer células residuais sobre o prato. Transferir os restantes 3 ml a partir da última bem no mesmo tubo de centrífuga de 15 ml contendo as células.
    8. Pelete a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
  2. Prepare células de triagem de células vivas por FACS
    1. Preparar o tampão de coloração através da adição de 5 ml de Soro Fetal de Bovino a 45 ml de PBS em gelo com 50 ul de inibidor de ROCK.
    2. Retirar o sobrenadante do PEL céluladeixar (em 3.1.8) e ressuspender em 1,2 ml de tampão de coloração.
    3. Transferir 200 ul da suspensão de células a um, pré-arrefecido, 50 ml de tubo de centrífuga de novo em gelo. Este será o controle de coloração negativa.
    4. Transferir o restante 1 ml de suspensão de células a um, pré-arrefecido, 50 ml novo tubo de centrífuga em gelo e adiciona-se 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (diluição 1: 500) e 4 uL de CD90-FITC (diluição 1: 250) . Misturar suavemente a suspensão de células com uma pipeta de transferência e retornar para o gelo.
    5. Incubar tanto o controlo negativo e a amostra, num agitador basculante, sobre gelo, a 4 ° C durante 1 h.
    6. Prepare tubos de coleta de amostra por adição de 3 ml de meio RPMI (com insulina) para dois tubos de 15 ml de centrífuga. Adicione 3 ul de inibidor ROCHA a cada tubo e armazenar no gelo.
    7. Agregar as células coradas a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e lavar duas vezes com, pelo menos, 10 ml de PBS gelado por enxaguamento.
    8. Adicionar 1 mL de DAPI (1 ug / ml) a 5 ml de tampão de coloração. Suavementeressuspender o sedimento da amostra com 1-3 ml de tampão de coloração contendo DAPI utilizando uma pipeta de transferência.
    9. Adicionar 500 ul de tampão de coloração (sem DAPI adicionado) para o controlo negativo.
    10. Gentilmente filtrar tanto o controle negativo e amostras através de um filtro de 40 um celular para remover aglomerados de células e transferir para o poliestireno tubos de FACS em gelo. Imediatamente trazer amostras para o classificador de células.
    11. Semelhantes a células vivas estabeleceu os métodos de triagem 18, utilize o controlo negativo para definir as portas, selecione as células vivas (DAPI negativo) e recolher tanto o FITC + (ie, CD90 + fibroblastos) e PE / Cy7 + (ou seja, cardiomiócitos SIRPα + ) populações de forma independente a 20 psi (Figura 2).
      Nota: Depois de definir as portas, o controlo negativo pode ser fixado em 4% PFA para determinar a eficiência de diferenciação através da coloração de troponina-T.
      Nota: Alguns pesquisadores preferem usar umde controlo de isotipo, em vez de controlo não coradas para definir as portas, a fim de compensar a ligação não específica de anticorpos. Um controle chamado de fluorescência menos um (FMO) é outra possibilidade. Devido à distribuição bimodal clara do FITC, DAPI e sinais PE-Cy7, que fechado a partir da população positiva, conservadoramente visando longe no portão positivo, o que exclui, possivelmente, alguns verdadeiros positivos, mas ajuda a minimizar quaisquer falsos positivos.
  3. Reagregação celular em Preparação para Engenharia de Tecidos
    1. Após o tipo de células, a pelota ambos os tubos de recolha e ressuspender em 1 ml de DMEM contendo 10% de Soro Bovino neonatal, uma penicilina-estreptomicina% e 0,2% de anfotericina B ( "meios NBS").
    2. Recombinar os SIRPα + e CD90 + células na proporção de 3: 1 e a chapa células combinadas numa cultura de tecido não-tratada placa de Petri a uma densidade de 2 milhões de células por 60 centímetros 2 (placa de 10 cm). Adicionar 10 ml de meio NBS e 101; L de inibidor ROCHA Y-27632.
    3. Coloque suspensão de células no incubador de cultura de tecido durante 48 horas para permitir a reagregação de células em pequenos grupos.

4. Cardiac Human Tissue Engineering

  1. Fabricar o bioreactor multi-tecidos
    Nota: Para complementar as ilustrações na Figura 3A, arquivos CAD com esquemas de design detalhado de biorreatores estão disponíveis mediante solicitação dos autores.
    1. Máquina do mestre molde PDMS através da perfuração de seis furos igualmente espaçados de 0,5 mm de diâmetro em um cubóide 9 x 33 x 3,25 milímetros de politetrafluoretileno.
    2. Usando uma fresa de topo, máquina de um quadro de polysulfone medindo 25 x 35 x 11 mm3. O objectivo da armação é a realização de postos de PDMS (construídas a partir do molde feito acima) em alinhamento com as cavidades na placa de base.
    3. Usando uma fresa de topo de 1 mm, máquina de 6 poços (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm de distância em um pedaço de poli preto de 20 x 40 x 5 mm 3tetrafluoroetileno para formar a placa de base.
    4. Misture a base de elastômeros e agente de cura para polidimetilsiloxano (PDMS) em um 10: 1 w / w proporção e adicionar ao molde politetrafluoretileno personalizado (passo 4.1.1) para criar duas fileiras de seis postos de força-sensing, e incubar durante a noite e sob vácuo a 80 ° C. Após a cura, remover suavemente as PDMS do molde mestre e marcar cuidadosamente os topos de cada post com um marcador permanente preto para melhor contraste e acompanhamento pós deflexão automatizada em tempo real.
      Nota: politetrafluoretileno é bastante suave e podem ser facilmente danificados. Tenha cuidado ao limpar o molde mestre antes de PDMS lançando para garantir a longevidade do sistema e de geometria consistente PDMS post. Um fio de 0,5 milímetros pode ser usado para limpar os furos para as mensagens depois de cada utilização, mas tomar cuidado para não raspar o interior dos furos.
      Nota: Uma alternativa é o PDMS para desgaseificar sob vácuo durante várias horas à temperatura ambiente, em seguida, deixar a mistura de cura à pressão ambiente.Isto pode levar a menos bolhas de gás residual que se formam em PDMS durante o processo de cura.
    5. Esterilizar todos os componentes em uma autoclave a vapor.
      Nota: O molde PDMS mestre (passo 4.1.1) e quadro polysulfone (passo 4.1.2) são ambos reutilizável. Os postos de PDMS criados a partir do elenco (passo 4.1.4) também é reutilizável, mas apenas para cerca de 10 utilizações. No entanto, mais postos de PDMS podem ser criados conforme necessário usando o molde mestre.
  2. Coletar células cardíacas avaliação reagregada
    1. Remover as células avaliação reagregada da incubadora e transferir todos os 10 ml da mídia reagregação para um tubo de centrífuga de 50 ml.
    2. Lavar a placa com 3 ml de PBS e transferir a lavagem para o mesmo tubo de centrífuga de 50 ml contendo meios de comunicação reagregação.
    3. Adicionar 3 ml de 0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA para a placa de 10 cm e de regresso para a incubadora durante 5 min.
    4. Após 5 min, examinar a placa com um microscópio invertido composto em 10X de ampliação para assegurar dissocia célula completação a partir do prato. Se alguns clusters residuais ainda estão ligados, agitar suavemente a placa para separar os aglomerados. Se os clusters permanecem ligados, retornar para a incubadora por mais 2-3 minutos. Não incubar mais de dez minutos ou morte celular significativa pode ocorrer.
    5. Uma vez que todas as células são separadas, adicionar 3 ml de solução de tripsina de neutralização. Misture suavemente a solução de neutralização com a solução de células-tripsina e transferência para o tubo de centrífuga de 50 ml que contém a mídia reagregação e lave uma vez com PBS.
    6. Lavar todo o prato com 5 ml de PBS e transferir para o mesmo tubo de 50 ml contendo as células.
    7. Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de NBS, em seguida, transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    9. Pelete a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. As células cardíacas (células CD90 + estromais e SIRPα + miocagora ytes) estão prontos para a construção de tecidos.
  3. (Opcional) coletar células Complementares de interesse
    Nota: Em adição aos tecidos definidas contendo apenas SIRPα + cardiomiócitos e células CD90 + de tipo fibroblasto, é possível adicionar as células adicionais de interesse para interrogar o seu efeito sobre a função do tecido. Por exemplo MSCs de rato foram mostrados para melhorar a função de rato engenharia tecidos cardíacos 1. O seguinte passo opcional descreve a coleção de células suplementares para o sistema definido.
    1. Recolhe-se o tipo de célula suplementar de interesse (por exemplo, as células estaminais mesenquimais) usando 0,25% de tripsina / EDTA a 0,1%.
    2. Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida ressuspender em 5 ml de meio de cultura de células apropriado para o tipo celular de interesse. Por exemplo, para as MSCs, utilizar DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,2% de anfotericina-B para a cultura cells.
    3. Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, em seguida, sedimentar as células mais uma vez a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de meio de cultura de células e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    5. Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    6. Remover o sobrenadante. As células suplementares estão agora prontos para a construção de tecidos.
      Nota: se as células suplementares são adicionados a uma concentração de 10% do número total de células no tecido, em seguida, para os tecidos definidas, isto exigirá 50.000 células suplementares por tecido uma vez que cada tecido contém 500.000 células cardíacas (ambas as células estromais CD90 + e SIRPα miócitos +).
  4. Criar as Engineered cardíacas Tecidos Humanos
    Nota: Armazenar todas as soluções em gelo e as células à temperatura ambiente. Todos os volumes abaixo indicados são por tecido. Tipicamente, cerca de seis tecidos pode ser construído a partir de duas-seis bem PLates de diferenciações cardíacas.
    1. Dilui-se 60,0 ul de estoque a 5 mg de colagénio / ml a 3,125 mg / mL com 1,5 mL de NaOH 1 M, 9,6 ul de PBS 10X e 24,9 ul de água ultrapura desionizada estéril.
      passo crítico: evitar a introdução de bolhas de ar para cada solução durante a preparação, como as bolhas de ar vai perturbar a formação de tecido adequado.
    2. Adicionar 12.0 ul de MEM tanto 10x e 0,2 N de HEPES pH 9 para a mistura de colagénio diluído para criar a mistura de colagénio. Adicionar as duas soluções para baixo o lado do tubo de centrifugação de 15 ml, a fim de evitar a introdução de bolhas de ar na mistura de colagénio.
    3. Adicionar a matriz da membrana basal para uma concentração final de 0,9 mg / mL à mistura de colagénio e armazenar em gelo para criar a mistura final em tecido. A concentração final de colagénio deve ser de 2 mg / ml.
    4. Adicionar 500.000 das células avaliação reagregada à mistura de tecido (miócito + concentração é de 20 milhões de fibroblastos / ml) e enche-se a um volume final de 25 ul portecido, quer com meios isentos de células NBS ou 50.000 células do tipo de células de interesse suplementar (por exemplo, as hMSCs) e misturar bem para formar uma suspensão de células regular.
      Nota: O número de células suplementadas irá variar de para diferentes aplicações. Aqui suplementação de 10% é usado.
    5. Com cuidado, pipeta de 25 uL da suspensão celular em cada um dos seis poços na placa de base do biorreactor, sem a introdução de bolhas de ar para dentro do poço.
    6. Empurrar as duas filas de sensores de força PDMS em ambos os lados da armação de polissulfona, formando 6 pares de postes opostos, em seguida, invertido a estrutura na parte superior da placa de base de modo a que um par de postes entra em cada uma das cavidades contendo a suspensão de células.
      Nota: O quadro polysulfone inclui guias para auxiliar no alinhamento dos PDMS.
    7. Com cuidado, coloque o biorreator, placa de base para baixo, em um prato de 60 mm, em seguida, coloque o prato sem sua capa interior de uma placa de 10 cm, coloque a tampa 10 centímetros no topo, e mover todo o conjunto biorreator empara a incubadora de cultura de tecidos, à espera de duas horas para o tecido a gel.
    8. Após 2 horas, retire o biorreator da incubadora e adicione 14 ml de meio NBS para todo o conjunto, o suficiente para cobrir a placa de base. Voltar para a incubadora e alterar a metade dos meios de comunicação todos os dias.
    9. Quarenta e oito horas mais tarde, remova cuidadosamente a placa de base, movendo delicadamente cada lado da placa de base para fora do chassis de alguns milímetros em um momento, alterar os meios de comunicação, em seguida, retornar o biorreator, tecidos voltados para baixo, para a mídia.
    10. Continuar a alterar a metade do meio de cultura todos os dias NBS.
      Nota: as contracções espontâneas do tecido podem ser observadas tão cedo quanto três dias após a construção do tecido, a geração de forças de contração mensuráveis ​​tão cedo como o dia 5-7.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para obter miócitos cardíacos, uma versão ligeiramente modificada dos métodos de diferenciação Boheler e Lian é usado 30,31. É imperativo que a diferenciação começa durante a fase log-do crescimento das células, mas também que a população inicial é suficientemente confluentes para obter um número de células utilizável, após separação (cerca de 75% é óptimo). Tipicamente, para H7 hESCs, plaqueamento a uma densidade de 140.000 hESCs por poço de um prato de 6 poços no essencial 8 media e 5% de CO 2 in...

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Discussion

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Construção de tecidos humanos definidos engenharia cardíacas (Hect) pode fornecer um modelo mais consistente e confiável da função dos miócitos cardíacos humano. Fundamentalmente, todos os componentes celulares e extracelulares no sistema são conhecidos e podem ser manipuladas como desejado, removendo assim a confusão influência de outros tipos celulares desconhecidos resultantes do processo de diferenciação. Para equilibrar o crescimento celular rápido e elevado rendimento, é preferível que a diferenciação começa a 75%...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo NIH (1F30HL118923-01A1) para TJC, NIH / NHLBI PEN contrato HHSN268201000045C a KDC, o conselho bolsa de pesquisa de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) para BDG, o americano Heart Association (12PRE12060254) para RJ e Research Conselho Grant da RAEHK (TBR, T13-706 / 11) a RL financiamento adicional foi fornecido para TJC pelo NIH DRB 5T32GM008553-18 e, como um estágio para a Formação NIDCR-Interdisciplinar em Sistemas e desenvolvimento biologia e defeitos congénitos T32HD075735. Os autores também gostaria de reconhecer com gratidão Arthur Autz no Centro Zahn do The City College de Nova York para obter assistência com a usinagem do biorreator e Mamdouh Eldaly para assistência técnica. Agradecemos também o Dr. Kenneth Boheler para aconselhamento sobre a diferenciação cardíaca e Dr. Joshua Hare para generosamente fornecer células-tronco mesenquimais humanas.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cultura de célulasCompany>Número de catálogoComentários
Anfotericina BSigma-AldrichA2411Prepare um estoque de 2,5 mg/ml em DMSO e filtre-esterilize
B27 com insulinaLife Technologies17505055
B27 sem insulinaLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Criar 6 μ Estoque M, depois alíquota e loja a -20  °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Células-tronco embrionárias humanasWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Descongelar no gelo a 4 ° C durante a noite, em seguida, alíquota 150 μ l em tubos separados e armazene a -20  °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Crie estoque e alíquota de 10 mM. Armazene a -20 > C
Neonatal Calf SerumLife Technologies16010159
Reagente de Dissociação Não Enzimática: Reagente de Dissociação Celular SuaveStem Cell Technologies7174
Penicilina-EstreptomicinaCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Mantenha refrigerado
Y-27632 (Inibidor de ROCK)Stemgent04-0012Ressuspender para uma concentração de estoque de 10 mM, alíquota e armazenar a -20  °C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
Cell SortingCompanyNúmero de catálogoComentários
4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Reagente de Dissociação Enzimática: Kit de Desprendimento Celular I (0,04% de Tripsina/ 0,03% de EDTA, Solução de neutralização de Tripsina e Solução de Sal Tamponada Hanks) PromoCellC-41200
Soro Fetal BovinoAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Construção de TecidosCompanyNúmero de CatálogoComentários
0.25% Tripsina/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOpcional: Para coleta de células suplementares de interesse
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x Pacotes PBSSigma-AldrichP3813
Colágeno, Bovino Tipo ILife TechnologiesA10644-01Mantenha no gelo
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco' s Modified Eagles Medium (DMEM), High GlucoseSigma-AldrichD5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodium HEPESSigma-AldrichH3784
Sodium HydroxideSigma-Aldrich221465
Materials<strong>CompanyNúmero de catálogoComentários
tubos de microcentrífuga de 1,5 mlFisher ScientificNC0536757
Tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mlCorning352096
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mlCorning352235Com 35 &mu integrado; filtro de células m
tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mlCorning352070
tratada com cultura de tecidos de fundo plano de 6 poçosRaspadorde células 353046
, descartávelBiologix70-2180
PolissulfonaMcMaster-Carr
Politetrafluoretileno (Teflon)McMaster-Carr
EquipamentoCompanyNúmero de CatálogoComentários
Microscópio de DissecaçãoOlympusSZ-61Ou similar, deve ter um suporte para a câmera de alta velocidade para
anexar Sistema de Estimulação ElétricaAstro-Med, IncGrama S88X
de Alta Velocidade Câmera PixelinkPL-B741UOu similar, mas deve ser capaz de 100 quadros por segundo para aquisição precisa de dados
Controle deUsado para manter a temperatura da mídia durante a aquisição de dados.
Custom MaterialsCompanyNúmero de catálogoComments
LabView Programadisponível mediante solicitação dos autores
placa Corning Estimulador de temperatura da placa de pós-rastreamento

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