Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

Kateena Addae Konadu; Ming Bo Huang; William Roth; Wendy Armstrong; Michael Powell; Francois Villinger; Vincent Bond

doi:10.3791/53495

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

17K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/53495

⸱

5 de janeiro de 2016

Kateena Addae Konadu¹ , Ming Bo Huang¹ , William Roth¹ , Wendy Armstrong² , Michael Powell¹ , Francois Villinger³^,⁴ , Vincent Bond¹

¹Department of Microbiology, Biochemistry, Immunology, Morehouse School of Medicine, ²Department of Medicine, Emory University School of Medicine, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine, ⁴Yerkes National Primate Research Center

Neste artigo

Resumo

Técnicas que descrevem um procedimento de gradiente para separar exossomos de partículas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) são descritas. Este procedimento foi usado para isolar exossomos de partículas de HIV no plasma humano de indivíduos infectados pelo HIV. Os exossomos isolados foram analisados quanto ao conteúdo de citocinas/quimiocinas.

Resumo

Os exossomas são pequenas vesículas que variam em tamanho de 30 nm a 100 nm, que são libertadas tanto constitutivamente e por estimulação de uma variedade de tipos de células. Eles são encontrados em vários fluidos biológicos, e são conhecidos para transportar uma variedade de proteínas, lípidos, e moléculas de ácido nucleico. Originalmente pensou-se pouco mais do que os reservatórios de detritos celulares, os papéis de exossomas regulam processos biológicos e em doenças são cada vez mais apreciados.

Vários métodos foram descritos para o isolamento de exossomas a partir de meios de cultura celular e fluidos biológicos. Devido ao seu pequeno tamanho e baixa densidade, ultracentrifugação diferencial e / ou de ultraf iltração são as técnicas mais vulgarmente utilizadas para isolamento de exossoma. No entanto, plasma de HIV-1 contém ambos os indivíduos infectados exossomas e partículas virais de HIV, que são semelhantes em tamanho e densidade. Assim, a separação eficiente de exossomas a partir de partículas virais de HIV no plasma humano tem sidoum desafio.

Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um procedimento modificado a partir do Cantin et. ai., 2008, para a purificação de exossomas a partir de partículas de HIV em plasma humano. Iodixanol gradientes de velocidade foram usadas para separar os exossomas a partir de partículas de HIV-1 no plasma de HIV-1 em indivíduos positivos. Partículas de vírus foram identificados por ELISA p24. Os exossomas foram identificados com base nos marcadores de exossoma acetilcolinesterase (AChE), e os antigénios CD9, CD63, CD45 e. Nosso procedimento gradiente renderam preparações exossoma livres de partículas de vírus. A purificação eficiente de exossomas a partir de plasma humano nos permitiu examinar o conteúdo de exossomas derivados do plasma e para investigar o seu potencial imunomodulador e outras funções biológicas.

Introdução

O HIV-1 epidemia continua a ter um impacto significativo em todo o mundo. A partir de 2013, aproximadamente 35 milhões de pessoas no mundo viviam com HIV e 2,1 milhões delas eram indivíduos recém-infectadas ^1. As estratégias de prevenção e maior acesso à terapia anti-retroviral tem sido útil para reduzir a aquisição global de HIV. No entanto, as populações individuais ainda estão experimentando aumentos na aquisição de ^HIV 1. Assim, há uma necessidade de prosseguir os esforços para enfrentar esta epidemia.

Um dos mais fortes preditores de progressão da doença HIV é ativação imune crônica (CIA) ^2-10. Defini....