Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN

Resumo

O aumento da sensibilidade proporcionado pela polarização nuclear dinâmica de dissolução (DNP) permite acompanhar os processos metabólicos em tempo real por RMN e RM. As características e desempenhos de uma configuração DNP de dissolução dedicada projetada para estudar reações enzimáticas são discutidas.

Resumo

A principal limitação de investigações baseados-RMN é baixa sensibilidade. Isso leva para tempos de aquisição longos, evitando assim que as medições de RMN em tempo real de transformações metabólicas. Hiperpolarização através de dissolução DNP contorna parte da sensibilidade emite graças ao grande magnetização nuclear fora de equilíbrio decorrente da transferência de spin polarização de elétrons-to-núcleo. O sinal de RMN de alta obtido pode ser utilizado para monitorizar as reacções químicas em tempo real. A desvantagem de RMN hiperpolarizado reside na janela de tempo limitado disponível para a aquisição de sinal, o qual é geralmente da ordem de spin nuclear longitudinal constante tempo de _relaxamento, T1, ou, em casos favoráveis, a fim de a constante de tempo de relaxação associada com a camisola de estado de núcleos acoplados, T _LLS. captação celular de moléculas endógenas e taxas metabólicas podem fornecer informações essenciais sobre o desenvolvimento do tumor e resposta à droga. Nuestudos de RMN hiperpolarizados anteriores merosas demonstraram a relevância do piruvato como substrato metabólico para monitorar a atividade enzimática in vivo. Este trabalho apresenta uma descrição detalhada da instalação experimental e métodos necessários para o estudo de reacções enzimáticas, em particular a taxa de piruvato-a-lactato de conversão na presença de lactato desidrogenase (LDH), por RMN hiperpolarizado.

Introdução

Polarização nuclear dinâmica ^(DNP), 1,2 uma técnica destinada a reforçar a polarização do spin nuclear, ou seja, o desequilíbrio entre 'up' e populações de spin "para baixo" (P = [N _↑ - N _↓] / [N _↑ + N _↓]), foi introduzido pela primeira vez na década de 1950. Spins nucleares, tais como ¹³ C pode ser polarizado até P = 10 ^-1 em condições favoráveis, tipicamente a uma temperatura da ordem de 1 K e no um campo magnético de ^3,4 3,357 T. Uma descoberta para aplicações biológicas no veio início dos anos 2000 com o desenvolvimento de dissolução DNP que consiste em dissolver amostras polarizado congelado em água sobreaquecida, mantendo o alto nível de polarização nuclear obtido a baixa temperatura. ⁵ o sinal de NMR líquido-estado é aumentada por um factor de 10 ³ -10 ^4, em comparação com comumtermicamente polarizada condições RT RMN. Portanto dissolução DNP fornece uma maneira de medir bioquímica taxas de reação não-invasiva in situ em tempo real, permitindo que a dinâmica de monitoramento por RMN com uma resolução temporal de 1 segundo ou menos ^{6 -. 10} Tornou-se também possível detectar analitos em concentrações muito baixas ^11.

Entre as modalidades de imagens moleculares não-invasivos, hiperpolarizado RMN é a única técnica que permite a medição em simultâneo de um substrato e os seus produtos metabólicos em tempo real. Dissolução DNP foi recebida com entusiasmo em vários domínios científicos que variam de RMN in vitro a ¹² de IRM clínica e as aplicações mais promissores estão relacionados com a monitorização in situ de metabolismo. ^13,14 A principal limitação da dissolução DNP é que, depois de um tempo a fim de cinco vezes o tempo de relaxamento longitudinal constante T _1, o reforçada polarzação está perdido. Por conseguinte, é necessário o uso de moléculas de rolamento spins nucleares apresentem relativamente longo T _1. Para estender o período de tempo do realce polarização, lentamente-relaxante estados de spin nuclear, conhecidos como estados durabilidade (LLS), pode ser ^usado 15 ^{-. 17} LLS são insensíveis ao intra-par interacção dipolo-dipolo, pelo que a sua tempo de relaxamento característico constante, t _LLS, pode ser muito mais longo do que T _1. ¹⁸ Uma vida magnetização de dezenas de minutos e até 1 hora poderia, portanto, ser obtido, e ^19,20 LLS têm sido propostos para ambos espectroscopia de ressonância magnética (MRS) e ressonância magnética. ²¹

Os principais pontos que necessitam de ser cuidadosamente optimizadas, para estudar as taxas de reacção enzimática por RMN hiperpolarizado são: (i) maximizar a polarização em estado sólido e (ii) minimizar a perda de polarização durante a transferência da solução do hiperpolarizadopolarizador para o espectrómetro de RMN. Este artigo descreve a adaptação de uma dissolução aparelhos e injeção sistema DNP feitos sob medida para estudar reações enzimáticas. As características eo desempenho da configuração será demonstrado com o substrato hyperpolarized bem conhecido e amplamente utilizado [1- ¹³ C] piruvato. As principais razões para esta escolha são, em primeiro lugar, o seu naturalmente longa C tempo de ¹³ relaxamento longitudinal _(T 1> 50 seg a altos campos magnéticos e temperaturas acima de 293 K), que permite reações de monitorização durante vários minutos, e, em segundo lugar, o seu papel central na cancro do metabolismo. ^13,14 Usando dissolução DNP RMN e um sistema de injecção sob medida desenvolvido, a oxidação de piruvato catalisada pela lactato desidrogenase (LDH) pode ser monitorizado na presença de um conjunto inicial de lactato não marcado ou ^9,22 sem lactato não marcada adicionada , como mostrado aqui. Tem sido demonstrado que a [1- ¹³ C] lactato sinal medido no viVO (incluindo em células) após a injecção de hiperpolarizado [1- ¹³ C] piruvato é principalmente devido a uma troca rápida entre etiqueta e piruvato de lactato em vez do que a produção de lactato. ⁶

Nós apresentamos aqui a produção em tempo real de lactato [1- ¹³ C] a partir de piruvato hiperpolarizado [1- ¹³ C] injectada num tubo de RMN contendo LDH, mas inicialmente não lactato.

Descrição do sistema
Há duas partes principais em uma configuração de dissolução DNP (Figura 1): O polarizador DNP eo espectrômetro NMR. O elemento principal do polarizador DNP é um criostato para arrefecer a amostra a cerca de 1 K em um banho de hélio bombeado. O criostato é inserido em um magneto supercondutor 3,35 T e tem uma geometria que garante a ter a amostra de polarização no isocentro do íman (Figura 1). Dentro do criostato, a amostra (a) está rodeado por uma bobina de RMN (b), para medir a polarização buildup, contido numa cavidade de microondas overmoded (c). A totalidade da amostra é mantida a baixa temperatura num banho de hélio bombeado (d) e irradiada com micro-ondas através do guia de ondas. Todo o sistema é gerido pelo software feito sob medida (Figura 2D).

O hardware e equipamentos criogênicos necessários para realizar DNP ea subsequente dissolução ainda são um desafio tecnológico. Um novo DNP criostato ^23,24 foi desenvolvido e testado para determinar suas performances criogénicos e otimizado para rápido esfriamento, hélio-tempo de espera e do consumo global de hélio mínima durante a operação.

O criostato consiste em duas partes. A primeira parte do criostato é o Dewar isolamento (Figura 2A) que pode ser mais ou menos separados na parte superior (A) da cauda, ​​ou espaço de amostra (b), e a câmara de vácuo exterior (OCV) mantido sob alto vácuo e abrigando o telas de radiação (c). A segunda parte do criostato é o principalsert (Figura 2B), colocado no vaso Dewar de isolamento, em que todas as normas de fluxo são administrados. O hélio líquido proveniente do vaso Dewar de armazenamento externo através da linha de transferência (A), é, na primeira fase condensada no separador (b), uma câmara intermediária utilizado tanto para manter a parte superior do frio criostato e para remover o hélio evaporado durante a transferência. A pressão do separador é reduzido por bombeamento através de um capilar (c) envolvida em torno da parte superior do criostato; o fluxo de hélio frio nesta capilar é usada para arrefecer os defletores (d) e as telas de radiação na dewar isolamento (OVC). A amostra é colocada e polarizado no espaço de amostra. O espaço de amostra está conectado ao separador através de um outro capilar (e), enrolado em torno da cauda do inserto principal criostato. Esta capilaridade pode ser aberta ou fechada através de uma válvula de agulha operado manualmente a partir do exterior.

Para conseguir a baixa temperatura utilizada durante o pr DNPocesso, hélio líquido precisa ser recolhido no espaço amostral criostato e sua pressão baixou para o intervalo mbar. As operações necessárias para a operação criostato são realizados através de um sistema de bombeamento bastante complexo com três conjuntos de bombas, monitoradas e operadas em diferentes pontos com instrumentos eletrônicos e eletro-mecânico (Figura 2C). O criostato COV tem de ser bombeado a vácuo elevado por o primeiro sistema de bombeamento. Este sistema é composto de uma bomba de turbo-molecular apoiado por uma bomba rotativa (a). O hélio líquido é transferido do vaso Dewar de armazenamento (b), através da entrada de linha de transferência de criostato para o separador de criostato. O separador tem uma saída ligada ao segundo conjunto de bombagem. Este conjunto é constituído por uma bomba de membrana / h 35 m ³ (c). Esta linha permite a remoção do gás hélio fervida durante a transferência do dewar e durante o arrefecimento separador. O hélio líquido recolhido no separador pode então ser transferido para o espaço da amostra através do tampãoIllary tubos descrito acima. Para transferir o hélio líquido do separador para o espaço de amostra e, posteriormente, a pressão do espaço de amostra inferior para mbar gama, um terceiro sistema de bombagem composto por uma de 250 m ^{3 / hr} Raízes bomba apoiada por um / h bomba rotativa 65 m ³ (d) está ligado à criostato através de uma válvula de borboleta Manual (e).

Todas as operações do sistema de vácuo são controlados e regulados por um dispositivo feito sob medida eletropneumático (f). Este dispositivo controla as conexões de linha de vácuo entre o separador de criostato (g) e espaço de amostra (h) de escoamento, o segundo sistemas de bombagem / terceiros (c, d), uma garrafa de hélio comprimido (i) e o lado de fora. A comunicação entre (f) e o exterior passa através de uma válvula de uma via (J). O dispositivo de electro-pneumática (f), bem como todos os parâmetros do sistema e o hardware dissolução são controlados e operados por um dispositivo de interface USB electrónico feito por medida com um PC comum. Finalmente todo o sistema, através da electrónicadispositivo, é gerido pelo software independente feito por encomenda (Figura 2D) onde as operações relevantes são lançados através de uma interface utilizando os botões de software.

Para gerenciar a amostra e medir RMN sinal de build-up no estado sólido de uma série de inserções são usadas (Figura 3A). Para preparar o criostato para a polarização, colocar o inserto amostra principal (a), no criostato. O principal inserção de amostra é proporcionado com uma bobina de RMN (b) colocada dentro de uma cavidade de microondas overmoded banhados a ouro. Pré-congelamento do substrato que contém a solução a ser polarizada (solução de polarização) à temperatura do azoto líquido num recipiente de amostras adequado e colocá-la na extremidade inferior do suporte de amostra de fibra de vidro (C). Deslize o porta-amostras para a principal inserção amostra para chegar ao isocentro ímã. Insira o guia de ondas banhado a ouro (d) no porta-amostras. O guia de onda permite que o micro-ondas geradas a partir de uma fonte externa de microondas para viajar com perdas mínimas to da amostra.

O software feito sob medida para a gestão criostato trata automaticamente, após clicar no botão de interface correspondente, diferentes operações como cooldown (a temperatura criostato é abaixado perto de temperatura hélio líquido), enchendo (criostato é preenchido com hélio líquido para um nível pré-determinado ), uma etapa adicional de arrefecimento para T ≈ 1 K (o banho de hélio líquido é bombeado para atingir a temperatura mais baixa possível), pressurização (criostato é pressurizado ligeiramente acima da pressão ambiente em P = 30/10 mbar para permitir a abertura criostato sem riscos de contaminação do ar por criostato) e dissolução (procedimento automático para dissolver a amostra DNP e transferir a solução resultante hiperpolarizado para o local de medição, isto é, o espectrómetro de RMN).

A polarização é realizada irradiando a amostra com microondas a 94 GHz (em um campo de polarização B ₀ t _DNP, onde T é o tempo _{de DNP} polarização incrustações. T _DNP é da mesma ordem de grandeza que o tempo de relaxamento longitudinal dos núcleos alvo no estado sólido à temperatura e o campo dado. Em todas as nossas experiências, a amostra foi polarizado por mais de 5 t _DNP.

No final do tempo de polarização, a amostra tem que ser dissolvido numa solução de RT, a fim de ser utilizado para a medição da actividade enzimática. Durante o processo de dissolução, 5 ml de sobreaquecido D _{2 O} a partir da caldeira da inserção de dissolução (Figura 3B) são empurrados por hélio gasoso comprimido (P = 6-8 bar) para atingir a amostra de DNP-reforçada e dissolvê-lo. A solução resultante hiperpolarizado é empurrada para fora o inserto de dissolução pelo gás de hélio comprimido, através da saída de dissolução de inserção (Figura 3C-b 23 O tempo necessário para a transferência de amostras do polarizador DNP para o local espectrómetro de RMN é de cerca de 3 segundos.

O processo de dissolução é realizado utilizando uma inserção de dissolução (Figura 3B). A inserção de dissolução é composto por um conjunto electrónico, pneumático (a), uma vara de fibra de carbono (b) contendo tubos de ligação entre a caldeira na montagem de pneumático e o armário recipiente da amostra (C), que permite o acoplamento estanque com a amostra recipiente, e de volta para a saída. O conjunto de electro-pneumática (Figura 3C) é utilizada para produzir e dirigir sobreaquecido D _{2 O} através da vara de fibra de carbono para o recipiente de amostra e, em seguida, para extrair a solução hiperpolarizado do criostato. O conjunto de electro-pneumático é composto por válvulas pneumáticas (A), que controlam a ligação entre o cohélio mpressed (P = 6-8 bar) linha (b), a caldeira (C), onde a D _{2 O é} injectado através da válvula (d), e a saída (e) através da vara de fibra de carbono (f). O sistema é completado por um G pressão, um termómetro e um fio resistivo de aquecimento no interior da caldeira (c), um gatilho (h) e uma caixa de ligação (i) utilizados para fazer a interface com o sistema do dispositivo de gestão electrónica.

O criostato DNP e o espectrómetro de RMN estão ligados por uma linha de transferência, ou seja, um tubo de PTFE de 2 mm de diâmetro interno no interior do qual a solução hiperpolarizado é arrastada por hélio pressurizado (P = 6-8 bar), quando a dissolução é disparado.

A sequência de dissolução é composto das seguintes operações: em os primeiros 300 ms, sobreaquecido D ₂ S é empurrado para o recipiente da amostra, a fim de fundir e dissolver a solução congelada hiperpolarizado. Em seguida, a solução é extraída hiperpolarizado do criostato por meio de pressurized (P = 6-8 bar) de gás hélio e empurrado através do tubo de PTFE diâmetro interno de 2 mm (Figura 3C-E) para o local de medição, onde a injecção é realizada com qualquer um dos procedimentos descritos no passo 6.2.1 ou 6.2 Passo .2.

O segundo componente da dissolução configuração DNP RMN é o espectrómetro de RMN. Na configuração aqui descrita, o espectrómetro de RMN opera em um campo B ₀ = 11,7 Tesla. Uma sonda de RMN de 5 milímetros é utilizado para medir o sinal de hiperpolarizado, após a dissolução. O espectrômetro NMR é operado através do console RMN, utilizado tanto para solid-state e líquidos estatais medições de RMN, eo XWinNMR software fornecido pelo empresa. Uma medida típico é composto de um pulso dura baixo ângulo flip (seja calibrado, por liquidstate ou não-calibrados, para medições de estado sólido), seguido de aquisições de sinal.

As medições do sinal de polarização térmico de estado sólido Si e DNP-derivadonal acumulação são realizadas utilizando a bobina feito por encomenda ¹³ C no local do polarizador DNP (Figura 3ab) acoplado ao espectrómetro de RMN. Nesta situação particular, o espectrômetro de RMN não executa bloqueio de sinal. Quando as medições de estado sólido são levadas a cabo, a fim de evitar perturbações significativas para a polarização, o atraso de tempo entre aquisições deve ser suficientemente longo, mais do que cerca de 0,5 t _{de DNP.}

O realce de estado sólido é definida como Onde é o sinal hiperpolarizado (obtido no Passo 3.3) e é o sinal de estado sólido (obtido em equilíbrio térmico à temperatura de hélio líquido bombeado no Passo 3.2) (Figura 4A). Este parâmetro defines a polarização máxima disponível para experiências de RMN, antes de as perdas inevitáveis ​​durante a transferência da solução hiperpolarizado. A medição é realizada com uma sequência de pulsos-acquire simples, usando um pulso de baixo ângulo aleta un-calibrado. calibração de pulso é comumente ignorada para medições Solidstate.

Um procedimento análogo pode ser utilizado para determinar o aumento do sinal hiperpolarizado no líquido-estado. Neste caso, a amostra deve ser colocada no tubo de espectrómetro antes da injecção (Passo 6.2) é composto por 500 ul de D ₂ O. Após a dissolução e injeção, existem dois parâmetros importantes para monitorar. O primeiro é a melhoria hiperpolarizado no local espectrómetro de RMN, (Figura 4B), onde é apenas o sinal após a injecção da hiper solução polarizada (obtido no Passo 7.1) e é o sinal de polarização térmica (obtido no Passo 7.2). O segundo é o tempo de relaxamento longitudinal, T ₁ (Figura 4B, inserir), associada com o substrato e cada produto metabólico (obtido por sinais exponenciais montagem obtido no Passo 7.1). Estes dois parâmetros definem a concentração mínima do substrato necessário para se obter uma proporção suficiente de sinal-para-ruído (SNR) e a janela de tempo disponível para a medição das transformações metabólicas. A relação entre a polarização em estado sólido e polarização liquidstate dá uma estimativa das perdas de polarização devido ao relaxamento durante a transferência solução hiperpolarizado. Um valoration12 "src =" files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" / 80 "/> deve ser observado na ausência de perdas de relaxamento.

Protocolo

NOTA: Todas as análises dos dados foi realizada utilizando o software comercial.

1. Preparar a solução de polarização

1. Preparar 2 ml de uma piruvato de sódio 1,12 M ¹³ marcado com C ^(Na + _[CH3-CO- ¹³ COO] ^-, substrato) solução dopado com 33 mM de radical TEMPOL (4-hidroxi-2,2,6,6- tetrametilpiperidin-1-oxilo, agente de polarização) ^{4 em} 2: 1 d ₂ O / d ₆ -etanol ^durante 13 observações C. CUIDADO: Tomando Precauções devem ser tomadas devido à natureza inflamável de d ₆ -etanol.
2. Verifique se a concentração de radicais é o ideal em termos de polarização alcançado.
   1. Alterar ligeiramente a concentração de radicais de a solução no ponto 1.1 (por exemplo, para 30 mM ou 35 mM).
   2. Determinar de forma iterativa o reforço de estado sólido (ver Passo 3) e encontrar a concentração radical que leva ao aperfeiçoamento máximo.

2. Polarizatíon

1. Abaixe a temperatura criostato DNP através do procedimento de cooldown. Clique no botão "Recarga" na interface do software criostato (Figura 2D).
2. Recolhe hélio líquido no criostato DNP através do procedimento de enchimento. Clique no botão 'enchimento' na interface do software criostato (Figura 2D).
3. Colocar 300 ml da solução de polarização optimizado do Passo 1.1 no recipiente de amostra fornecido com o polarizador DNP. Congelar o recipiente da amostra com a amostra dentro imergindo-o suavemente em um banho de nitrogênio líquido.
4. Elimine o azoto líquido que possa estar presente no recipiente de amostra após o procedimento de congelação (Passo 2.3) por extracção do recipiente da amostra do banho de azoto líquido e rodando-a de cabeça para baixo.
   NOTA: Este passo é crucial para se obter uma dissolução completa da amostra (ver Passo 5).
5. Insira a amostra no criostato.
   NOTA: Este StEP, composto pelos seguintes sub-passo, deve ser realizada rapidamente (isto é, em menos de 10-20 segundos) para evitar que a amostra de fusão.
   1. Insira o recipiente da amostra no porta-amostras. Insira o suporte da amostra no principal inserção criostato. Insira o guia de ondas microondas no porta-amostras.
6. Abaixe a temperatura criostato por iniciar o procedimento de 1 K de resfriamento. Clique no botão '1K de resfriamento "na interface do software criostato (Figura 2D).
7. Ligue a fonte de microondas em e irradiar a amostra. Clique no botão 'MW-ON "na interface do software criostato (Figura 2D).

3. Medidas de RMN de estado sólido

1. Desligue o cabo coaxial do canal de detecção de consola a partir da bobina de RMN espectrómetro pela rotação no sentido contrário ao conector de 90 ° e puxando-o. Ligue o cabo coaxial do canal de detecção para o conector coaxial da criostatoRMN bobina. Insira o conector macho do cabo de console NMR no conector fêmea da bobina criostato RMN, prestando atenção para o pino de orientação; empurre com firmeza e gire no sentido horário conector de 90 °.
2. Medir o sinal térmico NMR no estado sólido no local criostato usando uma seqüência de pulsos-acquire simples com pulsos flip-baixo ângulo calibrado-un repetidos com um intervalo de T = 5 min. Depois de configurar a medição, escreva na linha do software 'zg' comando e pressione a tecla do teclado 'Enter'. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para obter mais detalhes sobre a operação espectrômetro e configuração de medição.
3. Medir o sinal de NMR DNP-reforçada. Repetir as operações do passo 3.2 após o início do processo de DNP, conforme descrito na Seção 2.
4. Desligue o cabo de canal de detecção coaxial consola NMR da bobina RMN criostato girando o sentido anti-horário conector de 90 ° e puxando-o. Ligue o cabo coaxial da detecanaleta cção ao conector coaxial da bobina espectrómetro. Insira o conector macho do cabo de console NMR no conector fêmea da bobina de espectrómetro, prestando atenção para o pino de orientação; empurre com firmeza e gire no sentido horário conector de 90 °.

4. Otimize a homogeneidade do magneto principal Field ( 'calço')

1. Colocar no espectrómetro de um tubo contendo 500 jil de mistura produzidos nas experiências anteriores (isto é, após o passo 6.2).
2. Execute RMN espectrômetro de calços pela variação da corrente nas bobinas de gradiente shimming procurando pelo máximo 'bloquear' sinal de deutério. Selecione a bobina shimming relevante pressionando o botão correspondente na consola RMN.
   1. Gire o botão no console NMR para determinar o sentido de rotação que aumenta o sinal de bloqueio. Continue a girar até que o sinal atinge um máximo. Selecione outra bobina de calços e repita o un maximizaçãoaté um máximo local para todas as bobinas shimming é encontrado. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para mais detalhes. No final, remover a amostra utilizada para o bloqueio.

5. Dissolução

1. Inserir 5 mL _de D 2 O na caldeira de dissolução da pastilha. Pressurizar e aquecer a D _{2 O} por meio do fio resistivo até t ≈ 180-200 ° C é atingida. Clique no botão "Prepare Heater 'na interface do software criostato (Figura 2D).
2. Após conclusão do procedimento de polarização da amostra (por exemplo, depois de 3 T _DNP), pressurizar o criostato ligeiramente acima da pressão ambiente. Clique no botão 'Operações SS "na interface do software criostato (Figura 2D). Remover o guia de micro-ondas a partir da inserção de dissolução.
3. Deslize a inserção de dissolução (Figura 3B) para baixo no suporte de amostra (Figura 3A-C). A inserção de dissolução tem de atingir a parte inferior do suporte de amostra e deve ser empurrada firmemente para efectuar uma ligação estanque com o recipiente da amostra, a fim de evitar D _{2 O} vazamento no criostato.
4. Premir o gatilho de hardware (Figura 3C-H) para iniciar a sequência de dissolução, uma sequência cronometrada pré-determinado de operações de válvulas pneumáticas.

6. Injecção

1. Antes de dissolução lugar um tubo de RMN de 5 mm, contendo 500 ul de amostra (por exemplo, D _{2 O durante} medição no Passo 7 ou LDH solução do passo 8 para as medições da actividade enzimática na etapa 9), no isocentro do t espectrómetro de RMN 11,74 (ver Passo 4).
2. Logo após a dissolução (Passo 5), misturar 500 ul de solução hiperpolarizado com a amostra colocado no espectrómetro de NMR no passo 6.1.
   1. Injeção Manual: recolher o hyperpolarizedsolução no final de um longo tubo de transferência de 2,5 M em um copo de vidro colocado na proximidade do íman espectrómetro de RMN. injectar manualmente 500 ul de solução hiperpolarizado no tubo da amostra por meio de um sistema de RMN capilar feito à medida.
   2. automático de injecção: antes do processo de dissolução, ligar o tubo de transferência a um dispositivo de injecção automático feito à medida que separa a solução hiperpolarizado do gás hélio usado para a transferência. O dispositivo proporciona automaticamente a 500 ul de solução hiperpolarizado para o tubo de amostra.

Medição RMN 7. Líquido-state

1. Após a dissolução, medir o sinal hiperpolarizado NMR a partir da amostra no espectrómetro por uma série de 10 ângulo de sequências de pulso-acquire ° aleta espaçadas por 1,5 seg para seguir a progressão da magnetização do substrato (A) e o produto (B). Depois de configurar a medição, escreva na linha do software 'zg' comando e pressione a & #39; Enter 'tecla do teclado. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para obter mais detalhes sobre a operação espectrômetro e configuração de medição.
2. Uma vez que a magnetização está completamente relaxado (isto é, após t = 10 t _1), medir o sinal térmico de RMN de uma série de 90 ° ângulo da aleta de pulso-adquirir sequências espaçadas de t = 3 t ₁ ≈ 3 min. Depois de configurar a medição, escreva na linha do software 'zg' comando e pressione a tecla do teclado 'Enter'. Consulte o manual de operação do espectrômetro de RMN para obter mais detalhes sobre a operação espectrômetro e configuração de medição.

8. Preparação de enzima contendo amostras (específico para a transformação de piruvato-a-lactato)

1. Preparar o tampão de reacção com a seguinte receita: 50 mM de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADH), ácido etileno-diamina-tetra-a 1 mM (EDTA), ditiotreitol 0,1 mM (DTT) em tampão fosfato 0,1 M, pH =7.0.
2. Prepara-se uma solução de LDH músculo de coelho a 1 U / ml preparada de fresco em tampão de reacção com 20 ug / ml de albumina de soro bovino, BSA.
3. Misturar 478 ul de tampão de reacção (Passo 8.1), 20 ul de D _{2 O para} permitir a estabilização do campo espectrómetro ( "bloqueio") e solução de LDH 2 ul (Passo 7.2).
4. Colocar o volume de solução de 500 ul preparado no passo 8.3 para um tubo de RMN de 5 mm e posicionar o tubo para dentro do espectrómetro de RMN de 500 MHz.

9. completa enzimática Reaction Rate Procedimento de medição

1. Preparar a amostra de polarização (Passo 1) e que polarizar (Passo 2).
2. Realizar calços no espectrómetro (Passo 4) e preparar a amostra enzimática (Passo 8).
3. Realizar a dissolução (Passo 5) e da injecção (Passo 6).
4. Medir uma série de sinais da amostra hiperpolarizado com 10 ° de ângulo de aleta pulsos aquisições espaçadas por 1,5 segundos (Passo 7). Este passo permite medir a hiperpolarizadodecaimento do sinal e o acúmulo de sinais de metabólitos.

10. Encaixe

1. Para cada espectro adquirido na etapa 9.4, identificar os picos que correspondem aos substratos (A) e do produto (B), respectivamente, e integrá-los (determinação da área dos picos). Os picos integrais dar os sinais de evolução no tempo de magnetização (M _{(A, B)} (t), ver equação 2).
2. Usando a solução da equação (2), determinar o valor de F = _{(A +} R k _ef ) A partir de um ajuste exponencial simples do sinal integrado substrato no passo 10.1.
3. Usando o valor F = _{(A +} R k _ef ) Determinado na etapa 10.2, determinar _FEP K e R _{B a partir de} um ajuste do sinal de produto H _B (t) com a função obtida pela integração da equação (2). Consulte a seção de resultados Representante (Enzymatatividade ic e medições metabólicas) para obter detalhes sobre a correção de modelagem de reação, montagem e rf.

Resultados

ganhos de sinal de NMR usando dissolução DNP
O efeito DNP consiste na transferência da alta polarização de rotações de electrões desemparelhados, tipicamente a partir de moléculas de radicais estáveis, para núcleos RMN-activas, sob irradiao com microondas da amostra. Os radicais livres mais usados ​​são TAM (OXO63) e TEMPOL. ⁴ procedimentos de polarização usando TEMPOL pode ser otimizado pelo 'polarização cruzada'. ²⁵

Discussão

Os pontos críticos da dissolução experimento DNP RMN são: (i) o nível de polarização atingida para o substrato, o qual determina a concentração mais baixa do produto necessário para experiências, bem como o número de aquisições de sinal que podem ser realizadas e (ii) os tempos de vida de magnetização, em comparação com a duração da transferência entre a polarização e os locais de detecção e para a taxa de transformação do substrato. O sistema de injecção da configuração DNP dissolução aqui descrito permite a transferên...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Polarizador DNP	Vanderklink s.a.r.l (Suíça)		Criostato e equipamento eletrônico para polarização de amostras
Componentes do sistema de vácuo Vácuo	Edwards vacuum (França)	Vários	- configuração de bombeamento turbomolecular - configuração de bombeamento de membrana - sistema de bombeamento de raízes de alta capacidade - conexões e componentes de vácuo
DNP 3.35T Magnet	Bruker (França)
Espectrômetro de RMN de 500 MHz	Bruker (França)
Origem 8.0	OriginLab (EUA)		Software de análise de dados
Produtos químicos
PIRUVATO DE SÓDIO-1-13C, 99 ÁTOMOS % 13C	Sigma Aldrich (França)	490709
ETANOL-D6, ANIDRO, 99,5 ÁTOMOS % D	Sigma Aldrich (França)	186414
4-Hidroxi-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (França)	176141
Óxido de deutério	Sigma Aldrich (França)	151882
dinucleotídeo reduzido de nicotinamida adenina (NADH)	Sigma Aldrich (França)
Ácido etileno-diaminaminotetracético (EDTA)	Sigma Aldrich (França)
ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich (França)
tampão fosfato, pH =  7.0	Sigma Aldrich (França)
Enzima LDH em	Sigma Aldrich (França)	L-2500
albumina de soro bovino, BSA	Sigma Aldrich (França)