Artigo de método

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

DOI:

10.3791/53568

⸱

28 de dezembro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Neste artigo

Aviso de errata

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A arte da produção de proteínas recombinantes com modificações pós-tradução complexas representa um grande desafio para estudos da estrutura e função. O estabelecimento rápido e elevada recuperação de linhas celulares de mamífero transf ectadas transitoriamente aborda esta barreira e é um meio eficaz para expressar as proteínas que são naturalmente canalizados através da via secretora do ER e Golgi-mediada. Aqui é um protocolo para a expressão da proteína usando a HEK293F humano e linhas de células HEK293S transfectadas com um vector de expressão de mamífero concebido para rendimentos elevados de proteína. A aplicabilidade desse sistema é demonstrada por meio de três glicoproteínas representativos que expressavam com rendimentos entre 95-120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultura. Estas proteínas são a FcγRIIIa humana e a sialiltransferase de rato α2-6, ST6GalI, ambos expressos com uma fusão com GFP N-terminal, bem como a imunoglobulina humana G1 Fc não modificada. Este robusto sistema utizará um meio isento de soro que é adaptável para a expressão de proteínas e hidratos de carbono para estudos estruturais, utilizando espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear isotopicamente enriquecidos. Além disso, a composição do N-glicano pode ser ajustado por adição de uma pequena molécula para evitar certas modificações de glicano de uma maneira que não reduz o rendimento.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A produção de rendimentos elevados de proteínas humanas adequadamente dobrados e modificada pós-translacionalmente por análise detalhada da estrutura e função continua a ser um desafio significativo. Um grande número de sistemas de expressão disponíveis que produzem proteínas recombinantes com função e comportamento semelhante à nativa. Sistemas de expressão bacterianos, predominantemente estirpes de Escherichia coli, representam as ferramentas mais acessíveis e frequentemente utilizadas na área da pesquisa, devido à simplicidade destes sistemas de expressão, embora sistemas de mamíferos levedura, plantas, insectos e são também descritos 1-4. No entanto, a maioria destes sistemas são incapazes de modificação pós-tradução adequada das proteínas alvo. Um interesse fundamental dos laboratórios Barb e Moremen está produzindo proteínas eucarióticas com glicosilação apropriada. Muitas proteínas humanas exigem glicosilação adequada para o bom funcionamento (ver 5).

O eucarióticamaquinaria de glicosilação é extensa e capaz de fazer uma grande variedade de modificações, incluindo tanto a asparagina (N) - e serina / treonina (O) -linked glicanos complexos 6. Estima-se que> 50% das proteínas humanas são N-glicosilados 7. Glicanos são componentes essenciais de muitas proteínas incluindo anticorpos monoclonais terapêuticos, eritropoietina e fatores de coagulação do sangue, como factor IX, para citar alguns. Apesar de existirem vários métodos para preparar adequadamente proteínas N-glicosiladas e variam de puramente sintético 8-10, para 11-14 quimioenzimáticas ou recuperação de sistemas recombinantes engenharia 15-20, não surpreendentemente, sistemas de expressão humanos têm, até agora provou ser o mais robusto métodos para gerar proteínas humanas.

Muitos glicoproteínas terapêuticas humanos são produzidos em sistemas recombinantes que utilizam células de mamífero. Sistemas de nota são o de ovário de hamster chinês (CHO), mieloma de ratinho (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), rim embrionário humano (HEK-293) e linhas de células da retina humanas que são empregues na adesão ou suspensão de cultura para a produção de proteína 4,21,22. No entanto, os sistemas de expressão de proteína de mamífero têm exigido a geração de linhas celulares estáveis, meios de cultura caros e procedimentos de transfecção de substrato assistida 23.

Transfecção de células de mamífero é conseguido com o auxílio de numerosos agentes, incluindo fosfatos de cálcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) ou lipossomas catiónicos carregados positivamente 26-29. PEI é um policatiónico, carregada, linear ou ramificada de polímero (25 kDa) 26 que forma um complexo estável com o ADN e é sujeita a endocitose. Após acidificação do endossoma, PEI é pensado para inchar, levando à ruptura dos endossomas e libertação do ADN para o citoplasma 26,30.

Até recentemente, a transfecção transiente em suspensia cultura foi realizada por formação de complexos de ADN / PEI antes, seguido pela adição à cultura de células 29. No entanto, Würm e colaboradores relataram um protocolo optimizado altamente eficiente para a produção de proteína recombinante em células HEK293 que formaram um complexo de ADN / PEI in situ 31,32. Isto evitou a preparação, a esterilização do complexo, e a troca de tampão para um meio de cultura. Otimização, incluindo plasmídeos de aumento de expressão levaram a aumentos significativos de produtividade 33. Aqui é um método que se baseia esses avanços e é amplamente aplicável. Condições de expressão, também pode ser alterado para afectar a composição de N-glicanos.

A linha celular HEK293S, com uma deleção do gene que interrompe o processamento de N-glicano numa fase intermédia, leva-se à expressão de proteínas com uniformes N-glicanos que consistem de 2 resíduos de N-acetilglucosamina e mais cinco resíduos de manose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulasfalta a transferase de N-acetilglucosaminil I (GnTI) gene que é necessário para o processamento de N-glicanos a jusante 36,37. A utilização de inibidores de glicosiltransferase incluindo kifunensine, análogos de ácido siálico e fucose e o análogo de 2-desoxi-2-fluoro-fucose e possui efeitos de processamento de N-glicanos 38-41 limites semelhantes.

O protocolo aqui relatada utiliza o vector pGEn2 como mostrado na Figura 1 42,43, PEI assistida transfecção transiente em células de mamífero (linhas HEK293F HEK293S ou células), e a recuperação de rendimentos elevados de proteína apropriadamente glicosilada. Este sistema é robusto e pode acomodar vários factores, incluindo a marcação isotópica e engenharia de glicano para a produção de grandes títulos de proteínas recombinantes.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo é suficiente para a expressão usando HEK293F ou células HEK293S.

1. Estabelecimento celular

  1. Cultura Inoculação
    Nota: Todos os procedimentos de manipulação de cultura deve ser realizada em uma facilidade BSL-2 e cada item trazido para o gabinete de biossegurança devem ser esterilizados por pulverização com um 70% de etanol em solução aquosa.
    1. Operar o agitador a 135 rpm incubadora, 80% de humidade e a 8,0% de CO2 e 37 ° C. "Ligar" a lâmpada UV da cabine de segurança biológica, pelo menos, 1 h antes do trabalho. Pré-aquecer as garrafas de meio A e Meio B selados colocado no banho de água a 37 ° C durante 1 h.
    2. Esterilizar frascos de 125 ml de crescimento Erlenmeyer com uma tampa ventilada, pipetas, pipetas e frascos de mídia pré-aquecido por pulverização com o etanol a 70% em solução de água. Coloque esses itens no gabinete de biossegurança. Nota: Esterilizar somente no plástico exterior cobrindo a garrafa de cultura de 125 ml Erlenmeyer, e em seguida, retire apenas quando is dentro da cabine de segurança biológica.
    3. Para uma cultura de 30 ml, retirar 26 ml de meio A e 3 ml de Meio B (10% da cultura final) e transferir para o frasco de cultura de Erlenmeyer de 125 ml e misturar suavemente por agitação (daqui em diante denominado como meio de cultura fresco).
    4. Transferência de um frasco de células contendo células HEK293F, congeladas a -80 ° C, em gelo e mover-se para a sala de cultura. Nota: as células HEK293F são fornecidos a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml.
    5. Aquecer suavemente o frasco em banho-maria a 37 ° C para descongelar as células parcialmente (isto leva aproximadamente um minuto e células não deve ser completamente descongelado). Esteriliza-se o exterior de um frasco com o etanol a 70% em solução de água e movê-lo para a cabine de segurança biológica.
    6. Usando uma pipeta de 1 ml, retirar a suspensão de células (aproximadamente 0,7 ml) e transferir para o balão de Erlenmeyer de 125 ml contendo 29 ml de meio de cultura fresco. Fechar a tampa do frasco de cultura e movê-lo para o agitador incubadas.
  2. Manutenção celular: Verifique densidade celular, viabilidade e Passages Celulares
    1. Verifique a densidade de células após 24 h de descongelação da cultura seguindo o protocolo abaixo. Nota: As células são cultivadas durante 24 horas após a descongelação para garantir células essenciais de crescimento e viabilidade> 80%.
    2. Esteriliza-se o frasco de cultura com o etanol a 70% em solução de água e movê-lo para a cabine de segurança biológica.
    3. Usando uma pipeta de 1 ml e pipeta, retirar lentamente 100 ul de suspensão de cultura e transferência para um filtro estéril de 0,5 mL Eppendorf tubo. Fechar e transferir o frasco de cultura de volta para o agitador o mais rapidamente possível.
    4. Misture 7,5 ul de uma solução de azul de tripano, com 7,5 ul de células. Misture vigorosamente com 7,5 ul da célula / Trypan mistura azul e transferi-lo para o slide contagem.
    5. Ligue o contador de células automático e contagem coloque a lâmina para dentro da câmara de carregamento. O leitor automático é activado e células são contados automaticamente nas unidadesdo número de células por ml e viabilidade por cento
    6. Determinar o volume da cultura requerido para o dador de transferência para um meio de cultura fresco a uma densidade de células de 0,3 x 10 6 células / ml vivo.
      Nota: Veja um exemplo de cálculo em Materiais adicionais.
    7. Repita os passos 1.1.2 e 1.1.3 do protocolo "1,1 Cultura Inoculação" acima para preparar os materiais necessários para o meio de cultura fresco.
    8. Transferir Meio A (23 ml) e Meio B (3 ml) a um balão de 125 ml de cultura fresco. Retirar as garrafas de ações de médio A e B Médio do gabinete de biossegurança.
      Nota: Os stocks de garrafas de material não deve ser mantida no armário de segurança biológica, ao mesmo tempo que as células HEK 293F. Isto limita a possibilidade de contaminação das garrafas médias estoque.
    9. Remover a cultura de células HEK293 da incubadora e pulverizar com o etanol a 70% em solução de água. Usando uma pipeta nova, retirar a alíquota de células (4 ml, este volume foi determinado de acordo com tO passo 1.2.6) a partir da cultura e transferi-lo para o balão que continha meio de cultura fresco.
    10. Transferir as duas culturas a partir do gabinete de biossegurança para o shaker incubadora definido de acordo com 1.1.1. Crescer as células até uma densidade de aproximadamente 2-3 x 10 6 células / ml vivo.
      Nota: O tempo de duplicação das células é de aproximadamente 32 h. Vai demorar 3-4 dias para chegar a esta densidade. Incubam-se as células durante 3-4 passagens para ter o padrão de crescimento de células estável antes da primeira transfecção.

2. Prepare Materiais para Transfection

  1. Preparando células HEK293 (Dia 1)
    1. Subcultura de células a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em meio fresco B 24 h antes da transfecção de acordo com o Passo 1.2.
      Nota: O volume da cultura de transfecção será dependente do número de células. Maiores volumes de transfecção (> 20 ml) vai exigir um maior volume de cultura nesta fase.
  2. Preparando Stocks de Materiais
    1. Preparar a solução de estoque de polietilenimina linear (PEI) a uma concentração de 1 mg / ml num tampão contendo 25 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES) e NaCl 150 mM (pH 7,5). Dissolver completamente PEI; isto pode demorar 30-60 min à temperatura ambiente. Esterilizar através de filtro de seringa de 0,22? M e armazenamento a -20 ° C para uso a longo prazo.
    2. Preparar DNA de plasmídeo estéril (de acordo com os passos 2.2.2.1-2.2.2.4). O processo de construção do plasmídeo está descrita em outro lugar 42. Uma breve procedimento para a preparação de DNA é explicado aqui:
      1. Crescer uma cultura de células de Escherichia coli quimicamente competentes-transformadas com o vector pGEn2 em 1 L de meio LB (Tryptone- 10 g / L, levedura Extrato de 5 g / L e chloride- de sódio a 10 g / l) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. E. coli é cultivada a 37 ° C em um não-humidificado, incubador com agitação.
      2. Purifica-se o ADN que codifica pGEn2 plasmídeo vector alvo de acordo com a manuprotocolo de purificação de DNA cante.
      3. Para garantir a esterilidade completa do DNA plasmídeo, execute as isopropanol precipitação e ressuspensão etapas finais dos procedimentos de extração de DNA dentro da cabine de segurança biológica.
      4. Adicionar o volume de isopropanol (especificado no kit de preparação de plasmídeo) para o DNA eluído e centrifugar a 10.000 x g durante 10 min. Esteriliza-se o exterior do recipiente de ADN com etanol a 70% em solução de água e transferi-lo no interior do armário de biosegurança. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de isopropanol e ar-secar o sedimento de DNA. Depois de seco, ressuspender o sedimento em tampão Tris 10 mM estéril, pH 8,0.
    3. Preparar a solução de estoque de 220 mM de ácido valpróico (VPA) em água e esterilizar por passagem através de um filtro estéril de 0,22 um. Guardar a solução a -20 ° C até à sua utilização.

3. Estabelecer uma transfecção transiente

  1. A transfecção (dia 0)
    1. Verifique a densidade de células seguindo os passos 1.2.2 através de 1.2.5 de "1.2. Manutenção celular" acima. Determinar a quantidade de células para a transfecção (2,5-3,0 x 10 6 células / ml em directo com a viabilidade> 95%). Veja um exemplo de cálculo em Materiais adicionais.
    2. Transferir o volume de células de cultura em suspensão calculados na etapa anterior (aqui 67 ml) para um tubo de centrífuga de 250 ml usando uma pipeta serológica estéril. Recolher as células por centrifugação durante 5 min a 100 x g.
    3. Enquanto isso, prepare-se um meio de cultura fresco transfecção seguinte passo 1.1.3 de acordo com "1.1. Inoculação Cultura" acima. Veja os Materiais suplementares para o cálculo da amostra. Além disso, a transferência de 5 ml de meio de cultura fresco para um tubo estéril de 15 ml e retiradas.
    4. Tubos de transferência contendo as células sedimentadas na cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior dos tubos com o etanol a 70% em água e solução de usar uma pipeta estéril para decantar the sobrenadante que consiste em meio de cultura gasto.
    5. Vigorosamente ressuspender as células sedimentadas por pipetagem para cima e para baixo usando 10 ml de meio de cultura fresco e transferir para o frasco com meio de cultura fresco a transfecção (preparado no passo 3.1.3, supra). Colocar a tampa na garrafa de cultura de células ventilado e mover o balão para a incubadora (como definido em 1.1.1) para 15 min-1 h com agitação.
    6. Durante este tempo, dilui-se o ADN plasmídico e os estoques de PEI, utilizando meio de cultura fresco (utilizando o volume de 5 ml a partir do passo 3.1.3 retirada acima) a uma concentração final de 0,5 ug / ul. Veja exemplos de cálculos em Materiais adicionais para determinar a quantidade de DNA e PEI. Transferir o frasco de cultura com as células dispersas na cabine de segurança biológica.
    7. Adicionar DNA de plasmídeo (300 ul de 0,5 mg / mL) para a cultura utilizando micro-pipeta e misturar por agitação manual suave. Adicionar PEI (900 ul de 0,5 mg / mL) para a cultura, misturar agitando suavemente. Adicionar 3,8 ml de cul frescomédio ture, a partir do passo 3.1.3, acima e frasco de transferência para o shaker incubadora durante 24 h.
    8. Limpe o gabinete de biossegurança de acordo com o Passo 1.1.
  2. Diluição (Dia 1) (Para um volume de 50 ml de transfecção)
    1. Incubar a cultura transfectadas durante 24 horas.
    2. Retirar 1 mL de ácido valpróico pré-aquecido de 220 mM (VPA; preparado de acordo com o passo 2.2.3.), Utilizando uma pipeta de 1 mL estéreis serológica e transferi-lo para um tubo estéril de 50 ml.
    3. Retirar 5,0 ml de Meio B pré-aquecido e pré-aquecida de 44 ml de meio A e este adicionar à solução VPA usando uma pipeta serológica estéril para preparar 50 ml de meio de cultura fresco com uma concentração final de 4,4 mM de VPA.
    4. Mover a cultura transfectado para a cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior da garrafa com um 70% de etanol em solução aquosa, adicionar o meio de diluição preparada e transferir do frasco de volta para o agitador incubadas.
  3. Expressão e colheita (Dias 2-6)
    1. Incube as celulas por mais 4-5 dias (5-6 dias no total desde a transfecção).
    2. Retirar alíquotas de meio de cultura seguintes passo 1.2.2. a 1.2.5. descrito em "1.2. Manutenção celular", acima, utilizando uma pipeta de 1 ml estéril sorológica, para monitorar a viabilidade de células e salvar alíquotas para analisar a expressão da proteína em cada dia por SDS-PAGE (veja Seção 5, abaixo).
    3. Células de 5-6 dias após a colheita por centrifugação do meio de células mais a 1000 g durante 5 min. Além disso, a colheita do sobrenadante se a viabilidade celular cai abaixo de 50% (ver passos 1.2.2-1.2.5).
    4. Decantar o sobrenadante que contém proteína segregada. Adicionam-se 5 ml de uma lixívia a 10% ao sedimento celular HEK e descartar como um perigo biológico.

4. Purificação de Proteínas

  1. Prepara-se uma coluna com 5 ml de Proteína-A Sepharose. Equilibrar a coluna com 5 volumes de tampão A (20 mM de 3- (coluna N-morfolino) propanossulf único (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCeu).
  2. Centrifuga-se o sobrenadante recolhido com proteína expressa a alta velocidade (14.000 g durante 10 min) para remover todos os restos de células remanescente. Recolhe por decantação para um tubo fresco. Desprezar o pelete como um perigo biológico.
  3. Recolhe-se uma alíquota de 10 ul do sobrenadante e, adicionalmente, recolher uma pequena amostra em cada etapa de purificação da proteína para analisar a amostra por SDS-PAGE (descrito na Secção 5). Carregar o sobrenadante clarificado e recolher o fluxo através.
  4. Lava-se a coluna com volumes de tampão A 3-coluna e elui-se a proteína com volumes de 100 mM de glicina, pH 3,0, 5-coluna. Recolhe-se o eluato em tubos contendo metade do volume de tampão Tris 1 M, pH de 8,0 para neutralizar rapidamente o pH.
  5. Lava-se a coluna com 10 volumes de coluna de tampão A e armazenado para utilização futura.
  6. Tampão de trocar a proteína eluída com pelo menos um excesso de 10 vezes de tampão A por meio de 10 kDa de peso molecular filtros centrífugos de corte. Nota: Não se concentrar a amostra eluída aum volume muito baixo (<2 ml) no tampão eluiu. Use os filtros centrífugas para trocar o tampão com tampão A.
  7. Loja proteína purificada a 4 ° C até à próxima utilização.
    Nota: A proteína expressa no sobrenadante pode ser purificado por colunas de afinidade, seleccionados com base nas propriedades da proteína ou a utilização de marcas de afinidade. Por um procedimento de purificação típico, Proteína A coluna pode ser utilizada para IgG ou fragmentos Fc ou coluna de níquel pode ser utilizado para proteínas expressas com um marcador de poli-histidina. Aqui, é uma descrição dos passos de purificação para a IgG1-Fc utilizando uma coluna de proteína.

5. Análise de proteína por SDS-PAGE

  1. Dilui-se alíquotas (7,5 ul) de cada amostra com um volume igual de 2X tampão de carga (Tris 0,125 M, pH 8,0, SDS a 4%, 10% β-mercaptoetanol, 20% de glicerol e 0,01% de azul de bromofenol).
  2. Ferve-se a mistura a 90 ° C durante 5 min, utilizando um bloco de aquecimento ou banho-maria. Centrifugar as amostras a 10.000 g foR 1 min. Carregar o gel preparado com 5 ul de proteína marcadora e 14 ul de amostras para análises utilizando uma pipeta de 20 mL com uma ponta descartável.
  3. Execute um gel a 25 miliamperes para 60 min. Uma vez que o passo de electroforese é completa, transferir o gel para um recipiente com 1 L de água e de microondas durante 5 min.
  4. Corar o gel com solução de coloração (etanol a 40%, ácido acético a 10% e 0,1% de azul brilhante de Coomassie) durante 2 horas e destain em água.

6. Glicanos Análise por Espectrometria de Massa

  1. Analise glicanos, tal como descrito anteriormente 44. Resumidamente, 75 ug de IgG1-Fc foi tripsinizadas, em seguida, tratada por PNGaseF para a libertação de 45 glicanos. Glicanos libertados foram analisados ​​e permetilado usando ionização de dessorção laser espectrometria de massa assistida por matriz-tempo de voo (MALDI-TOFMS).

7. Ajustes de protocolo para Cenários especiais

  1. Marcar proteínas com 15 N-Aminoácidos marcado (para um volume de 50 ml de transfecção)
    1. Dispensar 5 mg de cada um dos aminoácidos em um único frasco de vidro estéril. Ressuspender com 4 ml de água autoclavada (nota Tyr não completamente solubilizar, ao contrário de Lys e Phe). Esterilizar a solução em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Deixar a solução arrefecer para cerca de 50-60 ° C.
    2. Para um volume de transfecção de 50 ml, siga o passo 3.1.3 de acordo com "3.1 O estabelecimento de uma transfecção transitória". Consulte a seção Materiais adicionais para um exemplo com volumes adequados.
    3. Para a transfecção, seguir os passos de "3. Estabelecimento de uma transfecção transiente" com meio de cultura fresco substituído com resíduos de aminoácidos marcados como preparado acima.
    4. Após 24 horas da transfecção, no dia da diluição da cultura, retirar 5,0 ml de Meio B pré-aquecida, pré-aquecida de 40 ml de Meio A esterilizado e um recém-4 mL alíquota da mistura de amino ácido (preparado como no passo 7.1.1. Supra) e adicionar 1pré-aquecido ml de solução de solução mãe de VPA para preparar 50 ml de meio de cultura fresco a diluição com uma concentração final de 4,4 mM de VPA. Adicionar este meio para a cultura de transfecção usando uma pipeta serológica estéril.
    5. Transferir a cultura transfectado para a cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior da garrafa com um 70% de etanol em solução aquosa, adicionar o meio de diluição preparada e transferir o frasco de volta para o agitador incubadas.
      Nota: Meio A é, um meio isento de soro quimicamente definido. Assim, é possível preparar uma formulação diferente. Entre em contato com o fornecedor para obter um costume Médio Uma preparação que carece de certos aminoácidos. É possível ter todos os aminoácidos deixado de fora, no entanto, é preferível utilizar meio que carece apenas alguns resíduos de escolha porque um meio de abandono completa exigiria o ajustamento da osmolaridade após a suplementação. Nós escolhemos um meio de abandono Lys-Tyr-Phe que pode ser completada e não necessita de ajustamento da osmolaridade. Furthermore, o meio Um fornecedor não partilha livremente as concentrações dos componentes do meio; utilizou-se 100 mg / L de cada uma para Lys, Tyr e Phe com sucesso. Os volumes do meio de transfecção e expressão deve ser ajustado para ter em conta os aminoácidos adicionados. Aqui estão as adaptações do protocolo acima para a rotulagem isótopo
  2. Suplemento a transfecção com uma pequena molécula
    1. Preparar a solução de estoque de 100 mM de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose usando água autoclavada e esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 um.
    2. Para uma cultura de 50 ml, adicionar 125 ul (a 250 uM) da solução de fucose analógico para o meio de transfecção e de diluição. Nota: Foram negligenciada para efectuar qualquer ajuste adicional de volume porque a adição do substituinte, pelo que esta representa concentração de apenas 0,25% do total .É volume de cultura é possível modificar a expressão utilizando pequenas moléculas inibidoras de processamento de glicano. Aqui nós descrevemos as condições para a inclusão de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose, um inibidor da fucosilação glicano. Encontrámos> 90% de redução em fucosilação adicionando o análogo de fucose na concentração de 250 uM em meio de transfecção e a diluição.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A expressão da proteína de alto nível e pureza

Este sistema de expressão optimizada gerado um elevado rendimento de proteínas glicosiladas. Um modelo típico é mostrado na expressão da IgG1-Fc (Figura 1). Neste caso, é o dia 0 o dia da transfecção seguido por Dia 1 (diluição) e dias de cultura subsequentes, até ao dia 5. A expressão da proteína é analisada utilizando a fracção de expressão solúvel no meio em br...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo ilustra a expressão de proteína através da transfecção transitória de células HEK293F ou S. As condições de transfecção ideais estabelecidos nos laboratórios Barb e Moremen empregam uma combinação crítica de concentrações densidade celular e reagentes para atingir alta eficiência de transfecção. Considerações críticas na aplicação da presente protocolo incluem: manutenção de uma cultura estável antes da transfecção (com a cultura consistente vezes duplicação); transfecção de células em crescimento activo ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes neste manuscrito.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelas subvenções K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dos Institutos Nacionais de Saúde, e por fundos do Roy J. Carver Departamento de Bioquímica, Biofísica e Biologia Molecular da Universidade de Iowa . O conteúdo desta obra é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Armário de biossegurançaNuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Classe II, Tipo A2 Agitador
incubaçãoINFORS HTMultitron Cell 
Médio A: Expressão FreeStyle Médio Life Technologies12338-018
Médio B: ExCell 293 Meio Sem SoroSIGMA14571C 
125 Erlenmeyer Frasco com Tampa VentiladaCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer com Tampa VentiladaCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Pipeta sorológica descartávelFisher Scietific13-676-10B
10 ml Pipeta sorológica descartávelFisher Scietific13-676-10J
25 ml Pipeta sorológica descartávelFisher Scietific13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Solução Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Contando lâminas Bio-Rad145-0011
TC20 Contador de Células Automatizado Bio-Rad 145-0102
Polietilenonimina (PEI)Polysciences Inc.23966Preparar a solução-mãe na concentração de 1 mg/ml num tampão contendo 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico (HEPES) e 150 mM de NaCl (pH 7,5). Dissolva completamente o PEI; esterilizar através de 0,22 μ M e armazene a -20 °C.
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
Filtro de Seringa de 25 mm, 0.22 μ MFisher Scietific09-719A
Trisaminometano (Base Tris)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
FlukaAnalytical 92144
químicos BDHde cloreto de sódioBDH8014
Kit de purificação de plasmídeoQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Prepare a solução estoque de 220 mM  em água, esterilize por passagem por um filtro estéril de 0,22 mm e armazene a -20 &
C CentrífugaThermo Scientific EW-17707-65
Coluna de proteína A-sepharoseSIGMAP9424
Ni-NTA superfluxoQIAGEN30430
Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlicinaFisher ScietificBP381-500
10 kDa corte de peso molecular Amicon® Filtros ultracentrífugos MilliporeUFC901096
Dodecil sulfato de sódioALDRICHL3771
Beta-mercaptoetanolALDRICHM6250
GlicerolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Ácido Acético, Glacial Fisher Scietific64-19-7
coomassie azul brilhante Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15NALDRICH332151
15N L-LisinaALDRICH592900
L-Fenilalanina Não MarcadaSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlicoseALDRICH389374
2- desoxi-2-fluoro-l-fucose SANTA CRUZ Biotecnologiasc-283123
Armário de Segurança Biológica de Extrato de levedura Produtos L-Tirosina marcada com L-Tirosina marcada com

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226(2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13(2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96(2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Errata

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Etiquetas

Recombinant Protein ExpressionGlycoprotein PurificationSuspension CultureAffinity PurificationCell Density MonitoringVPA TreatmentProtein Yield AnalysisGlycan Modification

Artigos relacionados