O uso de um compartimento Multi-dinâmica única enzima Fantasma de Estudos de hyperpolarized agentes Ressonância Magnética

Resumo

Um simulador dinâmico multicompartimental é usado para simular alguma biologia de interesse para estudos metabólicos usando agentes de ressonância magnética hiperpolarizada.

Resumo

Imagiologia de substratos hiperpolarizados por ressonância magnética mostra uma grande promessa clínica para avaliação de processos bioquímicos críticos em tempo real. Devido a restrições fundamentais impostas pelo estado hiperpolarizado, técnicas de imagem e reconstrução exóticas são comumente usados. Um sistema prático para a caracterização de, métodos de imagem multi-espectral dinâmicos é extremamente necessárias. Este sistema deve reproducibly recapitular a dinâmica químicos relevantes dos tecidos normais e patológicos. O substrato mais amplamente utilizado para data é hyperpolarized [1- ¹³ C] -pyruvate para avaliação do metabolismo do câncer. Descreve-se um sistema de fantasma à base de enzima que medeia a conversão de piruvato em lactato. A reacção é iniciada pela injecção do agente de hiperpolarizado em câmaras múltiplas dentro do fantasma, cada um dos quais contém diferentes concentrações de reagentes que controlam a velocidade de reacção. Vários compartimentos são necessárias para garantir que imasequências ging fielmente capturar a heterogeneidade espacial e metabólica do tecido. Este sistema vai ajudar o desenvolvimento ea validação de estratégias avançadas de imagem, fornecendo dinâmica química que não estão disponíveis a partir de fantasmas convencionais, bem como controle e reprodutibilidade que não é possível in vivo.

Introdução

O impacto clínico da ressonância magnética hyperpolarized (MRI) de ¹³ compostos C-rotulados é criticamente dependente da sua capacidade de medir as taxas de conversão química através de tempo real de ressonância magnética e espectroscopia espectroscopia de imagem ^1-5. Durante o desenvolvimento e sequência de verificação, de conversão química dinâmica é geralmente conseguida através do in vivo ou in vitro modelos ^6-9 que oferecem controlo limitado e reprodutibilidade. Para o ensaio robusto e de garantia de qualidade, um sistema mais controlado que preserva a conversão química endémica para esta medição seria preferido. Nós descrevem um método para alcançar essa conversão de uma forma reproduzível usando um único fantasma enzima dinâmico.

A maioria dos estudos com agentes hiperpolarizados ¹³ C concentrar em imagiologia de substratos hiperpolarizados num ambiente biológico em funcionamento. Esta é a escolha óbvia se o objetivo é estudar biológicaal processa ou determinar o potencial de impacto sobre cuidados clínicos. No entanto, se a caracterização de algum algoritmo de processamento de sistema de medição ou de dados é desejada, modelos biológicos têm inúmeras desvantagens, tais como variabilidade espacial e temporal inerente ^10. No entanto, fantasmas estáticos convencionais não têm a conversão química que conduz o interesse clínico primário em MRI de substratos hiperpolarizados, e não pode ser utilizado para caracterizar a detecção das taxas de conversão e outros parâmetros dinâmicos ^11. Usando um único sistema enzimático que possamos fornecer conversão química controlável e reprodutível, permitindo uma análise rigorosa das estratégias de imagem dinâmicos.

Este sistema é dirigido aos investigadores que estão a desenvolver estratégias de imagem para substratos hiperpolarizados e desejam para caracterizar o desempenho para comparação com abordagens alternativas. Se as medições estáticas são o ponto final desejado, em seguida, estático ¹³ metabólito labled-C fantasmas wivai bastar ^11. Na outra extremidade se mais caracterização biológica complexa é crítico para o método (a entrega, a densidade celular, etc), então os modelos biológicos reais será necessário ^14/12. Este sistema é ideal para a avaliação das estratégias de imagem que visam fornecer uma medida quantitativa das taxas de conversão química aparentes.

Protocolo

NOTA: (Fantasma de Design) Dois 3 ml câmaras foram usinadas fora de Ultem e equipado com um tubo de PEEK (1,5875 milímetros OD e 0,762 mm de diâmetro) para injecção e de escape. As câmaras foram colocados num tubo de centrífuga de 50 ml cheia de água (Figura 1). Para evitar espaços vazios criados pelo sinal bolhas, as câmaras e as linhas foram pré cheia com água desionizada _(dH2O).

1. Preparação de Soluções

1. Prepare 1 litro solução tampão (Tris 81,3 mM pH 7,6, NaCl 203,3 mM). Pesar 11,38 g de Trizma cristais predefinidos pH 7,6 e 11,88 g de NaCl e dissolvem-se em 1 L de _dH2O
2. Preparar solução de 50 mM de NADH. Pesar 17,8 mg de sal de dipotássio β-nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADH), reduzida e dissolve-se em 280 ul de solução tampão que foi preparado no passo um.
3. Preparar solução de 250 U / ml de enzima. Pesar 78,75 unidades de actividade de lactato desidrogenase (LDH) e dissolve-se em 315 ul de tampão de step uma.
4. Prepare mistura de ácido pirúvico. Pesar 21,4 mg Ox063 radical tritilo e dissolve-se em 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] ácido pirúvico.
5. Prepare meio de dissolução (40 mM Tris pH 7,6, NaOH 40 mM, EDTA 0,27 mM e NaCl 50 mM). Pesar 5,96 g de Trizma cristais predefinidos pH 7,6, 1,6 g de NaOH, 0,1 g de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado sal dissódico (EDTA) e 2,9 g de NaCl e dissolvem-se em 1 L de _dH2O
6. Preparar solução 1:10 gadoteridol (50 mM). Misture 1 ml de gadoteridol em 9 mL de dH ₂ O. Preparação de 8 M de ^[13 C] ureia. Pesar 1,465 5 ^[13 C] ureia e dissolvem-se em 3 ml de dH ₂ O.

2. Preparação de hyperpolarized Piruvato

1. Em um copo de amostra de um sistema dinâmico de polarização Nuclear (DNP), pipeta de 0,3 ul da solução gadoteridol e 13 mg (~ 10 ul) da solução de ácido pirúvico.
2. Resumidamente agitar esta mistura no copo de amostra com a ponta da pipeta.
3. Insira amostras para o sistema DNP.
   1. Assegurar a porta do sistema de DNP é fechada. Iniciar o processo de inserção de amostra clicando no botão amostra inserção no console do sistema DNP. No assistente de amostra selecionar amostra normal e pressione próximo.
   2. Mantendo o copo de amostra vertical, coloque delicadamente a haste de inserção sobre o topo do copo de amostra. Quando solicitado, abra o sistema DNP e inserir o copo na inserção de temperatura variável (VTI) com a cavilha de inserção.
   3. Puxar o êmbolo na extremidade da vareta de inserção da amostra para libertar a amostra do índice de temperatura variável. Retire a vareta de inserção amostra do sistema e clique no botão junto no console do sistema DNP.
4. Inicia-se a polarização.
   1. Clique no botão Iniciar polarização no console do sistema DNP. No RINMR tipo de software .HYPERSENSENMR para lançar polarização software de monitoramento. Definir construir configuração para 1 e pressione enter. Em seguida, clique construção sólida up.
   2. Definir o local eo nome do arquivo salvo. Selecione o perfil de 13-C na queda de guia no console do sistema DNP para baixo e clique em Avançar. Marque a caixa para provar durante a preparação, tempo de amostra definida para 300 segundos e clique em Concluir.
5. Medir-se 3,85 g (~ 4 ml) do meio de dissolução, quer por volume com uma seringa de 5 ml ou em peso, utilizando uma balança.

3. Preparação da Enzima Fantasma

1. Encher um tubo de microcentrífuga com ~ 3 ml de ^[13 C] a solução de ureia e colocá-lo no tubo de centrífuga de 50 ml. Encha o tubo de centrífuga de 50 ml com dH ₂ O.
2. Pré-preencher as duas câmaras de enzimas e as linhas com _dH2O, injetando ~ 3 ml _{de dH2O} para as linhas de injeção do fantasma, tendo o cuidado de lavar quaisquer bolhas formadas.
3. Coloque o fantasma no centro do magneto, com fácil acesso às linhas de injeção. Verifique se há algum recipiente para pegar o líquido que vai exalar para fora para t ele linha de escape.
4. Prepare mistura de enzimas de alta atividade (NADH 17,14 mM, 44.57 U / ml LDH). Misture a solução NADH 240 ul, 125 ul de solução de LDH e 335 ul de tampão e manter-se em uma seringa de 3 ml, que pode ser ligado à linha de injecção.
   Observação: Uma vez combinados com os 500 ul de piruvato de 40 mm a partir do sistema de DNP, o volume fantasma final será de 1,2 ml com concentrações de piruvato 16,7 mM, NADH 10 mM, e 26 U L LDH de / em uma solução tamponada com Tris com pH ~ 7.5.
5. Prepare baixo mistura actividade enzima (17,14 mM de NADH 26,79 U / ml LDH) Misturar 240 ul de solução de NADH, 75 ul de solução de LDH e 385 ul de tampão e manter-se em separado uma seringa de 3 ml, que pode ser ligado à linha de injecção.
   Observação: Uma vez combinados com os 500 ul de piruvato 40 mM a partir do sistema de DNP o volume fantasma final será de 1,2 ml com concentrações de piruvato 16,7 mM, NADH 10 mM, e 15.625 U L LDH de / em uma solução tamponada com Tris com pH ~ 7,5 .

jove_title "> 4. executar qualquer Quality Assurance (QA) e de posicionamento Scans

1. posicionamento inicial.
   1. Carregar uma nova varredura posicionamento FLASH no modo de operação ^[1 H] TX / RX modo de Volume. Alterar criados dimensões a 2: Ferramenta de Controle Spectrometer -> Editar GS -> Configuração Dimensões -> 2. Pressione GSP no Controle Spectrometer e mover phantom até centrado no ímã. Prima STOP, em seguida, pressione GOP sobre o Controle Spectrometer.
2. Piloto Scan.
   1. Carregar uma nova varredura posicionamento TriPiolt no modo de operação ^[1 H] TX / RX modo de Volume. Posição Slice: Controle de Digitalização -> Slice Tool-> mover as fatias (segure M clique de tecla e arrasto; selecione fatia para mover-se com o controle deslizante pacote de fatia).
   2. Wobble H bobina ^1: Ferramenta de Controle Spectrometer -> Acq -> Wobble. Tune and match ¹ H bobina atrás do ímã e pressione STOP. Enquanto mantém a tecla Shift pressione o semáforo na janela de controle de digitalização.

5. Setup Radial eco Planar espectral de imagem de digitalização

1. Carregar um planar echo imagens espectroscópicas nova radial (radEPSI) digitalizar no modo de operação ^[13 C] TX / RX modo de Volume. Posição Slice: Slice Tool no controlo de digitalização e mover as fatias (segure M clique de tecla e arrasto; selecione fatia para mover-se com o controle deslizante pacote de fatia).
2. Wobble ¹³ C bobina clicando Ferramenta de Controle Spectrometer -> Acq -> Wobble. Defina o ganho do receptor para 1000-2000 na Spectrometer.
3. Realizar a verificação final do sistema. Dependendo da sequência, observar o sinal de carbono 13 da câmara de ureia num protocolo de batedor.
   NOTA: Isso garante que o sistema está configurado corretamente antes de iniciar o processo de dissolução irreversível.

6. Run Dissolução

1. Quando o piruvato alcançou> 90% de polarização (~ 1 hora), as soluções e phantom estão prontos, ea digitalização é configurado clique no botão de execução dissolução na sy DNP-tronco console.
2. Quando solicitado mover a alavanca de dissolução em posição de funcionamento e injetar meios de dissolução. Feche o sistema de DNP e clique no botão acabado no console do sistema DNP. Mova vara dissolução de volta à posição de repouso quando solicitado, em seguida, clique em Concluir.
3. Quando o sistema proporciona o DNP piruvato hiperpolarizado (~ 2 min após o início do aquecimento) retirar a 500 ul da solução de piruvato para cada uma das seringas solução de alta e baixa concentração de enzima. Lentamente (~ 10 seg) injectar cada seringa para uma linha de injecção.
   Nota: A digitalização pode ter sido iniciada antes da injecção ou a qualquer momento se a injecção de pós 3 minutos, dependendo do protocolo de verificação utilizado.

Processamento 7. Imagem

NOTA: Este simulador foi projetado para uso com muitas estratégias de imagem. Ver Figura 2, como um exemplo de como as imagens Rad-Epsi foram processados ​​usando Matlab.

1. Carregar dados brutos a partir do arquivo FID. Reshape os dados para coincidir com o número de projeções, leu pontos, ecos e conta para os dados armazenados como pares reais e imaginários. Separar os pontos de eco pares e ímpares.
2. Transformada de Fourier, quer os ecos pares ou ímpares ao longo das dimensões de eco. identificar visualmente as faixas de frequências para piruvato e lactato. Para simplicidade foi utilizado o valor absoluto do espectro.
3. Separe cada banda metabólito e transformada de Fourier ao longo da direção de codificação de frequência para produzir sinograms isoladas para cada metabólito. radon inversa transformar as sinograms separadas para produzir uma imagem de lactato ou piruvato.

Resultados

imagens 2D fatia selectivos foram adquiridos utilizando uma sequência instantâneo radEPSI. imagens de metabólitos foram reconstruídos usando filtrada volta projeção. As imagens metabolito foram bem alinhados com as imagens de protões, como se vê na Figura 2. Nesta sinal lactato hyperpolarized sistema só pode ser gerado a partir da conversão enzimática de piruvato hiperpolarizado. Na Figura 4, a câmara de fundo, com a maior concentração de LDH, tem uma fo...

Discussão

imagens em tempo real de metabólitos hiperpolarizados tem muitos desafios únicos para o projeto de sequência, validação e controle de qualidade. A capacidade de resolver a heterogeneidade espaço-temporal e espectral oferece potencial clínico substancial, mas opõe-se a métodos de controle de qualidade e validação associados com a RM convencional. sequências de imagens complexas ou algoritmos de reconstrução pode ter dependências sutis que os tornam difíceis de caracterizar ou validar fora da experiência de imagem. Hetero...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Scanner de ressonância magnética pré-clínica	BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Polarizador Nuclear Dinâmico para agentes de ressonância magnética
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 ácido pirúvico puro rotulado
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Radical livre usado em Polarização Nuclear Dinâmica
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ácido etilenodiaminotetracético
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactato Desidrogenase do músculo de coelho
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo, sal dipotássico reduzido
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Cristais pré-definidos
NaCl	Sigma Aldrich	S7653

7 Tesla