Abstract
Histona-desacetilases 1 e 2 (HDAC1,2) localizam os sítios de replicação do ADN. No estudo anterior, utilizando-se um inibidor selectivo e um sistema genético knockdown, que mostrou novos funções para HDAC1,2 na replicação garfo progressão e manutenção nascente cromatina em células de mamífero. Além disso, usamos uma técnica BrdU-chip-Slot-ocidental que combina imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) DNA marcado com com slot blot e análise Ocidental para medir quantitativamente proteínas ou modificação da histona associadas com DNA nascente.
Activamente células em divisão foram tratados com HDAC1,2 inibidor selectivo ou transfectadas com ARNsi contra HDAC1 e HDAC2 e, em seguida, o ADN recém-sintetizado foi marcado com o análogo de timidina bromodesoxiuridina (BrdU). A marcação com BrdU foi realizada em um ponto de tempo quando não havia paragem do ciclo celular ou apoptose significativa devido à perda de funções HDAC1,2. Seguindo lAbeling de células com BrdU, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de marcas de acetilação de histonas ou da cromatina-remodeler foi realizada com anticorpos específicos. Entrada de ADN marcadas com BrdU e o imunoprecipitado (ou chiped) DNA foi então manchado para uma membrana utilizando a técnica de fenda blot e imobilizada utilizando UV. A quantidade de ADN nascente em cada slot foi depois avaliado quantitativamente usando análise de Western com um anticorpo anti-BrdU. O efeito da perda de funções HDAC1,2 sobre os níveis de histonas recentemente sintetizadas marcas de acetilação associado com ADN e cromatina remodeler foi então determinada através da normalização do sinal de BrdU-chip obtidos a partir das amostras tratadas para as amostras de controlo.
Introduction
Reparação de ADN defeituosos e / ou a replicação de DNA são uma das principais causas de instabilidade do genoma, o que pode provocar a morte celular. Uma única quebra de cadeia dupla unrepaired é suficiente para causar morte celular 1. Organização da cromatina é transitoriamente alterada durante a replicação e reparar 2,3, e falha em manter a informação epigenética durante esses processos irão resultar em uma ameaça à integridade do genoma. Perda de HDAC3 ou função HDAC1,2 impede a progressão da fase S, replicação e reparação do ADN, levando ao estresse genotóxico (dano ao DNA) e morte celular 4-9. É, por conseguinte, uma estratégia prático utilizar os inibidores de HDAC selectivos para interromper a replicação, reparação e cromatina em células cancerosas e causar danos no ADN, que por sua vez pode parar o crescimento e induzir a morte celular selectiva, em que crescem rapidamente células cancerosas.
Durante a replicação do DNA, cromatina é rapidamente desmontada e remontada em seguida, seguir a duplicação do DNA. Recém-synthesized histona H4 acetilada é a K5 e K12 (H4K5K12ac resíduos) e a seguir para a deposição de cromatina, são rapidamente desacetilado por histona desacetilases (HDACs) 10,11. A falha das células para manter a integridade da cromatina nascente pela histona desacetilação pode conduzir ao colapso da forquilha, que por sua vez pode resultar em danos no ADN e morte celular. Nós recentemente mostrou que a inibição seletiva de HDAC1,2 aumenta acetilação das histonas (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibe a atividade SMARCA5 cromatina remodeler na cromatina nascente, que se correlaciona com a redução da progressão da forquilha de replicação, maior colapso garfo e aumento da replicação do estresse induzido por danos no DNA 6 . Assim, o tratamento com inibidor de HDAC podem alterar a estrutura da cromatina nascente para provocar danos no ADN e morte muito rapidamente em células de cancro, uma vez que estas células ciclo rapidamente e muitas vezes passar através da fase-S. Por isso, é importante entender como HDACs funcionar para regular acetilação das histonas e bindi proteínang de manter replicação de ADN em células de mamífero.
Para medir quantitativamente a quantidade de acetilação das histonas e SMARCA5 remodeler cromatina associada à DNA durante a replicação do DNA nascente, eu inventei um ensaio ChIP modificada chamada a técnica de BrdU-chip-Slot-ocidental. Após imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de uma modificação da proteína ou histona desejado, a quantidade de ADN nascente (marcado utilizando análogo da timidina, BrdU) na amostra de chip pode ser detectada por meio de análise ocidental da marcadas com BrdU chip de ADN transferido para uma membrana utilizando um entalhe Aparelho Blot. Usando esta técnica, nós mostramos que H4K16ac (a marca envolvido em embalagem cromatina) eo membro da família ISWI SMARCA5 (dependente de actina regulador associada à matriz relacionada com o SNF SWI / da cromatina) remodeler cromatina estão associados com DNA nascente em células em fase S 6. Também descobrimos que a marca H4K16ac nascente é desacetilada por HDAC1,2 durante a replicação do DNA 6. Inibe H4K16acatividade remodeler cromatina do membro da família ISWI SMARCA5 12. Assim, usando a técnica de-BrdU-CHIP-Slot Ocidental, podemos conectar as funções para HDAC1,2 na regulação da remodelação da cromatina durante a replicação do DNA. Assim, a técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot é uma abordagem poderosa para medir quantitativamente a associação e dissociação dinâmica de proteínas ou suas modificações pós-traducionais que são obrigados a DNA nascente.
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Protocol
1. A cromatina imunoprecipitação (CHIP) seguinte BrdU Labeling
- Culturas de células NIH3T3 na presença de DMSO ou inibidores selectivos HDAC1,2-6, como descrito anteriormente.
- A seguir ao tratamento com inibidores selectivos de DMSO ou HDAC1,2, adicionar BrdU para as células de uma cultura de tecido estéril capa. Incubar 2 x 10 6 NIH3T3 células plaqueadas em 10 ml de meio NIH3T3 com 20 uM de concentração final de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 min num estéril 37 ° C incubadora de cultura de tecidos.
- Proteínas intracelulares Crosslink ao DNA por adição de formaldeído directamente ao meio de cultura a uma concentração final de 1%. Incubar 2 X 10 6 células NIH3T3 com formaldeído à temperatura ambiente durante 10 minutos num agitador.
- Extingue-se a ligação cruzada pela adição de glicina para uma concentração final de 125 mM. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min num agitador.
- Remover os meios de comunicação e recolher células em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml. Spin cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lava-se a pelete de células duas vezes com PBS gelado. Remover o PBS do tubo. Armazenar o sedimento celular reticulada sem PBS (o sobrenadante) a -80 ° C até à sua utilização.
- Prepara-se o lisado a partir do sedimento celular reticulada por adição de tampão de FA140 500 ul (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e desoxicolato de sódio a 0,1%) suplementado com cocktail inibidor de protease.
- Distorcer a cromatina por sonicando as amostras de cinco vezes a 35% de energia e com um pulso de 15 segundos, 0,9 segundos em 0,1 segundos e fora configuração. Manter os tubos em gelo após cada rodada de sonicação para evitar o aquecimento das amostras.
- Verificar o corte num gel de ADN como a eficiência de cisalhamento vai variar entre diferentes sonicadores. Para verificar ultra-sons, reverter ligações cruzadas pela adição de NaCl a uma concentração de 0,16 M e executar etapas 1.17.1. - 1.22. Run eluída 10 ul DNA em gel de agarose 1,5% para verificar se o corte éentre 300-700 pb com uma intensidade média de 500 pb.
- Após sonicação, amostras de centrifugação durante 10 min a 17.949 xg, a 4 ° C, e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
- Executar a estimativa de proteína utilizando o kit de ensaio de proteínas comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Use igual quantidade de lisado para Chip de controle e amostras experimentais. De um modo geral, usar 1 mg de lisado total por reacção de chip.
- Preparar pasta a 50% de proteína A-agarose usando tampão contendo FA140 cocktail inibidor de protease. Adicionar 1/10 volume de cocktail inibidor de protease. Calcular o volume de grânulos necessário com base no número de amostras no total.
- Lavar os grânulos de proteína A-agarose com tampão FA140 duas vezes para remover o tampão de armazenamento e adicionar um volume igual de tampão FA140 aos grânulos para fazer pasta a 50%.
- Para remover as proteínas que se ligam de forma não específica às pérolas, adicionar 50 ul de pasta a 50% de Proteína A-agarose e emCubate as amostras a 4 ° C com rotação constante extremidade-sobre-extremidade num misturador espeto rotativo durante 30 min.
- Rotação das amostras a 956 xg, a 4 ° C durante um minuto. Recolhe-se o sobrenadante e realizar a imunoprecipitação pela adição de 8 pi de anticorpo quer H4K16ac ou 5 ul (5 ug) de 1 mg / ml de anticorpo SMARCA5 para o sobrenadante. Incubar a 4 ° CO / N com uma rotação de extremidade sobre extremidade constante num misturador de assador.
- Salve o 1 / 10th do extrato para o controle 'input' e configure-o como de lado a -20 ° C. A entrada tem de ser inversa reticulada juntamente com as amostras IP.
- Usar uma quantidade igual de IgG de coelho (5 ul de 1 mg / ml) tal como a amostra de controlo negativo imunoprecipitação.
- No dia seguinte, adicionar 50 ul de 50% de proteína A-agarose slurry ao extracto e incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação.
- Pellet pérolas de agarose por centrifugação a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, remover cuidadosamente o sobrenadante e wash os grânulos com os seguintes tampões sequencialmente. Em preparações de buffer, adicione os inibidores da protease direita antes de usar.
- Lavar com Baixo Sal complexo imune tampão de lavagem (FA140; concentração final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e 0,1% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade.
- Lavar com alto de sal complexo imune tampão de lavagem (FA500; concentração final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e 0,1% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade.
- Lava-se com LiCl complexo imune tampão de lavagem (concentração final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% NP40 e 0,5% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade.
- Após lavagens, tal como descrito acima, adicionar 200 ul de solução de eluição (concentração final de SDS a 1% e bicarbonato de sódio 100 mM) e incubate à temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação de extremidade sobre extremidade à TA.
- Rotação das amostras a 956 xg à temperatura ambiente e transferir o eluato para um novo tubo de 1,5 mL. Repetir o passo 1.15 com solução de eluição adicional de 200 ul.
- A 400 ul do eluato, adicionar NaCl a uma concentração de 0,16 M e misturar bem.
- Além disso, adicionar solução de eluição de 400 uL a 10 uL de entrada que foi posto de lado (passo 1.11) e adicionar a uma concentração de NaCl de 0,16 M a inverter amostras de entrada de reticulação bem. Inverter a ligação cruzada das amostras por incubação a 65 ° C em banho de água durante 5 horas.
- Adicione 1 ml de EtOH a 100% para o produto de eluição inversa reticulado. Misturar bem e incubar à temperatura de -80 ° C durante 2 - 3 h a -20 ° ou CO / N. Rodar as amostras a 17.949 xg durante 15 min e descartar etanol.
- Adicionar 800 ul de etanol a 70% para lavar o sedimento. Rotação em 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C e descartar etanol. Rotação brevemente para remover o etanol residual qualquer. Secar as amostras a 37 ° C durante 10 min para remover o etanol residual.
- Dissolve-se o ADN em 90 ul de ARNase e ADNase isenta de água e adiciona-se 2 ul de 10 mg / ml de RNase com uma solução a 0,2 mg / ml de concentração final. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 30 min.
- Adicionar 10 ul de Tampão Proteinase K 10x (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM de EDTA, pH 8,0, SDS a 5%). Misturar bem e adicionar 1 ml de Proteinase K. Incubar a 42 ° C durante 1 h.
- Purificar DNA de entrada e chip usando kit comercial de purificação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante e eluir DNA em 50 ul de água. ADN Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
2. Slot de Blot Análise de DNA ChIP
- Medir o rendimento de ADN de entrada e ChIP eluída em 50 ul de água, tal como descrito na etapa 1,22 utilizando um espectrofotómetro a 280 nm de acordo com o protocolo do fabricante.
- Aqui volumes iguais (50 ul) de entrada ou de ADN imunoprecipitado que estão dentro do intervalo linear de detecção.
- Por exemplo, se a entradaRendimento de DNA é de 1,5 ng / mL, em seguida, tomar 30 ul (ou 45 ng de DNA total) e fazer volume para 50 mL com água. Para o fator Chip, tomar todo o fluido 50 ul do Passo 2.1 e vá para a etapa 2.3.
- Desnaturar 50 ul de entrada ou de ADN imunoprecipitado pela adição de 2,5 volumes de NaOH 0,4 N, vortex brevemente e centrifuga-se durante 956 xg durante 10 seg, e incubar à TA durante 30 min.
- Neutraliza-se a ADN desnaturado através da adição de 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugar para 956 xg durante 10 seg e colocar as amostras em gelo.
- Prepara-se uma diluição em série de entrada e de ADN imunoprecipitado para o ensaio de transferência de entalhe, conforme descrito abaixo.
- Siga passos 2.3 - 2.4 para obter um volume total de amostra de 350 uL (ou seja, 50 ul de entrada / ADN Chip, 125 uL de NaOH 0,4 N, 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8).
Nota: Para o exemplo acima referido, 45 ng de DNA de entrada vai acabar sendo 0,129 ng / mL. - Para DNA de entrada, rotular três tubes como 100, 50 e 25 e adiciona-se 100 ul, 50 ul e 25 ul da amostra de DNA desnaturada e neutralizada. Completar o volume final de 100 ul com água isenta de nuclease. Para chip de ADN, a etiqueta como três tubos 200, 100 e 50 e adicionar 200 ul, 100 ul e 50 ul da amostra de DNA desnaturada e neutralizada. Faça volume final para 200 mL com água livre de nuclease.
- Siga passos 2.3 - 2.4 para obter um volume total de amostra de 350 uL (ou seja, 50 ul de entrada / ADN Chip, 125 uL de NaOH 0,4 N, 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8).
- Cortar a membrana com o tamanho do aparelho de slot blot. Pré-molhou a membrana e papéis mata-borrão em 20x SSC antes e antes da adição do DNA. Montá-los no aparelho de slot blot de acordo com o protocolo do fabricante.
- DNA Pipet do passo 2.5.2 em slots apropriados. Aplicar vácuo para puxar lentamente o ADN sobre a membrana Zeta-probe. Pare de vácuo depois de todas as amostras passaram pelo aparelho.
- Desmontar o aparelho e imobilizar imediatamente o ADN para a membrana utilizando um reticulador de UV. Ter a cara da DNA-se no reticulador UV e usar o autocrosslink configuração em que o agente reticulante. Siga o protocolo do fabricante.
- Detectar BrdU no blot ranhura através da realização de transferência de western.
- Bloquear a membrana com 5% de leite seco não gordo em PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 h à TA, para impedir a ligação não específica de anticorpos contra a membrana.
- Adicionar anticorpo primário anti-BrdU (diluição 1: 500) diluída em 1% de leite seco não gordo em PBST e incubar o blot com o anticorpo primário durante 3 horas à temperatura ambiente num agitador. Lava-se a membrana com PBST três vezes após a incubação do anticorpo primário.
- Adicionar anticorpo conjugado com HRP anti-ratinho secundário para o blot (1: 5000 de diluição) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lava-se a membrana com PBST três vezes após a incubação do anticorpo secundário.
NOTA: Use um volume suficiente de anticorpos para cobrir completamente a membrana durante incubações de anticorpos primários e secundários.
- Preparar a mistura de ECL e adicioná-lo à ac blotgundo o protocolo do fabricante. Incubar a membrana com uma mistura de ECL durante 5 min à TA.
- Colocar a membrana em uma cassete de raios-X, expor a membrana a um filme de raios-X e desenvolver o blot utilizando o protocolo do fabricante.
- Quantificar o sinal obtido para entrada e DNA chiped após a digitalização das manchas usando o software Image J de acordo com o protocolo do fabricante. Para quantificação, usar o sinal que está dentro da gama linear de detecção, a fim de garantir a precisão da medição.
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Representative Results
Para determinar a especificidade dos inibidores selectivos HDAC1,2, foram usadas Hdac1,2 FL / FL e FL HDAC3 / FL células de fibrossarcoma. Foi utilizado a recombinase Cre (Ad-Cre) contendo adenovírus para excluir Hdac1,2 e HDAC3 nestas células. Após a infecção Ad-Cre de Hdac1,2 FL / FL células, foi observado um aumento robusto na H4K5ac. O tratamento de células com knockout Hdac1,2 233 ou 898, não resultou em qualquer aumento adicional na H4K5ac confirmando que 233 e 898 e não inibem Hdac1,2 HDAC3 nestas células. Em contraste, a adição de 233 ou 898 para as células knockout HDAC3 resultou num aumento significativo na H4K5ac em comparação com o aumento observado nas células knockout HDAC3 devido a um efeito aditivo sobre os níveis H4K5ac como um resultado da inibição de Hdac1,2 e 3. Assim, 233 e 898 são HDAC1, inibidores da 2-selectivos. Estes resultados são mostrados nasFigura 1.
Para validar a técnica BrdU-chip-Slot, análise BrdU-pulse chase foi realizada a olhar para a cinética de PCNA carregamento para o DNA nascente em células HeLa. Nossos resultados mostraram que a associação com PCNA DNA nascente ocorre rapidamente dentro de 15 minutos e desaparece depois de 30 minutos de perseguição, de acordo com resultados publicados anteriormente 13. Estes resultados são mostrados na Figura 2.
Técnica BrdU-H4K16ac ChIP-Slot-de Western foi utilizada para determinar a quantidade de H4K16ac associada com o ADN nascente, na ausência da função HDAC1,2. Um enriquecimento robusta em H4K16ac associada com o ADN nascente foi observada quando em comparação com o controlo de IgG de coelho (Figuras 3A e 3B). O aumento na nascente H4K16ac-ADN associado com a inibição das actividades HDAC1,2 ou knockdown de Hdac1,2 é mostrado na Figura 3C strong>, 3D e 3E.
O nível de SMARCA5 cromatina remodeler no DNA nascente foi determinada utilizando-BrdU SMARCA5 técnica de ChIP-Slot Ocidental. Os nossos resultados mostraram que os associados com o ADN nascente SMARCA5 em células de mamífero. Além disso, a inibição ou eliminação de HDAC1,2 Hdac1,2 não alterou a quantidade de ADN nascente associados-SMARCA5 cromatina remodeler como mostrado na Figura 4.
Figura 1. Confirmação da especificidade dos inibidores selectivos HDAC1,2. Análise de Western de lisados de células totais preparados a partir de HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL ou células de fibrossarcoma HDAC3 FL / FL seguintes infecção Ad-Cre e 898 ou com o tratamento233. As células foram tratadas com 3? M 898 ou 233, durante 24 h, 48 h após uma infecção Ad-Cre. Este valor é derivado do nosso anterior trabalho publicado 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Dinâmica do PCNA associação com o DNA Nascente em células HeLa. Células HeLa foram marcadas com bromodeoxiuridina (BrdU) durante 30 min. As células foram então lavadas para remover não incorporada BrdU e cultivadas em meio sem BrdU por períodos de tempo indicados (Chase). Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foi realizada com o antígeno nuclear de célula anti-proliferante (PCNA) anticorpo. ADN marcado com BrdU presente no DNA de entrada e as associadas com o PCNA foram avaliados na análise de mancha de slot utilizando um anti-BRDU anticorpo como mostrado na Figura 2. Este valor é derivado do nosso anterior trabalho publicado 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Perda da histona-desacetilase 1 e 2 aumenta H4K16ac em ADN nascente. (AB) Bromodeoxiuridina (BrdU) perseguição de impulso foi realizado em células HeLa e NIH3T3 para determinar associação de H4K16ac com o ADN nascente nos pontos de tempo indicados. (CD) células NIH3T3 foram tratadas com DMSO ou um inibidor selectivo HDAC1,2 (898 ou 233), durante 24 h. Células (E) NIH3T3 ou foram transfectadas com não-alvo (NT) ou Hdac1,2 (H12) siRNA. As células a partir de (C - E) foram marcadas com BrdU e utilizadospara chip com anti-H4K16ac seguido por slot blot. A membrana foi sondada com anticorpo anti-BrdU. Os números indicam a Imagem J quantificação do sinal média BrdU do volume alto e médio de DNA ChIP manchado. Este valor é derivado do nosso anterior trabalho publicado 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. SMARCA5 Associates com DNA Nascente. A quantidade de SMARCA5 na cromatina nascente seguinte perda de função HDAC1,2 é mostrado. Células NIH3T3 ou foram tratados com um inibidor selectivo HDAC1,2 (898) ou transfectadas com não-alvo (NT) ou Hdac1,2 (H12) siRNA. As células foram marcadas com BrdU após os tratamentos e chip acima mencionados com anti-IgG de coelho SMARCA5 ou (c negativoontrolo) foi realizada. Volumes crescentes de ADN de chip foi manchada sobre o blot ranhura e a membrana foi sondada com anticorpo anti-BrdU. Este valor é derivado do nosso anterior trabalho publicado 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito neste manuscrito é um método relativamente rápido para demonstrar a presença das proteínas ou as suas formas modificadas pós-tradução de DNA recentemente replicado ou nascente. Além disso, esta técnica permite um para medir a cinética da associação, dissociação de uma proteína ou a sua forma modificada com o ADN nascente. Esta técnica é complementar da tecnologia elegante iPOND 13. Na tecnologia iPOND, ADN sintetizado de novo é marcado com acetato de desoxiuridina (EdU). Um conjugado biotina é então adicionado para EdU usando o clique química. ADN nascente marcado com biotina é então imunoprecipitadas utilizando contas de estreptavidina e as proteínas co-purificação são detectados por Western blotting. Por outro lado, na nossa técnica de BrdU-Chip-Slot-ocidental, uma proteína ou a sua forma modificada associada com o ADN nascente é imunoprecipitada utilizando específico para a proteína ou o anticorpo específico da forma modificada e a quantidade de ADN nascente marcadas com BrdU ligado ao proteína é then determinada quantitativamente por transferência de Western utilizando-slot um anticorpo anti-BrdU.
Há passos críticos neste protocolo que precisa de atenção especial. É crítico para assegurar que o anticorpo de interesse funciona bem em ensaios ChIP padrão com uma alta eficiência. É importante para testar a eficácia de um anticorpo em ensaios de chip ao quantitativo-PCR antes da realização do ensaio BrdU-Chip-entalhe Ocidental. Para a quantificação da técnica-BrdU-Chip-entalhe ocidental para ser preciso, uma diluição em série de ADN marcado com BrdU deve ser aplicado para blot ranhura e análise de Western utilizando o anticorpo anti-BrdU deve ser inicialmente realizado a fim de determinar a gama linear de detecção. Determinação da concentração de ADN de chip e ADN de entrada permite que se garantir que a quantidade de ADN marcado com BrdU está dentro do intervalo linear de detecção em Western blotting. Por exemplo, determinou-se 50 ng e 12,5 ng de ADN de entrada para aa gama linear em nossa experiência-piloto. Além disso, se a concentração das amostras de aparas é muito elevado, é imperativo para diluir o ADN de chip antes da realização de ranhura. A limitação desta técnica é a sua resolução, a qual é dependente da eficiência de corte da cromatina. A tosquia da cromatina por sonicação determina a proximidade de uma dada proteína, ou a sua forma modificada para o ADN recém-sintetizado.
No passado, o estudo das mudanças na cromatina e enzimas modificadoras da cromatina durante a replicação do DNA em células de mamíferos permaneceu uma pergunta difícil de abordar, devido à indisponibilidade de técnicas adequadas. Além disso, uma vez que as células Hdac1,2-nulos de captura em fase G1, que era difícil de examinar funções Hdac1,2 para dentro da fase S. Em nosso estudo, mostramos as funções para estes dois HDACs durante a replicação do DNA usando uma combinação de inibidores seletivos primeiro-in-class para inibir suas atividades dentro da fase S e do romance BrdU-chip-Stécnica muito ocidental. No futuro, esta técnica também pode ser usada para estudar a dinâmica das proteínas de resposta de dano de ADN e de reparação do ADN na bifurcação parado além de estudar as modificações de histonas e enzima de modificação de cromatina na bifurcação. Além disso, esta técnica não é limitada às células do rato NIH3T3. Esta técnica pode ser utilizada com sucesso em outras linhas de células, a fim de investigar como outros inibidores de enzimas ou proteínas de afectar a replicação de ADN e replicação alterações induzidas pelo stress cromatina no garfo de replicação.
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Acknowledgments
O trabalho neste manuscrito foi apoiada por fundos do Departamento de Radioterapia Oncologia e Huntsman Cancer Institute e do Instituto Nacional de concessão de Saúde (R01-CA188520) para SB. Agradeço Danielle Johnson e Steven Bennett no meu laboratório para demonstrar o protocolo e explicando os seus benefícios. Sou grato ao Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) para comentários críticos sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
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