Abstract
Гистондезацетилаз 1 и 2 (HDAC1,2) локализуются в местах репликации ДНК. В предыдущем исследовании, используя селективный ингибитор и генетическую систему нокдаун, мы показали новые функции для HDAC1,2 в репликации прогрессии вилкой и зарождающейся обслуживания хроматина в клетках млекопитающих. Кроме того, мы использовали технику BrdU-чип-Slot-Западный, который сочетает хроматина иммунопреципитацию (чип) в бром-дезоксиуридина (BrdU), меченным ДНК с игрового блоттинга и Западной анализирует количественно измерить белки или модификацию гистонов, связанные с зарождающейся ДНК.
Активно делящиеся клетки обрабатывали селективного ингибитора HDAC1,2 или трансфицировали киРНК против Hdac1 и HDAC2, а затем вновь синтезированный ДНК метили с аналог тимидина бромдезоксиуридина (BrdU). BrdU маркировки было сделано в момент времени, когда не было никакого значительного клеточного цикла или апоптоз из-за потери функций HDAC1,2. После лabeling клеток с BrdU, иммунопреципитация хроматина (чип) ацетилирования гистонов марок или хроматина Remodeler была выполнена со специфическими антителами. BrdU-меченых ДНК вход и иммунопреципитировали (или ChIPed) ДНК затем наносили на мембрану с использованием метода слот-блоттинга и обездвижен с помощью УФ. Количество ДНК возникающей в каждом слоте затем количественно оценивали с помощью Вестерн-анализа с анти-BrdU антителами. Эффект потери HDAC1,2 функций на уровне вновь синтезированных ДНК-ассоциированных ацетилирование гистонов знаков и хроматина Remodeler Затем определяли путем нормализации сигнала BrdU-чипе, полученный из обработанных образцов на контрольных образцах.
Introduction
Неисправный репарации ДНК и / или репликация ДНК являются основной причиной нестабильности генома, которые могут вызвать гибель клеток. Один без ремонта двойной брейк прядь достаточно, чтобы вызвать гибель клеток 1. Хроматина организация временно изменены во время репликации как и ремонт 2,3, и неспособность поддерживать эпигенетической информации во время этих процессов приведет к угрозе целостности генома. Потеря HDAC3 или функции HDAC1,2 препятствует S-фазе прогрессирования, репликацию ДНК и ремонт, ведущий к генотоксичного стресса (повреждение ДНК) и гибели клеток 4-9. Таким образом, это практично использовать стратегию ингибиторы HDAC селективные нарушить репликации, ремонт и хроматин в раковых клетках и вызывают повреждение ДНК, что в свою очередь может остановить рост и индукции гибели клеток избирательно в быстро растущих раковых клеток.
Во время репликации ДНК, хроматин быстро разобрали, а затем собраны следующие дублирования ДНК. Недавно SYnthesized гистона Н4 ацетилированный в K5 и K12 остатков (H4K5K12ac) и после осаждения на хроматина, они быстро деацетилируется по гистондезацетилаз (HDACs) 10,11. Отказ клеток для поддержания целостности зарождающегося хроматина гистона дезацетилирования может привести к краху вилкой, которая в свою очередь может привести к повреждению ДНК и гибели клеток. Мы недавно показали, что селективное ингибирование HDAC1,2 увеличивает ацетилирование гистонов (H4K5ac, H4K12ac и H4K16ac) и ингибирует SMARCA5 хроматина Remodeler деятельность на зарождающейся хроматина, которая коррелирует с уменьшением прогрессирования вилкой репликации, увеличение вилки крах и увеличение репликации стресс-индуцированной повреждение ДНК 6 , Таким образом, обработка ингибитором HDAC может изменить зарождающийся структуру хроматина, чтобы вызвать повреждение ДНК и смерть очень быстро в раковых клетках, так как эти клетки цикла быстро и многократно проходить через S-фазе. Поэтому важно, чтобы понять, как функционируют HDACs регулировать ацетилирование гистонов и белка биндинг поддерживать репликацию ДНК в клетках млекопитающих.
Для количественного измерения количества ацетилирования гистонов и SMARCA5 хроматина Remodeler, связанной с зарождающейся ДНК во время репликации ДНК, мы разработали модифицированный чип анализ называется BrdU-чип-слот-западный технику. После иммунопреципитации хроматина (чип) желаемого белка или модификации гистонов, количество возникающей ДНК (обозначенный с помощью аналог тимидина, BrdU) в образце чип может быть обнаружен с помощью Вестерн-анализа с BrdU-меченых ДНК-чип переносили на мембрану с использованием щелевой Клякса аппарат. Используя эту технику, мы показали, что H4K16ac (отметка участвует в хроматина упаковки) и член ISWI семьи SMARCA5 (SWI / SNF, связанных с матрицей-ассоциированной актина-зависимой регулятором хроматина) хроматина перемодельер связаны с возникающей ДНК в S-фазе клеток 6. Мы также обнаружили, что зарождающаяся H4K16ac знак деацетилируется по HDAC1,2 во время репликации ДНК 6. H4K16ac ингибируетхроматина перемодельер деятельность члена семьи ISWI SMARCA5 12. Отсюда, используя технику BrdU-ЧИП-Slot-Западный, мы могли бы соединить функции для HDAC1,2 в регулировании ремоделирования хроматина во время репликации ДНК. Следовательно, методика BrdU-чип-слот-Вестерн-блот является мощным подход для количественного измерения динамики ассоциации и диссоциации белков или их пост-трансляционных модификаций, которые связаны с нарождающейся ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. иммунопреципитации хроматина (чип) после BrdU маркировки
- Культура клеток NIH3T3 в присутствии либо ДМСО или HDAC1,2-селективных ингибиторов, как описано ранее 6.
- После лечения с селективных ингибиторов ДМСО или HDAC1,2, добавить BrdU в клетки в стерильной капот культуры ткани. Инкубируют 2 х 10 6 клеток NIH3T3 засевали в 10 мл среды с NIH3T3 20 мкМ конечной концентрации бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 60 мин в стерильный 37 ° C инкубаторе тканевых культур.
- CrossLink внутриклеточными белками с ДНК путем добавления формальдегида непосредственно в культуральную среду в конечной концентрации 1%. Инкубируют 2 х 10 6 клеток NIH3T3 с формальдегидом при комнатной температуре в течение 10 мин в шейкере.
- Гасят сшивание путем добавления глицина до конечной концентрации 125 мМ. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин в шейкере.
- Удалить СМИ и сбора клеток в PBS в 15 мл центрифужную пробирку. Спин челLs 956 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Промыть осадок клеток в два раза охлажденным на льду PBS. Удалить PBS из трубки. Хранить сшитый осадок клеток без PBS (супернатант) при температуре -80 ° С до использования.
- Подготовка лизат из сшитого осадок клеток путем добавления 500 мкл FA140 буфера (50 мМ HEPES KOH, рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1% Тритон-Х-100 и 0,1% дезоксихолат натрия) дополнить ингибитором протеазы коктейль.
- На сдвиг хроматина обработкой ультразвуком образцов в пять раз на 35% мощности, а также с 15 сек импульсом 0,9 сек и 0,1 на сек выключения настройки. Держите труб на льду после каждого раунда ультразвуком, чтобы избежать нагрева образцов.
- Проверьте сдвиг в геле ДНК как эффективности сдвига будет меняться между различными sonicators. Чтобы проверить ультразвуком, обратный поперечных связей путем добавления NaCl до концентрации 0,16 М в и выполните шаги 1.17.1. - 1,22. Выполнить элюировали 10 мкл ДНК на 1,5% агарозном геле, чтобы проверить, является ли сдвигового усилия составляетмежду 300 - 700 пар оснований со средней интенсивностью при 500 п.н..
- После обработки ультразвуком образцов центрифуги в течение 10 мин при 17,949 мкг при 4 ° С и супернатант передачи в новую пробирку.
- Выполните оценку белка с помощью коммерческого анализа белка комплект в соответствии с протоколом производителя. Используйте равное количество лизата для чип контроля и экспериментальных образцов. Как правило, используют 1 мг общего лизата в реакции чипе.
- Подготовка 50% суспензии белковых А-агарозы с использованием буфера, содержащего FA140 ингибитор протеазы коктейль. Добавить 1/10 объема ингибитором протеазы коктейль. Рассчитать объем бусин, необходимых в зависимости от количества образцов в целом.
- Вымойте белок А-агарозы бусины с FA140 буфера в два раза, чтобы удалить буфер для хранения и добавляют равный объем буфера для FA140 с шариками, чтобы сделать 50% суспензии.
- Чтобы удалить белки, которые неспецифически св зываютс с шариками, добавить 50 мкл 50% суспензии белка в-агарозы и вcubate образцов при 4 ° С при постоянном вращении конечного над-конца в гриль смесителе в течение 30 мин.
- Спин образцов при 956 х г при 4 ° С в течение минуты. Собирают супернатант и выполнения иммунопреципитации путем добавления или 8 мкл H4K16ac антитело или 5 мкл (5 мкг) 1 мг / мл антитела к SMARCA5 супернатанта. Выдержите при 4 ° CO / N с постоянным конец поверх конца вращения в гриль смесителя.
- Сохранить 1/10 экстракта для управления «вход» и установить его в качестве в сторону при -20 ° С. Входной должна быть обратной сшитого вместе с образцами IP.
- Использование равное количество кролика IgG (5 мкл 1 мг / мл) в качестве отрицательного контрольного образца иммунопреципитации.
- На следующий день, добавить 50 мкл 50% белка A-агарозы суспензии экстракта и инкубируют в течение 1 ч при 4 ° С с вращением.
- Гранул агарозном бисером центрифугированием при 956 мкг в течение 2 мин при 4 ° С, осторожно удалите супернатант и ваш бисер со следующими буферами последовательно. В буферных препаратов, добавить ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
- Промыть низким содержанием соли иммунного комплекса промывочного буфера (FA140; конечной концентрации 50 мМ HEPES KOH рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1% Тритон-Х-100 и 0,1% дезоксихолат натрия) для 5 мин при 4 ° С с конечным над концевой вращения.
- Промыть высоким содержанием соли иммунного комплекса промывочного буфера (FA500; конечной концентрации 50 мМ HEPES KOH рН 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1% Тритон-Х-100 и 0,1% дезоксихолат натрия) для 5 мин при 4 ° С с конечным над концевой вращения.
- Промыть LiCl иммунного комплекса промывочного буфера (конечная концентрация 10 мМ Трис-Cl рН 8,0, 250 мМ LiCl, 0,5% NP40 и 0,5% дезоксихолат натрия) в течение 5 мин при 4 ° С с конечным над концевой вращения.
- После промывок, как описано выше, добавляют 200 мкл раствора элюции (конечная концентрация 1% SDS и 100 мМ бикарбоната натрия) и incubatе при комнатной температуре в течение 15 мин с терминальной над концевой вращения при комнатной температуре.
- Спин образцов при 956 х г при комнатной температуре и передачи элюата в новую пробирку 1,5 мл. Повторите шаг 1,15 с дополнительным 200 мкл раствора для элюирования.
- К 400 мкл элюата, добавить NaCl до концентрации 0,16 М в и хорошо перемешать.
- Кроме того, добавление 400 мкл раствора элюции 10 мкл вход, который был установлен в сторону (шаг 1,11) и добавить NaCl до концентрации 0,16 М в обратном поперечных чтобы входные выборки, а также. Обратный сшивания образцы путем инкубации в 65 ° С на водяной бане в течение 5 ч.
- Добавить 1 мл 100% этанола в обратном сшитого элюата. Все хорошо перемешать и инкубировать при температуре -80 ° С в течение 2 - 3 часов или при -20 ° CO / N. Спин образцов при 17,949 х г в течение 15 мин и отбросить этанола.
- Добавить 800 мкл 70% этанола мыть гранул. Спин в 17,949 мкг в течение 15 мин при 4 ° С и отбросить этанола. Кратко спина, чтобы удалить остатки этанола. Воздух-высушить образцы при 37 ° С в течение 10 мин для удаления остатков этанола.
- Растворите ДНК в 90 мкл РНКазы и ДНКазы воду и добавить 2 мкл 10 мг / мл РНКазы при 0,2 мг / мл конечной концентрации. Инкубируют при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.
- Добавьте 10 мкл 10х буфера протеиназы К (100 мМ Трис-Cl рН 8,0, 50 мМ ЭДТА, рН 8,0, 5% SDS). Все хорошо перемешать и добавить 1 мкл протеиназы К. Инкубировать при 42 ° С в течение 1 ч.
- Очищают ввода и ДНК-чип с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя и элюирования ДНК в 50 мкл воды. Магазин ДНК при -20 ° С до дальнейшего использования.
2. Слот-блот анализ ДНК-чип
- Измерение выхода входа и ДНК-чип, элюированной в 50 мкл воды, как описано в шаге 1,22 с использованием спектрофотометра при 280 нм в соответствии с протоколом производителя.
- Возьмем равные объемы (50 мкл) ввода или иммунопреципитации ДНК, которые в пределах линейного диапазона детектирования.
- Например, если входнойВыход ДНК 1,5 нг / мкл, а затем взять 30 мкл (или 45 нг полной ДНК) и сделать громкость на 50 мкл с водой. Для фактора чип, взять всю 50 мкл элюата со стадии 2.1, и перейдите к шагу 2.3.
- Денатурация при 50 мкл ввод или иммунопреципитации ДНК добавлением 2,5 объема 0,4 N NaOH, быстро вихря и центрифуги для 956 мкг в течение 10 сек, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Нейтрализовать денатурированной ДНК добавлением 175 мкл 1 М Трис-HCl, рН 6,8, вихрь, центрифуги для 956 мкг в течение 10 сек и поместить образцы на льду.
- Приготовьте серийное разведение ввода и иммунопреципитации ДНК для слота блоттинга, как описано ниже.
- Последующие шаги 2.3 - 2.4, чтобы получить общий объем пробы 350 мкл (то есть, 50 мкл Входное / ДНК-чип, 125 мкл 0,4 Н NaOH, 175 мкл 1 М Трис-HCl, рН 6,8).
Примечание: Для экземпляра указано выше, 45 нг ДНК ввода будет в конечном итоге 0,129 нг / мкл. - Для ввода ДНК, маркировать три трубкис, как 100, 50 и 25 и добавление 100 мкл, 50 мкл и 25 мкл денатурированного и нейтрализовали образца ДНК. Сделать окончательный объем до 100 мкл с нуклеазы без воды. Для ДНК-чип, этикетки три трубы, как 200, 100 и 50 и 200 мкл, 100 мкл и 50 мкл денатурированного и нейтрализованного образца ДНК. Сделать окончательный объем до 200 мкл с нуклеазы свободной воды.
- Последующие шаги 2.3 - 2.4, чтобы получить общий объем пробы 350 мкл (то есть, 50 мкл Входное / ДНК-чип, 125 мкл 0,4 Н NaOH, 175 мкл 1 М Трис-HCl, рН 6,8).
- Сокращение мембрану с размером слот-блот в аппарате. Предварительно смочите мембрану и истребив учением бывшее документы в 20х SSC до и перед добавлением ДНК. Соберите их в слот-блот устройства в соответствии с протоколом производителя.
- Внесите ДНК из стадии 2.5.2 в соответствующие слоты. Применить вакуум медленно тянуть ДНК на мембране дзета-зонда. Остановка вакуум после всех образцов прошли через устройство.
- Разборка устройства и сразу же иммобилизации ДНК на мембране с помощью УФ-сшивающий агент. Имейте сторону ДНК в УФ сшивателя и использовать АСtocrosslink установки в сшивающего агента. Следуйте протокол производителя.
- Обнаружение BrdU на слот-блоттинга, выполняя Вестерн-блоттинга.
- Блок мембрану с 5% обезжиренным сухим молоком в PBS, содержащем 0,1% Твин-20 (PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител к мембране.
- Добавить первичного анти-BrdU антитела (1: 500 разведение), разбавленного в 1% обезжиренным сухим молоком в PBST и инкубируют блот с первичным антителом в течение 3 ч при комнатной температуре на шейкере. Промыть PBST мембраны с три раза после инкубации первичных антител.
- Добавить HRP-конъюгированного анти-мыши вторичные антитела к блот (1: 5000 разведение) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Вымойте мембраны с PBST три раза после вторичной инкубации антитела.
Примечание: С помощью достаточного объема антител, чтобы полностью покрыть мембрану во инкубации первичных и вторичных антител.
- Подготовьте смесь ECL и добавить его в пятно переменного токась с протоколом производителя. Инкубируйте мембраны с ECL смеси в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Поместите мембрану в рентгеновской кассеты, подвергать мембрану к рентгеновской пленке и развивать кляксу, используя протокол производителя.
- Количественно сигнал, полученный для ввода и ДНК ChIPed после сканирования пятна с помощью изображения J программного обеспечения в соответствии с протоколом производителя. Для количественного определения используют сигнал, который в пределах линейного диапазона детектирования того, чтобы обеспечить точность измерений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы определить специфику HDAC1,2-селективных ингибиторов, были использованы Hdac1,2 FL / FL и FL Hdac3 / FL клеток саркомы. Аденовирус, содержащий рекомбиназу Cre (AD-CRE) был использован для удаления Hdac1,2 и Hdac3 в этих клетках. После объявления-Cre инфекция Hdac1,2 FL / FL клетки, наблюдалось увеличение надежный H4K5ac. Лечение Hdac1,2 нокаутом клеток с 233 или 898 не приведет в любом дальнейшем увеличении H4K5ac, подтверждающий, что 233 и 898 ингибируют Hdac1,2 и не Hdac3 в этих клетках. В противоположность этому, добавление 233 или 898 до Hdac3 нокаутом клеток приводит к значительному увеличению H4K5ac сравнению с увеличением видели в Hdac3 нокаутом клеток за счет аддитивного эффекта на уровне H4K5ac в результате ингибирования Hdac1,2 и 3. Следовательно, 233 и 898 являются Hdac1, 2-селективные ингибиторы. Эти результаты показаны вРисунок 1.
Чтобы проверить метод BrdU-чип-слот, анализ BrdU импульса погони была выполнена, чтобы посмотреть на кинетики PCNA погрузке на зарождающейся ДНК в клетках HeLa. Наши результаты показали, что PCNA ассоциация с зарождающейся ДНК происходит быстро, в течение 15 мин и исчезает после 30 мин погони по согласованию с ранее опубликованными результатами 13. Эти результаты показаны на рисунке 2.
BrdU-H4K16ac чип-слот-западный метод был использован для определения количества H4K16ac, связанный с нарождающейся ДНК в отсутствие функции HDAC1,2. Надежный обогащение H4K16ac связан с возникающей ДНК наблюдалась при сравнении с контролем кролика IgG (3а и 3b). Увеличение зарождающейся ДНК-ассоциированных H4K16ac следующей ингибирования HDAC1,2 деятельности или нокдаун Hdac1,2 показано на рисунке 3C сильный>, 3D, 3E и.
Уровень SMARCA5 хроматина Remodeler на зарождающейся ДНК определяли с помощью BrdU-SMARCA5 чип-Slot-Западная технику. Наши результаты показали, что SMARCA5 ассоциируется с зарождающейся ДНК в клетках млекопитающих. Кроме того, HDAC1,2 ингибирование или нокдаун Hdac1,2 не изменить количество зарождающейся ДНК-ассоциированных SMARCA5 хроматина Remodeler, как показано на рисунке 4.
Рисунок 1. Подтверждение Специфика HDAC1,2-селективных ингибиторов. Западная анализ целых клеточных лизатов, приготовленных из Hdac1 Флорида / Флорида HDAC2 FL / FL или Hdac3 Флорида / FL клеток саркомы следующих Ad-Cre-инфекции и лечения 898 или233. Клетки обрабатывали 3 мкМ 898 или 233 в течение 24 часов следующего за 48 ч Ad-Cre инфекции. Эта цифра получена из нашего предыдущего опубликованных работ 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Динамика PCNA Ассоциации с ДНК находятся в стадии становления в клетках HeLa. HeLa клетки были помечены бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 30 мин. Затем клетки промывали, чтобы удалить неинкорпорированную BrdU и культивировали в среде без BrdU для указанных периодов времени (чейз). Иммунопреципитации хроматина (чип) проводили с ядерным антигеном пролиферирующих анти-клеток (PCNA) антитела. BrdU помечены ДНК присутствует в ДНК и ввода связанные с PCNA были оценены в слот-блот-анализа с использованием анти-BRDУ антитела, как показано на рисунке 2. Эта цифра получена из нашего предыдущего опубликованных работ 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Потеря гистондеацетилазы 1 и 2 Увеличивает H4K16ac на стадии становления ДНК. (АВ) бромдезоксиуридином (BrdU) импульса погони была выполнена в HeLa и клеток NIH3T3 определить ассоциацию H4K16ac с зарождающейся ДНК в указанных временных точках. (CD) NIH3T3 клетки обрабатывали либо ДМСО или HDAC1,2-селективный ингибитор (898 или 233) в течение 24 ч. (Е) NIH3T3 клетки либо трансфицировали ненацеливании (NT) или Hdac1,2 (H12) миРНК. Клетки (C - E) были помечены BrdU и используетсядля чип с анти-H4K16ac последующим слот-блоттинга. Мембрану зондировали анти-BrdU антителами. Цифры показывают, чтобы изображение J количественного среднего BrdU сигнала высокого и среднего объема ДНК-чип замечен. Эта цифра получена из нашего предыдущего опубликованных работ 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. SMARCA5 ассоциируется с нарождающегося ДНК. Сумма SMARCA5 на зарождающейся хроматина после потери функции HDAC1,2 показано. NIH3T3 клетки либо обрабатывают HDAC1,2-селективный ингибитор (898) или трансфицированы ненацеливании (NT) или Hdac1,2 (H12) миРНК. Клетки были помечены BrdU следующей вышеупомянутых процедур и чип с анти-SMARCA5 или кролика IgG (отрицательный грontrol) проводили. Увеличение объемов ДНК-чип был замечен на слот-блоттинга и мембраны зондировали анти-BrdU антителом. Эта цифра получена из нашего предыдущего опубликованных работ 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный в этой рукописи является относительно быстрым способом, чтобы продемонстрировать наличие белков или их посттрансляционно модифицированных форм на новореплицированные или возникающей ДНК. Кроме того, этот метод позволяет возможность измерять ассоциации-диссоциации кинетики белка или его модифицированной форме с возникающей ДНК. Этот метод является дополнением к элегантным технологии iPOND 13. В технологии iPOND, вновь синтезированный ДНК метят этилового дезоксиуридина (EDU). Биотин конъюгата затем добавил на Edu помощью химии мыши. Биотин-тегами зарождающейся ДНК затем иммунопреципитировали помощью стрептавидин бисер и совместное очистки белков обнаруживаются Вестерн-блоттинга. С другой стороны, в нашем BrdU-чипе-слот-западной техники, белок или его модифицированную форму, связанные с возникающей ДНК иммунопреципитации с использованием белок-специфических или модифицированную форму конкретного антитела и количество BrdU-меченых возникающей ДНК, связанного с белок-йан определяется количественно слот-блоттинга с использованием Западная антитела анти-BrdU.
Есть критические шаги в этом протоколе, который требует особого внимания. Очень важно, чтобы гарантировать, что интерес антитело хорошо работает в стандартный чип анализов с высокой эффективностью. Важно, чтобы проверить эффективность антитела чип анализов по количественному ПЦР-перед выполнением BrdU-ЧИП-Slot-Западная анализа. Для того, чтобы количественного метода BrdU-чипе-слот-западной быть точным, серийное разведение в BrdU-меченых ДНК должна быть применена к слот-блоттинга и вестерн-анализа с использованием антитела против BrdU должны быть изначально выполнены для того, чтобы определить линейный диапазон детектирования. Определение концентрации ДНК-чипа и входного ДНК позволяет гарантировать, что количество BrdU-меченых ДНК в пределах линейного диапазона обнаружения в вестерн-блоттинга. Например, мы определили 50 нг до 12,5 нг ДНК входного быть влинейный диапазон в нашем пилотном эксперименте. Кроме того, если концентрация образцов чип очень высока, крайне важно, чтобы разбавить ДНК-чип перед выполнением слот. Ограничение этого метода является его разрешение, которое зависит от эффективности хроматина стрижки. Сдвиг хроматина с помощью ультразвука определяет близость данного белка или его модифицированной форме на вновь синтезированную ДНК.
В прошлом, изучение изменений в хроматина и хроматина изменения ферменты во время репликации ДНК в клетках млекопитающих остается сложный вопрос для решения из-за отсутствия соответствующих методик. Кроме того, поскольку Hdac1,2-нулевые клетки сердца в фазе G1, было трудно изучить функции для Hdac1,2 внутри S-фазе. В нашем исследовании мы показали, функции для этих двух HDACs во время репликации ДНК, используя комбинацию первых в своем классе селективных ингибиторов для подавления их деятельности в рамках S-фазе и нового BrdU-чип-SМного-Западная Техника. В будущем, этот метод также может быть использован для изучения динамики реагирования повреждения ДНК и репарации ДНК белков в тупик вилкой в дополнение к изучению модификации гистонов и хроматина, модифицирующие фермент на развилке. Кроме того, этот метод не ограничивается мыши клеток NIH3T3. Этот метод может быть успешно использован в других клеточных линиях с целью изучения того, как другие ингибиторы ферментов или белков влияют репликацию ДНК и репликации стресс-индуцированной изменения хроматина на развилке репликации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа в этой рукописи была поддержана за счет средств кафедры радиационной онкологии и Huntsman института рака и Национального института здравоохранения (грант R01-CA188520) в SB. Я благодарю Danielle Джонсон и Стивен Беннетт в моей лаборатории для демонстрации и объяснения протокол свои преимущества. Я благодарен доктору Махеш Чандрасекхаран (Охотник института рака) за критические замечания по рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G.
- Alabert, C., Groth, A.
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
