Introduction
אובדן עוברי מוקדם בפרות חולבות גבוהות בהפקה הוא אחד האתגרים המרכזיים בתעשיית חלב 1, 2. שור הפך מודל מעניין ללמוד פיתוח עובר preimplantation אדם בשל תהליך התפתחותי הדומה שלהם 3, 4. עם זאת, מחקרים נוספים נדרשים להיות בעלי הבנה טובה יותר על גנים המעורבים בהתפתחות העוברית המוקדמת שור.
אחרי עשרים שנה מאז טכנולוגית microarray הראשונה שפותחה בשנת 1995 5, התפתחות שגיאות דפוס מופחת טכנולוגיית ייצור בדיקה מתוחכמות יותר ושונה של שבבי מערך בתוך ובין פלטפורמות microarray השונות 6. טכנולוגית microarray משופרת הביאה יישום נרחב של טכנולוגיה זו במחקר קליני 7 ולאחרונה, ב q עובר המוקדםuality הערכה 8.
הכמות הגדולה של חומר הנדרש עבור טכנולוגית microarray היא הסיבה העיקרית מדוע טכנולוגית microarray בתחילה נכשלה להזין מספר של תחומי מחקר כגון התפתחות עוברית מוקדמת. לאחרונה, שיטות הגברה RNA שופרו כדי להגביר באופן ליניארי RNA עד רמת מיקרוגרם מ-ננוגרם תת החל RNA חומר 9. ישנן מספר הגברת RNA המסחרית ערכות קיימות בשוק; עם זאת, הערכות המפותחות יותר הפופולריות קשורות Ribo-יחיד פריימר איזו תרמים הגברת 10 ו אמרגן T7 מונע 11 שיטות. הגברת RNA antisense הפופולרית ביותר משתמשת ב שעתוק במבחנה עם פריימר אוליגו dT קשר אמרגן T7 ב 5 'סוף 12. טכנולוגיה זו מאפשרת שמירה על רוב תמלילי אנטי תחושה נציג לאחר f הגברה ליניאריתאו מערכי הכלאה 13. שיטה זו הותאמה כדי להגביר רמת picogram של רנ"א הכל מופק שור עובר 8.
הצמדת יוניברסל מערכת (ULS) היא שיטת התיוג אשר ישירות משלבת את ה- DNA או RNA מוגבר עם צבע פלואורסצנטי צמוד פלטינה או Cyanine 547 או Cyanine 647, על ידי יצירת קשר קואורדינטיבית על מצבת N7 של גואנין 14. שיטה זו הותאמה במחקר עובר כדי ליצור יותר יציב מוגבר ארנה ללא שינוי לעומת aminoallyl שהשתנה ארנה שנוצרה על ידי שיטה אנזימטית 15. שני שיטות לצבוע וסימון שני צבעים יחידים הותאמו באמצעות מערכת הצמדת יוניברסל microarray. מחקר השוואות microarray גדול היה כי קיימת קורלציה טובה של איכות נתונים בין פלטפורמות מערך אחד ושני צבע 6.
לאחרונה, הוא כונן אמרגן T7n antisense RNA הגברה וסימון ULS שיטות פותחו כדי לספק פרוטוקול אמין יותר כדי לייצר כמות מספקת של איכות גבוהה שכותרתו חומרי ארנה כלת microarray 8, 16. לכן, מחקר זה מספק פרוטוקול להפגין חלק מן הצעדים החשובים של מיצוי RNA לניתוח נתונים מעורבים microarray שני צבעים באמצעות עוברי שור יום 7 כדוגמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
החלק החי של מחקר זה נערך על יחידת המחקר מטבולית מאוניברסיטת אלברטה, אדמונטון, קנדה, עם כל הפרוצדורות חיה אישרה (פרוטוקול # AUP00000131) על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים אלברטה ועדת שימוש, וחיות טיפלה פי אל המועצה הקנדית של הנחיות טיפול בבעלי חיים (1993).
1. ייצור העובר, בידוד של רנ"א סך טיפול DNase
- עבור פרוטוקולי ניסוי בבעלי חיים ואיסוף עובר מתייחס בפרסומים הקודמים שלנו 17, 18.
- ברכה ולהצמיד להקפיא עובר בשלב דומה מכל פרא בחנקן נוזלי ולאחר מכן לשמור ב -80 ° C עד מיצוי RNA.
- חלץ סך RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA מבוסס עמודה המאפשרת לחלץ RNA ממדגמים פיקו בקנה מידה (מידע ערכה זמין רשימת חומר).
הערה: מומלץ הערכה מכילה: מיזוג הצפה, הפקת buffer, 70% אתנול, לשטוף הצפת 1, לשטוף הצפת 2, הצפת elution, עמודות טיהור RNA עם צינורות איסוף צינורות microcentrifuge. - הוסף 10 μL הפקת הצפת עוברים המכילים צינור דגירה במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס. צינור צנטריפוגה ב 800 XG למשך 2 דקות כדי לאסוף תאים לחלץ לתוך הצינור microcentrifuge.
- פיפטה 250 μL אויר חוצץ על הממברנה מסנן טור טיהור. דגירת עמודת טיהור RNA עם מיזוג הצפה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה עמודת הטיהור בצינור האוסף ב XG 16,000 דקות 1.
- פיפטה 10 μL של אתנול 70% לתערובת של הצפת ועוברים הפקת RNA. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. תערובת פיפטה לתוך טור טיהור preconditioned.
- כדי לאגד RNA, צנטריפוגות העמודה טיהור 2 דקות ב 100 XG ומיד בצע על ידי צנטריפוגה ב XG 16,000 למשך 30 שניות כדי להסיר הזרימה דרך.
- פיפטה 10081; L של הצפה לשטוף 1 לתוך טור טיהור צנטריפוגות דקות 1 ב 8000 x ז.
הערה: טיפול DNase מומלץ אם ביצוע שעתוק או הגברה הפוך לאחר בידוד RNA. - לעכל הדנ"א הגנומי מיד אחרי צעד 1.8.
הערה: ערכת DNase המומלצת זמינה רשימת חומר. ערכה מומלצת כוללת: פתרון מניות DNase אני הצפה. - הכין תערובת דגירת DNase על ידי ערבוב 5 מניות פתרון μL DNase אני עם 35 μL הצפה. מערבבים על ידי היפוך בעדינות.
- פיפטה את תערובת דגירת μL DNase 40 ישירות לתוך קרום טור טיהור. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- פיפטה 40 μL הצפת לשטוף 1 לתוך קרום טור טיהור ואז צנטריפוגות ב 8000 XG במשך 15 שניות.
- פיפטה 100 μL הציפו לשטוף 2 לתוך טור טיהור צנטריפוגות דקות 1 ב 8000 x ז.
- פיפטה עוד 100 לשטוף μL הצפת 2 לתוך הטור טיהור צנטריפוגותבמשך 2 דקות ב 16,000 x ז.
- מעבירים את העמודה טיהור לצינור 0.5 מ"ל microcentrifuge חדש. פיפטה 11 μL של הצפת elution ישירות על הממברנה של עמודת הטיהור. כדי להבטיח ספיגה מקסימלית של הצפת elution לתוך קרום, לגעת בעדינות את קצה פיפטה אל פני השטח של הממברנה תוך מחלק למאגר elution.
- דגירה עמודה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה העמודה דקות 1 XG ב 1000 על חלוקת הצפת elution בעמודה, ואז ספין דקות 1 ב 16,000 XG כדי elute רנ"א.
- השתמש מכשיר bioanalyzer פי הוראות היצרן כדי להעריך את איכות RNA וכמות 19.
- חנות המדגם RNA ב -80 ° C עד השימוש.
2. RNA הגברה וסימון לניתוח microarray
הערה: עבור המשתמש בפעם הראשונה עובדים עם RNA הגברה ונהלים תיוג, השתמש חמש ng של ספייק-ב RNA along עם דגימות ארנה בפועל לפקח על המדידה ובקרת איכות של הגברת RNA כלאה. ספייק-בתמהיל RNA מכיל עשרה במבחנה מסונתז, תמלילי polyadenylated ביחסים שנקבעו מראש. כאשר ההליך מבוצע כראוי, את התמלילים שכותרתו במיוחד להכליא רק בדיקות בקרה משלים במערכים והנתונים ניתן לסרוק לעקוב אבטחת בקרת איכות עם עצמי מינימאלי או הכלאת צלב. תיאור פרטים נוספים לגבי עוצמות ממוסמר-ב מלאה הליך נורמליזציה לאחר סריקת ניתוח מערך והנתונים מתייחסים לפרסומים קודמים 20, 21. ההליך הבא ניתן משתמשי microarray השיגרתי.
- כן 100 pg מדגם RNA באיכות גבוהה (מספר Integrity RNA (רין ערך) לפחות> 7.0) בהיקף כולל של 10 - 11 μL.
- להגביר את הדגימות רנ"א עם ערכת הגברת יכולתלעבוד עם דגימות פיקו בקנה מידה (קטן כמו 100 pg).
הערה: מידע ערכת הגברה מומלצת זמין חומר רשימה ועוקב אחר הוראות היצרן ללא כל שינוי. - השתמש quantitation קרינה המבוסס להעריך את הפרופיל של מגוון הגודל של ארנה המוגבר.
- להשתמש במכשיר ספקטרופוטומטר (מבוסס על הספיגה ב ננומטר 260 ו -280) כדי למדוד את הריכוז של ארנה המוגבר.
- אחסן את ארנה מוגבר ב -80 ° C עד מוכן תיוג.
- השתמש 2 מיקרוגרם של רנ"א מוגבר עבור תיוג פלורסנט פי מדריך למשתמש ערכת תיוג ULS ארנה.
הערה: מאז Cyanine 547 ו Cyanine 647 לצבוע רגישים שפלת תמונה לצבוע Cyanine 647 נפגע בקלות על ידי אוזון, הליך התיוג מתרחשת כמות מינימאלית של אור תחת סביבת אוזון חינם. - הפעל את תיבת האוזון (איור 1 א) עד לרמה של אוזון הוא 0.001 ppm.
- מערבבים בעדינות דגירה צינורות ב thermocycler ב 85 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. דגימות מקום על קרח דק 1 לפחות. ספין למטה כדי לאסוף תוכן של צינורות לפני שתמשיך עם ערכת חילוץ RNA, למעט השלבים הקשורים טיפול DNase (מ 1.9 ל 1.11), לנקות את RNA מוגבר שכותרתו סיי-צבע.
- להשתמש במכשיר ספקטרופוטומטר למדוד ולקבוע את ריכוז RNA מוגבר שכותרתו ולשמור ארנה שכותרתו במקסימום -80 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים לפני השימוש.
3. הכלאה microarray ו כביסה
הערה: השלבים החשובים הבאים מותאמים על פי שני צבעים מבוססים Microarray Gene Expression ניתוח פרוטוקול (גרסה6.5, מאי 2010).
- להוסיף כמות שווה של 825 ng מכל Cyanine 547- ו Cyanine 647 שכותרתו ארנה ומערבב עם 25x פיצול 10x מאגרי חסימה.
- מחמם את התערובת על 60 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ומצננים על קרח דקות 1.
- להוסיף כמות שווה של חיץ הכלאה 2x ומערבבים היטב.
- צנטריפוגה ב 13,000 סל"ד, ולאחר מכן את התערובת מוכנה הכלאה.
- טען 100 μL מהתערובת לשקופית המערך ולאטום את השקופית בתוך החדר הכלה.
- טען את התא התאסף לתוך תנור הכלאה במשך 17 שעות ב 65 מעלות צלזיוס מסתובב ב 10 סל"ד בתנור.
- שטוף את המערכים פי פרוטוקול טיפול גינת אוזון על ידי טבילה לתוך ייצוב וייבוש פתרון למשך 30 שניות.
- הסר את המערכים מהפתרון ולוודא שטח המערך הוא יבש ללא חלקיקי אבק
4. שקופיות microarray סריקה
- שמור על מערכים במקום חשוך ולהדליק scannאה עד שהוא מוכן לשימוש (זמן המתנה 15 דקות).
- טען את הברקוד מערך בצד שמאל, לתוך הסורק ולהתחיל סריקה. האם ניתוח הנקודה על פי המדריך למשתמש תוכנה ולשמור את הנתונים בפורמט קובץ (GPR).
5. ניתוח סטטיסטי
- הורד את תוכנת FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php לחץ על "נתונים גולמיים לייבא" ו לטעון את קבצי GPR לתוך FlexArray.
- בצעו את הנורמליזציה וניתוח סטטיסטי במידת הצורך על ידי ביצוע ההוראות. הערה: חישוב הסף לבחירת נקודה חיובית במחקר זה כפי שתואר קודם לכן 22.
- בחר הנפתח ידני מצופת העלילה של FlexArray כדי להציג את כל מקומות הכלאת אותות רקע. הערה: תמונה דומה של ממוסמר בבקרה לאחר הכלאה אל microarray ניתן לראות במחקר הקודם 8.
- תבחרנורמליזציה הלס בתוך המערך הבאה על ידי בחמישון בין תהליך נורמליזציה מערכים מן FlexArray הנפתחת ידנית בהתאם.
- לייצא את כל הנתונים המנורמלים FlexArray לתוך קובץ Excel לשימוש נוסף.
6. ביואינפורמטיקה ניתוח
ההערה המקורית של הרצפים החלליים מתמלילים עובריים ספציפי שור (BESTv1) microarray תוארה בעבר 8. במחקר הנוכחי, 20,403 סמלים ג'ין ייחודי (GS) התקבלו ( מוסף File1 ) דרך מערכת ניהול מידע EmbryoGENE מעבדה (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). רשימת 6765 גנים ייחודיים ( מוסף file2 ) נבחרה תואם את אותות חיוביים כל לאחר תהליך נורמליזציה microarray (שלב 5.5) מפרופיל ביטוי גנים העוברים יום 7 שור. סף איתות חיובי חושב על בסיס הפרסום חדיר 16 מעוצמת האות של ערך A.
- כדי לבצע אנליזה פונקציונלית עם פנתר (חלבון ניתוח באמצעות קשרים אבולוציונית) סיווג מערכת 23, 24, פתח את הקישור הבא (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- העלאת רשימת 6765 GS עובר ספציפי לזהות תהליך ביולוגי ספציפי במהלך ההתפתחות עוברית באמצעות בדיקה לייצוג יתר סטטיסטית ולהשתמש הגדרת ברירת מחדל של taurus Bos (כל הגנים במאגר) כרשימת התייחסות 25.
הערה: פעולה זו מאפשרת זיהוי של תהליכים התפתחותיים הקשורים מתנאי GO כי הם סטטיסטית יתר או תת לידי ביטוי באמצעות מבחן הבינומי. - P-ערך נקבע סף <0.05 כברירת מחדל תוכנה. ניתן להוריד נתונים ו Exported לתוך קובץ Excel לבחירה נוספת 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאת נציג של RNA סך ארנה מוגבר מעובר שור יום 7 מוצגת באיור 3 ו מסוכמת בטבלת 1.
ניתן להעריך יושרה פרופיל RNA לאחר מיצוי RNA. הערכת איכות של RNA יכול להיעשות על ידי מכשיר bioanalyzer (איור 3 א) ורק דגימות אלה עם ערך רין גבוה יותר מאשר 7.0 כשירים לשמש הגברה (טבלה 1).
האיכות והכמות של רנ"א המוגבר יש להעריך לאחר הגברה. הדמיון של פרופיל RNA מוגבר בטווח גודל מתאים הם הגורמים העיקריים עבור בקרת איכות (איור 3 ב). לאחר ההגברה בשני סיבובים, שברי RNA המוגברים מאוד דומים בגודלם, הנעים בין 200 ל 800 נ"ב (איור 3B) וכל aRNAs של מגוון בגודל דומה נבחר תיוג קרינה נוסף. כמו כן, הגברה מוצלחת של רנ"א הכל מקורי תניב לפחות יותר מאלף גידול של פי של ארנה (טבלה 1).
יעילות תיוג הקרינה ניתן לחשב על פי מידת יחס תיוג. הנוסחא זמינה במדריך למשתמש ערכת תיוג ULS ארנה. המדריך למשתמש מצביע על מידת יחס תיוג צריך להיות 1.0 - 3.6%, המציין כי בממוצע של 1 - 3.6 מולקולות ULS ל -100 נוקלאוטידים.
קבצי התמונה לאחר הכלאה וסריקה ניתן לצפות FlexArray. תמונה הסרוקה באיכות טובה לאחר כלת microarray ושטיפה מוצגת באיור 4 א. אם חומרי שכותרתו נמוכה או גבוהים יותר מאשר בטווח זה, אותות יהיו נמוכים מדי כדי לזהות או רמות רקע גבוה תזוהינה לאחר scanning (איור 4B).
במחקר נוכחי, סף איתות חיובי נקבע ל 7.6 (אות בדיקה גבוהה 7.6 או רקע <7.6 נחשב חיובי). כ -46% של ערכות הבדיקה מייצגות 20,826 נקודות חיוביות מסומנים בצבע אדום יום שור 7 עוברים (איור 5). לאחר סילוק סמלי גן ללא ביאור ו הכפול, רק 6765 סימני גן ייחודיים נותרים לניתוח PANTHER.
גנים 6765 אלה מייצגים את תעתיקי רנ"א ייחודי לידי ביטוי הבלסטוציסט שור יום 7. על מנת למצוא את התהליך הביולוגי ספציפי הבלסטוציסט שור, PANTHER לייצוג יתר הבדיקה מבוצעת. 10 העליון ג'ין אונטולוגיה (GO) מזהי הטווח עם מדד העשרה לקפל הגבוה ביותר מסומנים (איור 6). באופן כללי, תנאי GO ספציפיים אלה בעיקר מייצגים את תהליך חטיבת הסלולר הפעיל כגון mitosiים והפרדה כרומוזום, הסדרת מחזור התא וייזום התרגום cytoplasmic ו המיטוכונדריה.
איור 1: תיבה חינם-אוזון (א) ו Array תיוג תגובה (B). א) אוזון חינם Box מורכב יחידת ממיר קטליטי אשר ממחזרת את האוויר והורס אוזון חיישן אוזון רגיש מאוד לפקח על רמת האוזון בתוך הקופסה במהלך הופעת microarray. הליך B) סימון כלת מערך לבצע בתוך הקופסה כדי למנוע שפלת צבע פלואורסצנטי Cyanine 647 על ידי אוזון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: PANTHER ג'ין רשימת ניתוח. החיצים האדומים מציינים את האזור צריך להיות מלא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: electropherogram נציג Bioanalyzer של סך RNA (א) ואת תמונה ג'ל של Amplified RNA (B). א) מציג התוצאה הכוללת עם ערך רין, ריכוז RNA ויחס rRNA. ב) הפרופיל של רנ"א המוגבר לאחר הגברה בשני סיבובים. שברי RNA מוגברים צפויים להיות בטווח שבין 200 ל -800 נ"ב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: תמונה של מפת צפיפות Array. (א) תמונה טובה של שקופית מערך מראה ערוץ ירוק ואדום מתאים Cyanine 547 ו Cyanine 647 אותות לאחר סריקה באמצעות עוצמת נקודה גבוהה (מסומנת בצד שמאל עם צבע ירוק כחול) ורקע נמוך (מצוין על ימין עם כחול כהה צֶבַע). (ב) תדמית רעה של שקופית מערך הצגת תמונת רקע גבוהה מאוד מערוץ אדום (מסומנת המלוח העליון עם צבע ירוק הכחול הדומה מדמות עוצמת מקום Cyanine 647). תרשים צבעוני מציין את עוצמת האות עם ערכים מספריים המתאים בצבעים שונים. שווי עוצמת אות הוא הנמוך ביותר בטווח של צבע כחול כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסת r של נתון זה.
איור 5: MA מגרש פרופיל ביטוי גנים עובריים יום 7 שור. 20,826 נקודות אדומות מיוצגות אותות חיוביים מעל אותות רקע. כתמי רקע מודגשים בצבע שחור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: The Top 10 ג'ין אונטולוגיה (GO) מזהי טווח עם מדד והעשרה מקפלים הגבוה ביותר. במונחים GO ספציפיים אלה בעיקר מייצגים את תהליך חטיבת הסלולר פעיל כגון מיטוזה והפרדה כרומוזום, הסדרת מחזור התא וייזום cytoplasmic ו המיטוכונדריה טרנסאוכלוסייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| לִטעוֹם | מספר העובר | סוּג | העובר איכות המורפולוגית | ריכוז RNA (pg / μL) | RIN | רנ"א הכל משומש לגידול הגברה (PG) | ריכוז RNA מוגבר (ng / μL) | ||||||||
| S1 | 4 | הבלסטוציסט | כיתה 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858.5 | 3498.4 | ||||||||
| S2 | 1 | הבלסטוציסט | כיתה 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1682.4 | S3 | 2 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 135 | 8.8 | 1147.5 | 3185.3 |
| S4 | 3 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 177 | 9 | 1504.5 | 2906.4 | ||||||||
| S5 | 5 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3437.5 | ||||||||
| S6 | 3 | הבלסטוציסט | כיתה 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1351.5 | 1689.8 | ||||||||
| S7 | 3 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 154 | 9 | 1309 | 4507.1 | ||||||||
| S8 | 4 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3089.3 | ||||||||
| S9 | 5 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3917.8 | ||||||||
| S10 | 6 | הבלסטוציסט | כיתה 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | הבלסטוציסט | כיתה 1 | 206 | 9 | 1751 | 2567.9 |
טבלה 1: Sample ומידע RNA. ריכוז ואיכות RNA יש להעריך לאחר החילוץ. שלמות וריכוז RNA ניתן להעריך על ידי כל bioanalyzer. מספר שלמות RNA צריך להיות יותר מ 7.0. ריכוז RNA צריך להיבדק על ידי מכשיר ספקטרופוטומטר לאחר הגברה. אמבריאיכות o הוערכה לפי גדרות המדריך של האגודה עובר הבינלאומית (3 rd ed., סבוי, IL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבעיה הראשונה לבצע ניתוח microarray באמצעות עוברי שור יום 7 אינו מקבל כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה ללימוד ביטוי גנים. מיצוי RNA פנול / כלורופורם מסורתי שיטת משקעי אתנול אינו מומלץ יום 7 עובר, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה פנול שאריות האפשרית עיכוב תגובת הגברת RNA. במקום זאת, שיטה סטנדרטית מבוסס עמודה עדיפה לבודד רנ"א מכיל ואז elute רנ"א עם חיץ elution מינימום להגדיל את הריכוז. בממוצע 780 pg של רנ"א הכל לכל העובר מתקבל במחקר הנוכחי אשר ניתן להשוות עם דיווחים אחרים באמצעות מתודולוגיה זהה 26 ואת ערכת חילוץ אותו RNA 27, 28 המשמש כיום. להפקת RNA, מומלץ לפזר משקע לפני שימוש על ידי ערבוב יסודי או לחמם את בקבוקון חיץ חילוץ מחדש לפזר את מיצוי החיץ לפנילהשתמש. יתר על כן, זמן הדגירה הוא גם חשוב עבור התשואה RNA בשלב החילוץ. זמן דגירה פחות 30 דקות מלאות ב 42 מעלות צלזיוס מופחתת תשואת RNA.
על עמודת עיכול DNase יש צורך להסיר זיהום הדנ"א הגנומי במהלך טיהור RNA מוחלטת. אנזים DNase רגיש מאוד מערבולת צנטריפוגות. לכן, DNase חיץ צריך להיות מעורב על ידי היפוך בעדינות.
איכות RNA חשובה מאוד בניתוח microarray דגימות עם רין נמוך מ -7 לא צריכים להיחשב עבור כלאה. במחקר נוכחי, את הפרופילים רנ"א הכל מתקבלים על ידי bioanalyzer דומים לאלו שנצפו בעבר במחקרים מן blastocysts שור 26, 27. ראוי לציין כי בעת שימוש בעוברים בשלב טרום בקע, במיוחד RNA שהוכן ביציות ועוברים לפני אימהי מעבר עוברי, ערך RIN הוא לעתים קרובות נמוך מ -7 לעומתאל RNA סך מעובר יום 7 וזה נובע השתנות ביחס 28S / 18S rRNA 27.
כמות RNA חילוץ מעובר שור אינה מספיק עבור הכלאת פלטפורמה, ומכאן, הגברת RNA נדרשה. ישנן מספר שיטות זמינות עבור הגברת RNA כגון PCR, שעתוק במבחנה (IVT), ו Ribo-ספיה (הגברת isothermal פריימר יחיד). למרות השיטה השנייה היא מהירים ביום אחד מספקת מספיק חומר עבור מערכים, זה נדרש לפחות 5 ng כמו חומר המוצא 29. לפיכך, בחרנו בשיטת IVT שהוא מסוגל לעבוד עם חומרי מוצא נמוכים 12 (קטן כמו 100 pg). יתר על כן, זה כבר נבדק כדי להגביר RNA סך שחולצו מן העובר שור 29 בהצלחה. במחקר נוכחי, שיטת ההגברה שלנו מיוצרת ~ 28 מיקרוגרם RNA מוגבר לכל עובר מן 598 RNA סך pg לכל עובר. Additioסוף סוף, לאחר ההגברה בשני סיבובים, הדגימות שלנו הראו פרופיל דומה וטווח בגודל מתאים (בין 200 ל 800 נ"ב) אשר עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים 13, 15.
בפרוטוקול זה, השתמשנו cyanine פרוטוקול תיוג אנזימטית, צמודת פלטינה (Cyanine 547 ו Cyanine 647) צבעים. שיטה זו מאפשרת תיוג של רנ"א מוגבר או לא מוגבר. לאחר שלב הגברה לפני התיוג מאפשר שימוש נוקלאוטידים טבעיים, מוביל לעליית התשואות המוגברות RNA, להפחית הטיה וליצור שברים ארוכים יותר לעומת שיטה האנזימטית. Cyanine 547 ו Cyanine 647 צבעים נפוצים צבעי ניאון ממליצים עבור מערך דו-צבע. עם זאת, לצבוע Cyanine 647 רגיש שפלת אוזון. יש להשתמש צג אוזון כף יד כדי לוודא את רמת האוזון מתחת ל -2 ppb. בנוסף, סביבת אבק חינם יש צורך להימנע חלקיקי אבק נופל לתוך פתרון כלה או דוריןסריקה גרם.
יכול להיות מתוכנן ניסוי microarray בגישה אחת או שני צבע. יש גישה ניסויית כל כמה יתרונות וחסרונות. באמצעות עיצובי שני צבעים מפחית את רעש ההשתנות ורקע, המאפשר השוואה ישירה עבור לולאת עיצובים עם הגדרת מדגם התייחסות משותפת. למרות הטיות הצבע וספציפית על תוצאות באופן משמעותי כאשר ניסויים מבוצעים באמצעות עיצובי שני צבעים, הטיות אלה ניתנים למתן על ידי ביצוע עסקות חלף צבע. שכפול טכני כזה מוסיף עלויות ניסוי, אבל יכול לשפר הוא דיוק ורגישות במדידת ביטוי הפרש 31.
השוואת לתוכנה ביואינפורמטיקה אחרים (כגון גורילה) PANTHER מאפשר השוואת הנתונים עם הגנום taurus Bos כנקודת התייחסות. התוצאות שלנו מעידות כי במהלך התפתחות עוברית שור יום 7 באות רכיבים ביולוגיים ופונקציות מעורבות: הסדרת metaphase / anapהמעבר hase של מחזור התא, הסדרת המעבר mitotic metaphase / anaphase, רגולציה של הפרדה כרומוזום, תרגום המיטוכונדריה, ubiquitination K48 צמודי חלבון, ER כדי Golgi תחבורה בתיווך שלפוחית, תהליך קטבולי mRNA-עיבד גרעיני, ייזום translational, הפרדה כרומטידה mitotic אחותו , חטיבת גרעיני mitotic.
הפרוטוקולים שהוצגו במאמר זה, מן תיוג פלורסנט של RNA המוגבר סריקה של מערכים צריכים להיות מוצאים להורג עם מודעות נוספות של הגורמים הסביבתיים למעלה כדי לשמור על נתונים איכותיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M.
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf (2016).
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
