Apresentamos um protocolo detalhado para construir e rastrear bibliotecas mutantes para campanhas de evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens atraentes no projecto enzimas para aplicações biotecnológicas, um processo que envolve a construção, clonagem e expressão de bibliotecas de mutantes, acoplada a alta frequência de recombinação homóloga de ADN in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo para criar e bibliotecas mutantes tela em leveduras com base no exemplo de um fúngica oxidase aril-álcool (AAO) para melhorar a sua actividade total. Dois segmentos de proteína foram sujeitos a evolução focalizado dirigido por mutagénese aleatória de ADN e na recombinação in vivo. Saliências de ~ 50 pb que flanqueia cada segmento permitiu a remontagem correcta do gene AAO-fusão num vector linearizado dando origem a um total de plasmídeo de replicação autónoma. Bibliotecas mutantes enriquecidos com variantes funcionais da AAO foram rastreados em S. cerevisiae sobrenadantes com um ensaio de elevado débito sensível com base na reacção de Fenton. O processo geral dea construção da biblioteca em S. cerevisiae aqui descrito pode ser facilmente aplicado a evoluir muitos outros genes eucarióticos, evitando reacções adicionais de PCR in vitro de recombinação de DNA e ligação etapas.
Introdução
Evolução molecular dirigida é um método robusto, rápido e fiável para conceber enzimas 1, 2. Através de ciclos iterativos de aleatória mutação, recombinação e selecção, versões melhoradas das enzimas pode ser gerado que actuam sobre novos substratos, em novas reacções, em não-naturais ambientes, ou até mesmo para ajudar a célula de atingir novos objectivos metabólicas 3-5. Entre os anfitriões utilizados na evolução dirigida, levedura Saccharomyces cerevisiae da cervejaria oferece um repertório de soluções para a expressão funcional de proteínas eucarióticas complexas que não estejam disponíveis em vias procariotas 6,7.
Utilizado exaustivamente em estudos de biologia celular, este pequeno modelo eucariótico tem muitas vantagens em termos de modificações pós-traducionais, a facilidade de manipulação e transformação eficiência, todos os quais são características importantes de engenheiro enzimas por evolução dirigida 8. Por outro lado, a alta frequênciarecombinação homóloga de ADN em S. cerevisiae acoplado ao seu aparelho à prova de leitura eficiente abre um vasto leque de possibilidades para a criação de biblioteca e montagem de gene in vivo, promovendo a evolução de diferentes sistemas de enzimas individuais para vias artificiais complexos 9-12. Nosso laboratório passou a última década projetando ferramentas e estratégias para a evolução molecular de diferentes ligninases em levedura (Oxirredutases envolvidas na degradação da lignina durante o decaimento de madeira natural) 13-14. Nesta comunicação, nós apresentamos um protocolo detalhado para preparar e bibliotecas mutantes tela em S. cerevisiae para um modelo flavooxidase, -aril-oxidase de álcool (AAO 15) -, que podem ser facilmente convertidos para muitas outras enzimas. O protocolo envolve um método evolução focada-dirigida (MORPHING: Processo mutagênicos Organizado recombinação homóloga in vivo pelo Agrupamento) assistida pelo aparelho celular de levedura 16, umda ensaio de rastreio muito sensível com base na reacção de Fenton, a fim de detectar a actividade AAO secretado para o caldo de cultura 17.
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Protocolo
1. Construção do mutante Biblioteca
- Escolher as regiões a ser submetido à transição com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura de cristal ou homologia modelos disponíveis 18.
- Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1).
Nota: Vários segmentos podem ser estudados por MORPHING de forma independente ou combinada 16.
- Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1).
- Ampliar as áreas visadas por PCR mutagênico. Criar áreas entre os segmentos (~ 50 pb cada) sobreposto por sobreposição de reacções de PCR das regiões definidas.
- Prepare PCR mutagénica de segmentos-alvo num volume final de 50 uL contendo uma cadeia molde de ADN (0,92 ng / uL), 90 nM de senso de oligo (RMLN para o segmento de MI e AAO-PA para o segmento M-II), 90 nM de uminiciador ntisense (AAO-92C para o segmento de MI e rMLC para segmento H-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM de cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO), MgCl 1,5 mM, MnCl2 0,05 mM de 2 e 0,05 U / ul de polimerase de ADN de Taq. Sequências de iniciadores são detalhadas na Figura 1.
- Usar o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 seg, 50 ° C durante 45 seg, 74 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 74 ° C durante 10 min (1 ciclo).
- Amplificar as regiões não-mutagénicos com ultra-alta polimerase fidelidade e incluem as áreas correspondentes que se sobrepõem os segmentos mutagénicos e / ou saliências vector linearizado.
- Prepare misturas reaccionais num volume final de 50 ul contendo: molde de ADN (de 0,2 ng / uL), 250 nM de oligo sentido HFF, 250 nM de oligo anti-sentido de HFR, dNTPs 0,8 mM (0,2 mM cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,02 U / ul de polimerase de ADN iproof. sequências de iniciadores são detalhados em Figura 1.
- Usar o seguinte programa de PCR: 98 ° C durante 30 seg (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 72 ° C durante 10 min (1 ciclo).
Nota: Com condições descritas no 1.2 e 1.3 sobreposições de 43 bp (região plasmídeo-M1); 46 bp (região de região-HF M1); 47 pb (região-M2 região HF) e 61 pb (M2 região plasmídeo) são concebidos (Figura 1) para favorecer no splicing in vivo em leveduras. - Purifica-se todos os fragmentos de PCR (mutagénicos e não mutagénicos) com um kit de extracção de gel comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Linearizar o vector de modo a que as regiões de cerca de 50 pb que flanqueia são criados que são homólogas às 5'- e 3'- extremidades do gene alvo.
- Prepara-se uma mistura de reacção contendo linearização 2 ug de ADN, 7,5 U de BamHI, 7,5 L Xho I, 20 ug de BSA e 2 ul de tampão Bam HI 10x num volume final de 20 ul.
- Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h e 40 min. Posteriormente, proceder a inactivação a 80 ° C durante 20 min.
- Purifica-se o vector linearizado por extracção em gel de agarose a fim de evitar a contaminação com o plasmídeo circular residual (Figura 2).
- Carregar a mistura reaccional para a digestão mega-poço de um baixo ponto de fusão do gel de agarose semi-preparativa (0,75%, w: v), bem como uma alíquota (5 pi) da mistura de reacção na adjacentes bem como um repórter.
- eletroforese Run DNA (5 V / cm entre os eletrodos, 4 ᵒC) e separar o gel de agarose correspondente ao mega-bem e armazená-lo em 4 ᵒC em 1x TAE.
- Manchar a faixa com a escada de peso molecular e o repórter. Visualizar as bandas sob a luz UV. Nick a posição onde os linearizadas lugares vetor.
Observação: Como a qualidade do vector linearizado purificado é um critifator de cal para a recombinação de sucesso e montagem em levedura, evitar manchas gel para eletroforese de DNA semi-preparativa. O uso de corantes e exposição aos raios UV para a extração de gel pode afectar a estabilidade do vector de ADN, comprometer a eficiência de recombinação in vivo. Como alternativa aos corantes EtBr tóxicos, Gel corantes SYBR vermelha e são comumente usados para a coloração do gel. - Na ausência de luz UV, identificar o vector linearizado no fragmento mega poço utilizando a orientação dos entalhes na pista repórter coradas de modo que ele pode ser isolado.
- Extrair o vector linearizado a partir de agarose e purificá-lo com um gel extraction kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
Nota: O uso de altas cópia vectores vaivém epissomal com marcadores de antibióticos e de auxotrofia: Neste exemplo, aplicou-se o uracilo independente e resistência à ampicilina pJRoC30 vector, sob o controlo do promotor de levedura GAL1.
- Preparar um mi equimolarxture dos fragmentos de PCR e misturá-lo com o vector linearizado numa proporção de 2: 1, com não menos do que 100 ng do plasmídeo linearizado (teste diferentes rácios de biblioteca equimolar / vector aberto para conseguir bons rendimentos de transformação).
- Medir a absorvância dos fragmentos de PCR e o vector linearizado a 260 nm e 280 nm para determinar a concentração e pureza.
- Transformar células competentes de levedura com a mistura de ADN utilizando um kit de transformação de levedura comercial (ver Tabela para o abastecimento) de acordo com as instruções do fabricante.
- Aqui, use uma protease deficiente e URA3 - S. dependentes cerevisiae, BJ5465. Transformar as células com o vector parental circularizado como um padrão interno durante o rastreio (ver abaixo). Além disso, o fundo vá transformando o vector linearizado na ausência de fragmentos de PCR.
Nota: Em caso de detecção de níveis iniciais de secreção baixos, use S.cerevisiae protease estirpes deficientes como BJ5465 para promover o acúmulo de proteína ativa em sobrenadantes de cultura. Se a enzima alvo é submetido a hiperglicosilação, a utilização de estirpes de glicosilação-deficiente (por exemplo, Δ Kre2 que só é capaz de prender pequenas oligómeros de manose) poderia ser uma opção adequada.
- Aqui, use uma protease deficiente e URA3 - S. dependentes cerevisiae, BJ5465. Transformar as células com o vector parental circularizado como um padrão interno durante o rastreio (ver abaixo). Além disso, o fundo vá transformando o vector linearizado na ausência de fragmentos de PCR.
- Placa as células transformadas em SC placas de abandono e incubar-los a 30 ° C durante três dias. Plate (em SC drop-out placas suplementadas com uracil) URA3 - S. cerevisiae células com falta do plasmídeo como um controlo negativo para o rastreio (ver abaixo).
2. Alto Throughput Screening Assay (Figura 3)
- Encher um número apropriado de placas de 96 poços estéreis (23 placas para analisar uma biblioteca de 2.000 clones) com 50 ul de meio mínimo por cavidade com a ajuda de um robot de pipetagem.
- Escolha das colónias individuais a partir do SC-gota a placas e transferi-los para as placas de 96 poços.
- Em cada prato, inocular número da coluna 6 com o tipo parental como padrão interno e bem H1 com URA3 - S. cerevisiae (células em meio SC suplementado com uracilo) sem plasmídeo como um controlo negativo.
Nota: Bem H1 é preenchido especificamente com os meios de abandono suplementadas com uracil. Um meio contendo bem em branco sem células também pode ser preparado como um controle adicional esterilidade.
- Em cada prato, inocular número da coluna 6 com o tipo parental como padrão interno e bem H1 com URA3 - S. cerevisiae (células em meio SC suplementado com uracilo) sem plasmídeo como um controlo negativo.
- Cubra as placas com suas tampas e envolvê-los em Parafilm. Incubar as placas durante 48 h a 30 ° C, 225 rpm e 80% de humidade relativa num agitador húmido.
- Remover o Parafilm, adicionar 160 uL de meio de expressão para cada cavidade com a ajuda do robot de pipetagem, voltar a selar as placas e incubar durante mais 24 h.
Nota: Minimal médio e médio expressão são preparados como relatado em outros 19. níveis de secreção podem variar em função do gene em estudo e, consequentemente, tele incubação vezes tem de ser optimizada em cada caso, para sincronizar o crescimento celular em todas as cavidades. - Centrifugar as placas (placas mestres) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir 20 uL do sobrenadante dos poços na placa mestra para a placa réplica, utilizando um líquido de manuseamento de múltiplas robótico.
Nota: Para favorecer a secreção de enzima é aconselhável substituir o péptido de sinal nativa da proteína alvo por péptidos de sinal vulgarmente utilizados para expressão heteróloga em levedura (por exemplo, o factor de prepro-α líder, o líder do K 1 da toxina assassina de S. cerevisiae, ou mesmo versões quiméricas de ambos os péptidos 13). Alternativamente, o péptido sinal nativo pode ser evoluído exclusivamente para a secreção em levedura. - Adicionar 20 ul de p -methoxybenzylalcohol 2 mM em 100 mM de tampão fosfato de sódio pH 6,0, com a ajuda do robot de pipetagem. Agitar as placas brevemente com uma de 96 nósLL misturador de placas e incubar durante 30 min à TA.
- Com o robot de pipetagem, adicionar 160 ul do reagente FOX para cada placa de réplica e agita-se brevemente com o misturador (concentração final de mistura FOX no poço: 100 uM de xilenol laranja, 250 ^ M de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 e mm H 25 2 SO 4).
- Adicionar vários aditivos para o reagente para aumentar a sensibilidade, tais como co-solventes orgânicos (DMSO, etanol, metanol) ou sorbitol 17. Aqui, amplificar a resposta por adição de sorbitol a uma concentração final de 100 mM (figura 4).
- Ler as placas (modo de ponto final, t 0) a 560 nm num leitor de placas.
- Incubar as placas à temperatura ambiente até a cor se desenvolve e medir novamente a absorção (T 1).
- Calcula-se a actividade relativa da diferença entre o valor Abs após a incubação e a da medição inicial normalizada com base na pareTipo ntal para cada placa (Dt 1 - t 0).
- Sujeitar os melhores hits mutantes para dois re-exames consecutivos para excluir falsos positivos.
Nota: Tipicamente, re-rastreios incluem isolamento de plasmídeos a partir de levedura, amplificação e purificação em Escherichia coli, seguido de transformação de células de levedura fresca com o plasmídeo 19. Cada clone seleccionado é re-exibido em pentaplicate.
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Resultados
AAO de P. eryngii é um flavooxidase extracelular que abastece as peroxidases fúngicas com H 2 O 2 para começar a atacar a lignina. Dois segmentos de AAO foram submetidos a evolução focada-dirigido por MORPHING, a fim de melhorar a sua actividade e a sua expressão em S. cerevisiae 19. Independentemente das enzimas estrangeiras abrigadas por S. cerevisiae, o problema mais crítico, quando a construção de bibliotecas de mutantes em ...
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Discussão
Neste artigo, nós resumimos a maioria das dicas e truques empregados no nosso laboratório para projetar enzimas por evolução dirigida em S. cerevisiae (AAO utilizando como exemplo) de modo que eles podem ser adaptados para utilização com muitos outros sistemas enzima eucariótica, simplesmente seguindo a abordagem comum descrito aqui.
Em termos de criação de biblioteca, Metamorfose é um método one-pot rápido para introduzir e recombinar mutações aleatórias em trechos de proteínas peq...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo projeto da Comissão Europeia Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; um Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; e pelos projetos nacionais Dewry [BIO201343407-R] e Cambios [RTC-2014-1777-3].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1. Meios de cultura | |||
| Ampicilina sal de sódio | Sigma-Aldrich | A0166 | CAS Nº 69-52-3 M.W. 371,39 |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| Cloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | CAS Nº 56-75-7 M.W. 323,13 |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | CAS Nº 59-23-4 M.W. 180,16 |
| D-(+)-glicose | Sigma-Aldrich | G5767 | CAS Nº 50-99-7 M.W. 180,16 |
| D-(+)-rafinose pentahidratada | Sigma-Aldrich | 83400 | CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594,51 |
| Peptona | Difco | 211677 | |
| fosfato de potássio monobásico | Sigma-Aldrich | P0662 | CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136,09 |
| Uracil | Sigma Aldrich | U1128 | |
| Extrato de Levedura | Difco | 212750 | |
| Base de Nitrogênio de Levedura sem Aminoácidos | Difco | 291940 | |
| Levedura Sintética Drop-out Medium Suplementos sem uracilo | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| 2. Reações de PCR | |||
| dNTP Mix | Agilent genomics | 200415-51 | 25 mM cada |
| iProof DNA polimerase de alta fidelidade | Bio-rad | 172-5301 | |
| Cloreto de manganês(II) tetrahidratado | Sigma-Aldrich | M8054 | CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91 |
| Taq DNA Polimerase | Sigma-Aldrich | D4545 | Para erro propenso PCR |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| 3. Linearização de plasmídeo< / strong> | |||
| BamHI enzima de restrição | New England Biolabs | R0136S | |
| Albumina de soro bovino | New England Biolabs | B9001S | |
| XhoI enzima de restrição | New England Biolabs | R0146S | |
| Enzima de restrição não I | New England Biolabs | R0189S | |
| Gel Red | Biotium | 41003 | Para coloração de DNA |
| strong>Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| 4. Ensaios FOX< / forte > | |||
| sulfato de ferro (II) de amônio hexahidratado | Sigma-Aldrich | F3754 | CAS N & ordm; 7783-85-9 MW 392.14 |
| Álcool de Anysil | Sigma Aldrich | W209902 | CAS N & ordm; 105-13-5 MW 138.16 |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | CAS N & ordm; 50-70-4 MW 182.17 |
| Peróxido de hidrogênio 30% | Merck Millipore | 1072090250 | FOX curva padrão |
| Xilenol Sal dissódico laranja | Sigma-Aldrich | 52097 | CAS Nº 1611-35-4 MW 716.62 |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| 5. Agarose gel stuff | |||
| Agarose | Norgen | 28035 | CAS Nº 9012-36-6 |
| Gel Red | Biotium | 41003 | corante de análise de DNA |
| GeneRuler 1kb Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | DNA MW corante de carregamento padrão |
| 6x | Thermo Scientific | R0611 | |
| Agarose de baixa temperatura de fusão | Bio-rad | 161-3112 | CAS Nº 39346-81-1 |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| 6. Kits e células | |||
| S. cerevisiae cepa BJ5465 | LGC Promochem | ATTC 208289 | Cepa deficiente em protease com genótipo: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL |
| E. coli XL2-Blue células competentes | Genômica Agilent | 200150 | Para purificação e amplificação de plasmídeos |
| NucleoSpin Gel e Kit | de Limpeza de PCRMacherey-Nagel | 740,609,250 | Extração de gel de DNA |
| Kit de plasmídeo NucleoSpin | Macherey-Nagel | 740,588,250 | Kit de minipreparação de coluna |
| Kit de transformação de levedura | Sigma-Aldrich | YEAST1-1KT | Transportador de DNA incluído (testículos de salmão) |
| Miniprep de plasmídeo de levedura Zymoprep I | Pesquisa Zymo | D2001 | Extração de plasmídeo de levedura |
| Nome | Company | Número de catálogo< | strong>Comentários |
| 7. Placasplacas de | |||
| 96 poços | Greiner Bio-One | 655101 | Poliestireno transparente, não estéril (para medições de atividade) |
| Placas de 96 poços | Greiner Bio-One | 655161 | Poliestireno transparente, estéril (para microfermentações) |
| Tampa de placa de 96 poços | Greiner Bio-One | 656171 | Poliestireno transparente e estéril (para microfermentações) |
Referências
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- Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).
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Reimpressões e permissões
