Artigo de método

Visualização de Twitching motilidade e Caracterização do papel da PilG in Xylella fastidiosa

DOI:

10.3791/53816

⸱

8 de abril de 2016

 , 
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

Neste artigo

Resumo

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Neste estudo, uma câmara de fluxo nano-microfluídico foi utilizado para visualizar e funcionalmente caracterizar a motilidade espasmos da Xylella fastidiosa, bactéria que causa a doença de Pierce em videira.

Resumo

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Xylella fastidiosa é uma bactéria não-flagelado Gram negativo que causa uma série de doenças economicamente importantes de plantas. A motilidade espasmos fornece X. fastidiosa um meio para o movimento de longa distância intra-planta ea colonização, contribuindo para patogenicidade em X. fastidiosa. A motilidade espasmos de X. fastidiosa é operado por pili tipo IV. Pili de tipo IV de Xylella fastidiosa são regulados por pilG, um regulador de quimiotaxia em proteínas do operão de codificação Pil-CHP que estão envolvidos com vias de transdução de sinal. Para elucidar os papéis de pilG na motilidade espasmos de X. fastidiosa, uma pilG -deficient mutante Xf ΔpilG e sua estirpe complementar XfΔpilG- C contendo pilG nativa foram desenvolvidos. A câmara microfluídicos integrados com um sistema de gravação de imagens de lapso de tempo foi usado para observar espasmos motilidade em XfΔpIlg, XfΔpilG- C e sua linhagem selvagem. Usando este sistema de gravação, que permite observações espaciais e temporais de longa duração de agregação, a migração de células individuais e as populações de bactérias através de motilidade espasmos X.. fastidiosa tipo selvagem e complementar estirpe XfΔpilG- C mostrou características típicas espasmos motilidade diretamente observados nas câmaras de fluxo microfluídicos, enquanto mutante XfΔpliG exibiu o fenótipo deficiente se contraindo. Este estudo demonstra que pilG contribui para a motilidade espasmos dos X. fastidiosa. A câmara de fluxo microfluidico é utilizado como um meio para a observação de contracções motilidade.

Introdução

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Xylella fastidiosa é uma bactéria patogénica gram-negativas não flagelados, que faz com que um certo número de doenças de culturas economicamente importantes, incluindo a doença de Pierce em videira (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Esta bactéria é limitada ao xilema de condução de água embarcações. Infecção da videira faz com que o bloqueio dos vasos do xilema e resulta em estresse hídrico e deficiências nutricionais 3. Colonização bem sucedida depende da capacidade da bactéria para se mover a partir do local inicial da infecção para o resto da planta 3. Espasmos motilidade é um meio de movimento bacteriana independente de flagelar através da extensão, apego e retração do pili tipo IV polar 4 que tem sido caracterizado X. fastidiosa 5,6,7.

A motilidade espasmos tem sido observado por pinças laser e microscopia de força atômica (AFM) 8,9,10. Utilizando estas técnicas, tmotilidades witching gerado pelo pilus de tipo IV de N. gonorrhoeae e P. aeruginosa foram caracterizados por fl pili rotulagem uorescently e capturando os seus movimentos microscopicamente. Embora ambos os métodos tenham detalhado a força adesiva de bactérias individuais, os procedimentos são complicados e demorados 9,10. As câmaras uidic fl micro foram usados ​​para observar a migração de longa distância de células individuais, bem como pequenos agregados de células bacterianas 5,6. Estas câmaras foram concebidas como um-nano-canal microfabricated em uma placa integrada com um lapso de tempo 11,12,13,14 sistema de gravação de imagem. Micro fl dispositivos câmara uidic oferecem várias vantagens para estudar o comportamento movimento e célula-célula interações de bactérias: (i) fornece uma plataforma integrada com múltiplas capacidades de canal; (Ii) que pode examinar os movimentos e agregações de células individuais nas características de nano-escala de bactérias; (Iii) que permite m diretaicroscopic gravação de imagem de células bacterianas e análises de lapso de tempo, (iv) ele fornece observações espaciais e temporais de longo prazo de populações individuais e / ou de bactérias em um micro-ambiente; (V) a taxa de fluxo de meio de cultura em um canal pode ser controlada com precisão e (VI), apenas um muito pequeno volume (1 ml) de meio de cultura é necessário para cada experiência.

Recentemente, o micro fl uidic fluxo do sistema foi utilizado para investigar o comportamento de células bacterianas sob diferentes microambientes 14,15,16. A adesividade e o anexo de superfície do E. coli 15, X. fastidiosa 16 e Acidovorax citrulli 14 em superfícies de vidro foram avaliados através de câmaras uidic micro fl. A formação de agregação e biofilme mediada por tipo pili IV do Acidovorax citrulli foram analisados ​​14. Além disso, o movimento de A. citrulli observado sob fl uxo cs condições demonstraram que o pili de tipo IV podem desempenhar papéis importantes na colonização e a propagação de A. citrulli nos vasos do xilema sob seiva fluxo condições. Os motilidades espasmos de Pseudomonas aeruginosa e X. fastidiosa células foram observadas com sucesso contra uma corrente de fluido numa câmara de fluxo microfabricado 5,6,17. Pilus de tipo IV deficiente PilB e pilQ mutantes de X. fastidiosa foram encontrados para alterar profundamente a velocidade da contraindo motilidade nas condições fl uxo em micro dispositivos uidic fl 5,6,18. Os estudos realizados sobre a adesão bacteriana e motilidade em dispositivos uidic fl micro indicaram que as câmaras uidic micro fl são particularmente adequadas para analisar a motilidade contrair-se e a migração das bactérias mediada por pili in vitro. Estes resultados explicam o mecanismo de migração mediada por espasmos que facilita a ligação célula-célula, a agregação e a colonização dentroo anfitrião, eventualmente, levar a infecção sistémica.

Pil-Chp operon de X. fastidiosa contém pilG, Pili, pilJ, Comprimido, CHPB e CHPC que a transdução do sinal de codificação vias 20. Os quimiorreceptores transmembranares ligar estímulos químicos no domínio periplasmático e activar uma cascata de sinalização na sua porção citoplasmática para controlar, em última análise da motilidade espasmos bacteriana. No operão Pil-cogeração de X. fastidiosa, uma PilG proteína fosfo-shuttle é um homólogo de CheY. Em E. coli e P. aeruginosa, CheY é o regulador de resposta de quimiotaxia em sistemas que interagem com as proteínas do motor flagelos 19, 21. Embora as contribuições do operon Pil-Chp em ​​direção a virulência em X. fastidiosa foram examinados 20 recentemente, o papel de pilG no operão quimiotaxia em resposta aos sinais ambientais e regulada pili de tipo IV / motor de X. fastidiosa é UNClear. Para elucidar a visão do regulador de quimiotaxia pilG na actividade da motilidade espasmos de X. fastidiosa, uma câmara de micro uidic FL é utilizado para avaliar a motilidade espasmos dos X. fastidiosa. O pilG de X. fastidiosa é caracterizada pela comparação dos fenótipos de um mutante de deleção Xf ΔpliG, a estirpe complementar XfΔpliG -C e seu tipo selvagem in vitro. Os resultados destacam o papel de pilG na motilidade espasmos de X. fastidiosa.

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Protocolo

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1. O Fringe periférica de origem bacteriana Colony

  1. Crescer X. fastidiosa (Xf) Temecula 22 de tipo selvagem, mutante de deleção pilG Xf ΔpliG (usando estratégia de deleção anteriormente descritos 23), e a sua complementar XfΔpliG -C (usando previamente descrito estratégia de complementação genética baseada no cromossoma 24) na PD2 de agar com meio placas 25 a 28 ° C durante 5-7 dias.
  2. Celofane autoclave (1 x 1 cm2) em água a 121 ° C (249 ° F) durante 15 min. Pegue um pedaço de celofane, drenar a água tocando em um canto do celofane em uma placa de Petri vazia, com cuidado colocar o celofane mais de 15% da superfície de agar e ar seco.
  3. Pegar indivíduo X. colónias fastidiosa com estéril palitos arredondadas e células no local assepticamente em uma folha esterilizada de celofane sobreposto ao 15% da superfície do agar nas placas de ágar. Incubar a placas a 28 ° C durante 2-3 dias.
  4. Examinar a morfologia da borda das colónias utilizando um microscópio de dissecação com uma lente objectiva 2X e uma lente ocular 10X. Fotografar a orla periférica em torno de colónias.

2. Microscopia e microfluídicos Fluxo Chambers

  1. Fabricar dispositivos microfluídicos utilizando procedimentos de foto-litográfica semelhantes aos descritos anteriormente 5,18. Projetar quatro canais paralelos com software de desenho assistido por computador sobre silício mestre usando métodos de litografia padrão 26.
  2. Criar as câmaras microfluídicos de mestre de wafer de silício com polidimetilsiloxano (PDMS). Pour PDMS não polimerizados sobre a bolacha de silício mestre e curá-la a 60 ° C durante 1 h. Descole a réplica de PDMS do mestre wafer e aparar a réplica PDMS com uma lâmina em um 22 mm x 40 mm como o mesmo tamanho de uma lamela de vidro.
  3. Expor a réplica de PDMS, uma lamela de vidro (22 x 40 mm2), e um microscslides ope (51 x 76 mm2) ao plasma de ar a 30 W por 2 min 27. Sanduíche do corpo PDMS entre a lamela de vidro eo vidro de microscópio para construir a câmara uidic fl micro.
  4. Perfurar um furo (5,5 mm de diâmetro) através do PDMS em cada extremidade do canal modelado. Corte o tubo de borracha de silicone em 12-20 cm de comprimento. Inserir uma extremidade da tubagem de borracha de silicone (5,1 mm de diâmetro externo, 2,1 mm de diâmetro interno, parede de 0,8 mm) em cada extremidade dos canais da réplica de PDMS de abertura, e selá-lo com PDMS não polimerizados a 60 ° C durante 1 h.
  5. Ligue a outra extremidade do tubo até o fim farpado de conectores luer de plástico. Enrole as câmaras de microfluidos montadas com a folha de alumínio e autoclave los durante 20 min.
  6. Recolha células de bactérias de X. fastidiosa tipo selvagem, mutante Xf ΔpliG, e complementar XfΔpliG -C através de raspagem, usando inoculação descartáveis ​​laços de placas de meio PD2. Ajustar a densidade celularpara uma densidade óptica de 0,05 a 600 nm em PD2 caldo como descrito anteriormente 23. Recolhe-se o solução da célula bacteriana numa seringa de 1 ml estanque ao gás.
  7. Montar o dispositivo microfluídico em um palco microscópio invertido. Ligue um tubo de entrada para a seringa estanque ao gás 5 ml contendo PD2 caldo. Montar a 5 ml estanque ao gás seringa com as bombas de seringa.
  8. Ligue o tubo de saída a um reservatório de resíduos. Manter uma taxa de fluxo de meio de 0,2 mL min -1 durante 30 minutos para estabilizar o sistema.
  9. Conectar tubos laterais de entrada a uma seringa de 1 ml estanque ao gás que contém a solução da célula bacteriana. Lavar a solução de células bacterianas através do tubo de borracha até que o canal seja atingido. Manter uma taxa de fluxo de meio de 0,2 mL min -1 durante mais 30 minutos, a fim de lavar as células não ligadas da câmara antes da captura da imagem.
  10. Montar o obturador microscópio sob a parte ajustada ao campo do microscópio para controlar a luz. Ligue o obturador para a co obturadorntrol sistema e ligar o sistema de controlo do obturador para o computador.
  11. Montar uma câmera digital à porta de vídeo do microscópio e conecte-o ao computador. Executar o software de gravação de lapso de tempo, selecione a função "obturador" do menu, e reconhecer automaticamente o obturador instalado como padrão no software para estabelecer conexões com o obturador com o software.
  12. Seleccione a função "camera digital" a partir do menu do software de gravação de lapso de tempo para reconhecer automaticamente a câmera digital como o dispositivo de captura padrão no software e estabelecer a comunicação com a câmera digital com o software.
  13. Localizar as células bacterianas em um dos canais usando 20X de contraste de fase óptica e, em seguida mudar para a lente da objectiva de 40X, antes da captura da imagem.
  14. Executar o software de gravação de lapso de tempo, selecione a função "aquisição de imagem" usando parâmetros padrão a partir do menu para adquirir as imagens do microscópio.Em seguida, abra a função "Adquirir time-lapse" e defina o intervalo de tempo para 30 seg 5,18,28, com duração de 6-24 horas, dependendo experiência necessária para observar se contraindo motilidade dos X. fastidiosa 5,18,28. Clique em "OK" para iniciar a gravação de lapso de tempo. Clique em "função de pilha" a partir do menu, selecione "salvar como" para empilhar as imagens na pasta de destino no computador depois de terminar a gravação.
  15. Para múltiplos canais, capturar imagens de lapso de tempo a partir do primeiro canal a cada 30 seg durante 6 horas. Mover a lente objectiva do microscópio para o próximo canal para localizar as células alvo. Repita a função de lapso de tempo, como descrito acima para capturar imagens em cada um dos quatro canais sequencialmente se experimento está configurado para utilizar quatro canais. Continue a captura de imagens de lapso de tempo para até três dias consecutivos. Todas as experiências foram realizadas à temperatura ambiente (23 ± 2 ° C).
  16. Compilar as imagens de lapso de tempo em umarquivo de vídeo usando o software de imagem de gravação de lapso de tempo. Executar o software de gravação de lapso de tempo, clique em "função Stack" no menu e selecione "função de pilha aberta" para abrir os arquivos empilhados a partir do computador.
  17. Inicie a função de "fazer cinema" do módulo de pilha, a seleção de todas as imagens e escolher o formato de saída "AVI". Clique em "Salvar como" para armazenar o arquivo de vídeo na pasta de destino no computador.
  18. Seleccione os filmes compilados a partir da pasta de destino no computador e reproduzi-los. Em seguida, observe a motilidade das células individuais através da visualização resultante da atividade espasmos motilidade de células de bactérias nos arquivos de vídeo gerados.

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Resultados

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A presença de uma colónia franja periférica indicativo de tipo IV mediada pelo pilus motilidade espasmos, foi observada nas colónias de X. fastidiosa tipo selvagem e complementar estirpe Xf ΔpliG -C (Figura 1). Mutante XfΔpliG, no entanto, não exibiram uma franja ao redor da periferia de colónias (Figura 1). Imagens de lapso de tempo de células bacterianas em câmaras de fluxo nano-microfluídico revelou que contraindo m...

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Discussão

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Neste estudo, caracteriza o comportamento de movimento de X. fastidiosa PilG mutante Xf ΔpilG e suas complementares estirpes XfΔpilG- C em recém-projetado de múltipla nano-canal paralelo micro câmaras fl uidic. As câmaras uidic recém-projetado micro fl pode ter até quatro câmaras paralelas com 100 um nano-canal de largura em comparação com modelos anteriores, com apenas uma única de 50 m de largura do canal 18. A melhoria mais ampla nano-canal facilita a introdução...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pelo United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação são mencionados somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica qualquer recomendação ou conselho pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild typeCosta, H. S., et al., 2004 22
pilG mutante de deleção XfΔ pliGShi, X. Y., et al., 2007 26
pilG cepa complementar XfΔ pliG-C Davis, M. J., et al. 1998 23
Materiais e equipamentos físicos
Alças de inoculação descartáveisVWR international, Radnor, PA#22-363-607procedimentos quantitativos, como coleta bacteriana
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow Corning Corporation#0002709226Kits Elastoméricos de silicone Sylgard 184
Câmera digital AmScope MD2000AmScope, Irvine, CASE305R-AZ-EImagem, gravação de vídeo e medição 
Linha de tubosEdgewood, NYConectado à seringa e à câmara microfluídica
Conectores luer de plásticoEdgewood, NYConectado à seringa e à câmara microfluídica
Bombas de seringaPico Plus, Harvard Apparatus, MA#702209A taxa de fluxo pode ser ajustada enquanto a bomba está funcionando.
SeringasGastight, Hemilton Company, Reno, NV# 1005Fornecer o caldo que flui
Microscópio Olympus IMT-2 invertidoOlympusIMT-2 FLuoro PHaseObservação e gravação de imagem
Câmera digital SPOT-RTDiagnostic Instruments, Inc., MIRT230Imagem, gravação e medição de vídeo
Obturador do microscópioO UNIBLITZ, US#LS2T2Câmera de controle' s tempo de exposição
Sistema de controle de obturador de microscópioO UNIBLITZ, USVCM-D1VCM-D1 Driver de obturador aprovado CE/UL/CSA de canal único
MetaMorph Image softwareUniversal Imaging Corp., PAProcessamento de imagem de super-resolução em tempo real 
#T4300

Referências

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Twitching MotilityXylella fastidiosaPilG GeneMicrofluidic Flow ChamberTime Lapse ImagingType IV PiliBacterial MotilityGene DeletionComplementary StrainPathogenicity Analysis

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