Summary
مع ABC نقل الفئران Bcrp1 (Abcg2) على سبيل المثال، تعرض البروتوكولات في سيليكون للكشف عن استخدام المروج بديل في الجينات وأعرب في الأنسجة الماوس، وتقييم الأداء الوظيفي من المروجين بديل تحديدها باستخدام المقايسات مراسل.
Abstract
وغالبا ما يسيطر التعبير الجيني في أنسجة مختلفة من قبل المروجين البديل الذي يؤدي في تركيب مرنا مع فريدة من نوعها - عادة غير مترجمة - الإكسونات الأولى. Bcrp1 (Abcg2)، وorthologue الفئران من ABC نقل الثدي البروتين السرطان المقاومة (BCRP، ABCG2)، وأربعة على الأقل المروجين البديلة التي يتم تحديدها من قبل أربعة الإكسونات الأولى البديلة المناظرة التي تنتجها: E1U، E1A، E1B، وE1C. هنا، يتم عرض البروتوكولات في سيليكون للتنبؤ استخدام المروج بديل للBcrp1. وعلاوة على ذلك، وصفت وسائل مراسل فحص لإنتاج بنيات مراسل المروجين بديل وتحديد وظيفة من المروجين المفترض المنبع من الإكسونات الأولى البديلة التي يتم تحديدها.
Introduction
أكثر من نصف الجينات البشرية التي ينظمها المروجين البديل 1. يمكن أن تحتوي على كل المروج البديل العناصر التنظيمية التي قد تكون مختلفة عن تلك الموجودة في المروجين بديل آخر. المروج (ق) المستخدمة في نسيج واحد قد تختلف عن تلك المستخدمة في أنسجة أخرى. على سبيل المثال، فمن الممكن أن تفعيل مسار إشارات معينة قد تؤدي إلى مروج بديل لجين المستخدمة في نسيج واحد، ولكن ليس لها أي أثر أو قمع المروج بديل مستقل لنفس الجين الذي يستخدم في أنسجة أخرى.
يخضع التعبير عن الجينات Bcrp1 قبل المروجين بديل. Bcrp1 هو orthologue الفئران من الجين الثدي البشري السرطان المقاومة البروتين (BCRP). BCRP هو ملزم ATP كاسيت (ايه بي سي) نقل، وعينت رسميا ABCG2 2 و 3. باعتبارها قمي بلازما بروتين الغشاء، BCRP / وظائف Bcrp1 إلى هروب رأس المال مجموعة متنوعة واسعة من ركائز الطبيعية وأجنبي بيولوجيا
في العمل في وقت مبكر لفهم تنظيم التعبير BCRP في الخلايا الطبيعية والأورام، تم تنفيذ 5 "التضخيم السريع لغايات كدنا] (5'-RACE) تحليل BCRP مرنا لتحديد موقع بداية النسخي المحدد لها 13. لا لم يكن هناك سوى عدة مواقع بداية النسخي وجدت. واجه أيضا كانت ثلاثة أشكال بديلة من اكسون الأول، وهو غير مترجمة في BCRP. هذه الإكسونات الأولى بديلة - المعين E1A، E1B، E1c - وأعرب عن مختلف في مجموعة متنوعة من الأنسجة البشرية. تم اكتشاف نوعين مختلفين إضافية اكسون الأولى في البحث انفجار في قاعدة البيانات EST الإنسان باستخدام اكسون الثاني من BCRP 13. كشفت أربع مباريات في أول اكسون> 70 كيلوبايت المنبع من اكسون 2 التي كانت مخصصة E1u. كشفت أربع مباريات أخرى BCRP مرنا التي تفتقر الى اكسون الأول تماما، والتي كانت مخصصة E1- 13. ويعتبر وجود الإكسونات زعيم بديلة ليكون مظهرا من مظاهر استخدام المروج بديل 14.
في الفئران، وصفت أربعة الإكسونات الأولى بديلة للBcrp1 التي قد تتوافق مع المروجين البديلة التي تحكم Bcrp 1 النسخ في أنسجة مختلفة الماوس. وتتم تسمية هذه الإكسونات / المروجين E1U، E1A، E1B وE1C، وتقع حوالي 70، 58، 15، و 5 كيلو بايت المنبع من Bcrp1 اكسون 2 5، 15. تم العثور على الإسوي E1A مرنا هو السائد في murinالبريد الخلايا الجذعية المكونة للدم والقلب والرئة والطحال، والدماغ، في حين أعرب عن الإسوي E1B في الأمعاء الماوس، وخلايا الكبد الجنين، والخلايا محمر السلائف في نخاع العظام 5، 15. وقد أظهرت المروج المنبع من E1B أن يكون المروج البديل الرئيسي الذي يحكم النسخ Bcrp1 في الأمعاء الماوس، ينظم على الأقل جزئيا، من خلال الفوسفات-دوري-AMP عنصر استجابة بروتين (ف CREB) وعنصر استجابة CREB فريدة من نوعها لهذا البديل Bcrp1 المروج 16. يتم التعبير عن الإسوي E1C مرنا في الغالب في الكبد الفئران الكبار والكلى 5. شكل الإسوي E1U غير قابل للكشف في معظم الأنسجة اختبار باستثناء الخصية في الفئران، حيث هو شكل الإسوي الغالبة أعرب 5. وأعرب Bcrp1 في الخصيتين الفئران وجدت في كل جسدية (تقاطعات البطانية ضيقة، خلايا شبه عضلية peritubular، وخلايا سيرتولي) والخلايا الجرثومية (في البطانة المنوية، حيث حفظه نطفة أرومية في وقت متأخر من المرحلة 4). ليموزينأيون المنبع من E1U يحتوي على عنصر استجابة وظيفية لالستيرويدي المنشأ عامل 1 (SF-1) 5. يتم تخفيض Bcrp1 مرنا والبروتين بشكل ملحوظ في الخصيتين من سيرتولي خلية محددة SF-1 الفئران خروج المغلوب، مما يوحي بأن Bcrp1 التعبير في خلايا سيرتولي الفئران تسيطر عليها SF-1 5.
البروتوكولات المعروضة أساليب التفاصيل للكشف عن الإكسونات الأولى بديلة للBcrp1 في سيليكون، وإقامة فحوصات مراسل القائم على وسيفيراز للمروجين المفترض المنبع من الإكسونات الأولى البديلة المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. في السيليكو التنبؤ البديل exons متماثلة الأولى من Bcrp1 عن طريق تحليل انفجار في قاعدة البيانات ماوس EST
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول كيفية البحث في الماوس أعرب تسلسل العلامة (EST) قاعدة بيانات عن التكنولوجيات السليمة بيئيا مع تسلسل التشابه لاكسون 2 من Bcrp1 (الذي يحتوي على الموقع بداية متعدية) ثم كيفية محاذاة مطابقة متواليات EST لتسلسل الجينوم للتأكد من الموقع في الجين الماوس Bcrp1 نسبة إلى نهاية 5 'من Bcrp1 اكسون 2.
- الحصول على تسلسل للماوس Bcrp1 اكسون 2 عن طريق إدخال مرنا تسلسل إشارة معرف (NM_011920.3) في نافذة البحث في متصفح Ensembl الجينوم 17، انقر على "جو GO". في الشاشة التالية، حدد تسلسل كامل طول (يحتوي على 16 الإكسونات):
- في الشاشة التالية ( "العرض القائم على نسخة")، حدد "16 exons متماثلة." وهذا عرض شاشة تحتوي على تسلسل بكل exons من Bcrp1. واكسون 2 من Bcrp1 قراءة "59؛ -AAAGGC ... TATCAA-3 "النتائج التي تم الحصول عليها سوف تكون مشابهة لتلك التي تظهر في اشارة 18.
- انقر على خيار "تحميل تسلسل". في الشاشة التالية، اختر تنسيق FASTA، ثم اضغط على "معاينة". في الشاشة التالية، قم بنسخ تسلسل معاينة من اكسون 2 في الحافظة.
- انتقل إلى موقع الانفجار 19 على المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) موقع 20.
- حدد "ماوس" الجينوم. لصق تسلسل اكسون 2 من الحافظة في مربع البحث.
- حدد "التكنولوجيات السليمة بيئيا" من القائمة المنسدلة قاعدة البيانات، وتحسين ل "متواليات مشابهة للغاية"، ثم اختر "انفجار". وقت التشغيل سوف يستغرق بضع دقائق. عندما المدى انفجار كاملة، وسوف تظهر "نتائج" صفحة.
- تحت عنوان فرعي "الوصف" من "نتائج" الصفحة، حدد "ALL"، ثم "تحميل"، ثم "FASTA (كاملةتسلسل) "في القائمة المنسدلة، ثم اختر" متابعة "ستظهر ملف txt؛ مفتوحة ونسخ الملف بأكمله إلى الحافظة وملف txt يحتوي على تسلسل من كل التكنولوجيات السليمة بيئيا مع ارتفاع تسلسل التشابه مع exon2 الماوس Bcrp1. ولكن ليس موقفهم فيما يتعلق اكسون 2 في جين Bcrp1.
ملاحظة: تحليل أجريت على 15 أبريل 2015 تحديد 14 التكنولوجيات السليمة بيئيا الفئران التي تتماشى مع Bcrp1 اكسون 2. يتم سرد هذه في الجدول 1.
- تحديد موقع تسلسل بتوقيت شرق الولايات المتحدة التي هي 5 'إلى اكسون 2 في جين Bcrp1. يقع هذا الجين الماوس Bcrp1 في contig NC_000072.6 كروموسوم 6 (GI: 372099104).
- على الصفحة الرئيسية لانفجار تحت عنوان فرعي "انفجار المتخصصة"، حدد "محاذاة اثنين (أو أكثر) تسلسل باستخدام انفجار (bl2seq)."
- لصق ملف نص من الحافظة في مربع البحث وأدخل 372099104 في مربع تسلسل الموضوع. تحسين ل "متواليات مشابهة للغاية" في إطار برنامجاختيار وتشغيل انفجار.
- مرة واحدة يظهر إطار النتائج، عرض التحالفات بيانيا عن طريق النقر على "الرسومات" في إطار "الأحلاف". استخدم السهمين الأيمن والأيسر والتكبير للتركيز على Bcrp1 / Abcg2 والاصطفافات تسلسل.
- حفظ التحالفات تسلسل: حدد "ALL" في خانة "الوصف"، ثم تحت "تحميل" القائمة المنسدلة حدد "ضرب الطاولة (CSV)"، ثم انقر على "متابعة". يحتوي هذا الملف على تسلسل محاذاة Bcrp1 اكسون 2 والتنسيق بين جميع متواليات EST مع تسلسل التشابه إلى Bcrp1 Exon2 النسبية لترقيم النيوكليوتيدات في contig كروموسوم الماوس 6. كل تسلسل EST الكامل قد تولد التحالفات متعددة تغطي المناطق 5 "و 3" لاكسون 2 بما في ذلك تسلسل متداخلة مع Bcrp1 اكسون 2.
- لأن الموقف من نهاية 5 'من اكسون 2 سوف تتوافق مع النوكليوتيدات 58655638 في contig كروموسوم 6، تعيين هذا النحو+1، ومن ثم حساب موقف تسلسل جزئية من كل EST 5 'إلى 58655638. يتم إعطاء النتائج لل14 التكنولوجيات السليمة بيئيا في الجدول 1.
ملاحظة: كن حذرا لتحليل تسلسل بتوقيت شرق الولايات المتحدة التي هي 5 'إلى +1 (أي لها قيمة النوكليوتيدات السلبية) كما الإكسونات الأولى المحتملة. على سبيل المثال، في اثنين من التكنولوجيات السليمة بيئيا التي تتماشى مع Bcrp1 اكسون 2 هو مبين في الجدول رقم 1 (AI647825 وAI664571) كان التسلسل المتبقية 3 "لاكسون 2.
2. تقييم Bcrp1 البديل المروج وظيفة
- تصميم مراسل يبني لBcrp1 E1U، E1A، E1B والمروجين E1C
- باستخدام تسلسل E1U تم الحصول عليها من البحث في قاعدة البيانات بتوقيت شرق الولايات المتحدة، تعين أول "النوكليوتيدات 5 من E1U كما +1.
- الحصول على كروموسوم اصطناعي البكتيرية (BAC) نسخة من كروموسوم الماوس 6 الذي يحتوي على تسلسل الجين Bcrp1 / Abcg2 وتسلسل لا يقل عن 100 كيلو بايت من المنبعBcrp1 / Abcg2 الجين (انظر قائمة المواد والمعدات).
- تحديد ناقلات مراسل مناسبة مثل وسيفيراز مراسل البلازميد pGL3 الأساسية.
- تحديد مواقع الاستنساخ متعددة في ناقلات المراسل. KpnI، ساسي، Mlu1، NheI، SmaI، XhoI، BglII وHindIII هي مواقع تقييد نوكلياز داخلية في موقع استنساخ متعددة من ناقلات pGL3 الأساسية، في 5 'إلى 3' التوجه.
ملاحظة: تسلسل المواقع الهضم هو متاح من كتالوجات المنتجات من الشركات التي تنتج الإنزيمات قيود. - تحديد جميع المواقع الهضم في اكسون E1U والمنطقة 2 كيلوبايت 5 'من E1U باستخدام برامج الحاسب الآلي مثل DNA5. تحديد موقعين على الأقل الهضم في عدة الموقع الاستنساخ-pGL3 الأساسية التي لا توجد في E1U أو المنطقة المنبع 2 كيلوبايت.
ملاحظة: تأكد من اختيار متعددة موقع تقييد الموقع استنساخ لالتمهيدي إلى الأمام وهذا هو المنبع من اختيار واحد لالتمهيدي العكسي لضمان إدراج فيلل يكون في الاتجاه الصحيح.
- إعداد الأمام وعكس الاشعال ل PCR التي تحتوي على تسلسل للمواقع متعددة تقييد الموقع استنساخ نوكلياز داخلية-pGL3 الأساسية المحددة باستخدام خدمات التركيب الجيني / التمهيدي التجارية أو برامج اختيار التمهيدي (انظر قائمة المواد والمعدات). حدد التمهيدي إلى الأمام تقع ~ 2 كيلوبايت المنبع من تسلسل E1U والتمهيدي العكسي ضمن تسلسل E1U. الاشعال المستخدمة في المؤلفين الأعمال السابقة أدرجت موقع ساسي في التمهيدي إلى الأمام، وموقع NheI في التمهيدي العكسي، وتضخيم المنطقة الجينومية من حوالي -1٬906-64 مع أول 5 "النوكليوتيدات E1U على النحو المحدد + 1 (راجع الخطوة 2.1.1 أعلاه)، ويتم توفيرها في اشارة 16.
- PCR تضخيم المنطقة الجينومية E1U استخدام هذه الاشعال، ،01-1 ميكروغرام من BAC، ومزيج الرئيسي PCR التي تحتوي على بلمرة طق عالية الدقة (انظر قائمة المواد والمعدات) مع تغيير طبيعة في95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم 35-40 دورات PCR، مع التمديد في 72 ° C (2 دقيقة)، والصلب وذوبان درجات الحرارة على أساس الخصائص ذوبان الاشعال المستخدمة.
ملاحظة: استخدام بلمرة طق عالية الدقة ضروري للمناطق تسلسل المروج التي تحتوي على محتوى GC عالية. عند استخدام كبيرة شظايا الحمض النووي الجيني مثل BAC كقالب، وهيكل ثانوي من الحمض النووي الجيني قد يجعل من الصعب على الاشعال PCR لربط. إذا دعت هذه المشكلة، ويمكن الحصول على النتائج PCR أفضل إذا تم المنفصمة القالب الحمض النووي الجيني طويلة بلطف بواسطة صوتنة قبل تفاعل PCR. - تحقق من طول المنتج PCR تضخيم بمقارنة ضد 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي باستخدام 0.8٪ تاي agarose هلام الكهربائي.
- PCR تضخيم المنطقة الجينومية E1U استخدام هذه الاشعال، ،01-1 ميكروغرام من BAC، ومزيج الرئيسي PCR التي تحتوي على بلمرة طق عالية الدقة (انظر قائمة المواد والمعدات) مع تغيير طبيعة في95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم 35-40 دورات PCR، مع التمديد في 72 ° C (2 دقيقة)، والصلب وذوبان درجات الحرارة على أساس الخصائص ذوبان الاشعال المستخدمة.
- هضم المنتج PCR التي تم الحصول عليها وناقلات pGL3 الأساسية، وذلك باستخدام تقييد نوكلياز داخلي محدد للمواقع الهضم تقييد أدخلت إلى الأمام وعكس الاشعال وفقا الإضافيةtructions المتوفرة مع الانزيمات تقييد الهضم.
- تنقية ردود الفعل الهضم باستخدام جل SV التجاري ومجموعة PCR تنظيف أنظمة (انظر قائمة المواد والمعدات)، وبعد عدة البروتوكول 21.
- تحقق الهضم والخطية للناقلات عن طريق مقارنتها ضد ناقلات تقطيعه باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام، ثم قص وتنقية الفرقة ناقلات الحمض النووي هضمها. قياس تركيز المنتج PCR المنقى وناقلات تنقيته باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية (انظر قائمة المواد والمعدات).
- تنقية ردود الفعل الهضم باستخدام جل SV التجاري ومجموعة PCR تنظيف أنظمة (انظر قائمة المواد والمعدات)، وبعد عدة البروتوكول 21.
- إعداد مراسل بناء E1U التي كتبها ligating المطهرون، هضم انزيم التقييد PCR المنتج واليراع ناقلات مراسل وسيفيراز-pGL3 الأساسية (الواردة في عدة الفحص مراسل، انظر قائمة المواد والمعدات) في إدراج: نسب متجه 11 و 21 و 31، باستخدام "T4 DNA يغاز عدة ربط سريع" وفقا لتعليمات مجموعة 22، وبالتالي إنتاج ص E1Uبناء eporter، واسمه pGL3-E1U.
- استخدام البلازميد pGL3-E1U لتحويل البكتيريا إلى توسيع متطابق بسلالة pGL3-E1U التعليمات التالية في عدة الاستنساخ TA (انظر قائمة المواد والمعدات).
- تأكيد التوجه والإخلاص للإدراج من خلال تحليل تسلسل.
- يبني إعداد مراسل E1A، E1B وE1C باستخدام منهجية مماثلة لE1U. تأكيد الولاء للإدراج بواسطة التسلسل كما هو الحال في القسم 2.1.5.2.
ملاحظة: إدراج المروج للE1A، E1B وE1C يجب أن يكون حوالي -1875 / + 10، -1847 / + 60، و-1904 / + 83 نسبة إلى أول "النوكليوتيدات 5 (تسمى +1) من E1A، E1B، أو E1C، على التوالي.
- أساليب مراسل مقايسة
ملاحظة: استراتيجية عامة للفحوصات مراسل: المروج المفترض (5 'المنطقة المنبع) من الجين يتم إدراجها في موقع استنساخ متعددة من "مراسل" ناقلات الفارغة التي تحتوي على "أوردتهمورثات المقاومة "(على سبيل المثال، يراعة وسيفيراز) المصب من موقع استنساخ متعددة. ثم يتم transfected متجه إلى خلايا حقيقية النواة التي تعبر عن هذا الجين من الفائدة. العوامل التي تعمل العابرة التي تعزز التعبير عن الجين في هذه الخلايا يجب تفعيل المروج في ناقلات مراسل transfected، مما تسبب في التعبير عن يراعة luciferase، والتي يمكن قياسها بسهولة مع مقايسة التألق.- حدد خط الخلية المناسب لاستخدامه في فحص المراسل.
ملاحظة: لتقييم نشاط E1U مراسل البديل المروج بناء، فمن الضروري ل transfect أن بناء في الخلايا التي تعبر عن Bcrp1 تحت سيطرة المروج E1U. خط خلية سيرتولي الفئران TM4 (انظر قائمة المواد والمعدات) يعبر عن بروتين Bcrp1 وBcrp1 مرنا يحتوي E1U، وكذلك E1A، E1B، وE1C 5. ونتيجة لسيطرة سلبية، والنظر في استخدام خط الخلية التي لا يعبر عن بروتين Bcrp1 أو مرنا. - ثقافة م TM4LLS في 24 لوحات جيدة في كثافة الأولية من 200،000 خلايا جيدا / في 1: 1 خليط من المتوسط F12 هام وتعديل المتوسطة النسر Dulbecco ومع 1.2 جم / لتر بيكربونات الصوديوم، تستكمل 15 ملي HEPES مع مصل الحصان 5٪، 2.5٪ مصل الجنين البقري، البنسلين (100 وحدة دولية / مل)، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، كما هو موضح سابقا 5.
- بعد ست ساعات من وضع الخلايا في الثقافة، transfect الخلايا مع 0.2 ميكروغرام من ناقلات pGL3 الأساسية فارغة أو مع 0.2 ميكروغرام من ناقلات pGL3 تحتوي على E1U -1906 / + 64 أو -1875 / + 10 E1A أو -1847 / + 60 E1B أو -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 الحذف بناء على طول مع 4 نانوغرام من ااا-TK (أ Renilla، معربا عن وسيفيراز ناقلات)، والرقابة الداخلية، وذلك باستخدام مجموعة الحمض النووي ترنسفكأيشن التجارية وبروتوكول الشركة المصنعة 23 (انظر قائمة المواد والمعدات) .
- 30 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائط النمو من الثقافيهإد transfected الخلايا. غسل خلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ثم إزالة محلول الغسيل.
- قياس اليراع وRenilla luciferase النشاط يستخدم عدة التجارية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة 24.
- تعبير عن النشاط لكل أنبوب كنسبة من النشاط يراعة luciferase مقسوما على (وسيفيراز Renilla) للرقابة الداخلية. وأعربت النتائج الإجمالية عادة نشاط كل مراسل بناء النسبي لتلك الخلايا transfected مع فارغة pGL3 ناقلات الأساسي، الذي حصل على القيمة 1.
- حدد خط الخلية المناسب لاستخدامه في فحص المراسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد Bcrp استخدام المروج 1 بديل في الخصية الماوس عن طريق تحليل الإكسونات الزعيم
عندما تم بحثها قاعدة البيانات بتوقيت شرق الولايات المتحدة في NCBI (أبريل 2015) باستخدام الخطوات الموضحة في بروتوكول 1، وجدت التكنولوجيات السليمة بيئيا التي كانت على تماس مع نهاية 5 'من اكسون 2 في Bcrp ترد 1 مرنا في الجدول 1، جنبا إلى جنب مع وضعهم في الجينومية الحمض النووي نسبة إلى بداية اكسون 2. واحد EST المستمدة من C57BL / 6J الخصية الفأر التي هي على تماس لاكسون 2 في Bcrp 1 مرنا لديها تسلسل الحمض النووي الجيني في 70 كيلوبايت المنبع من اكسون 2، الموافق E1U (الجدول 1). وبالمثل، تم الكشف عن التكنولوجيات السليمة بيئيا الموافق E1A، E1B، وE1C. وتجدر الإشارة إلى أن اثنين من التكنولوجيات السليمة بيئيا الموافق E1C يتضمن أيضا E1B تقسم إلى نهاية 5 'من E1C. موقع هذه الإكسونات الأولى المتوقعة فيويرد يتعلق Bcrp1 اكسون 2 على كروموسوم الماوس 6 في الشكل 1.
تقييم Bcrp وظيفة المروج 1 بديل
نموذجية النتائج luciferase الفحص الموافق E1U، E1A، وترد E1B وE1C-المروج وسيفيراز يبني مراسل transfected إلى TM4 خلايا سيرتولي الفئران (انظر القسم 2.2) في الشكل 2A.
في الأعمال السابقة، وكان من المتوقع أن تكون في المروج E1U 5 عنصر استجابة SF-1. إذا كان الأمر ينطوي هذا المفترض SF-1 عنصر استجابة في تنظيم Bcrp1 النسخ في الخصية الماوس، وبعد ذلك طفرة (كما هو موضح في ورقة السابقة 5) من هذا العنصر استجابة في E1U مراسل المروج بناء تقليل النشاط وسيفيراز التي تنتجها ذلك البناء عندما transfected إلىخلايا TM4. وتظهر نتائج تجربة نموذجية في الشكل 2B. يظهر بناء تحور luciferase النشاط أقل من بناء-تحور الامم المتحدة، مع النشاط مماثلة لتلك التي من ناقلات pGL3 الأساسية فارغة، حتى في الخلايا مع التعبير القسري من SF-1 (وصفها في ورقة السابقة 5). التعبير القسري من SF-1 يزيد من النشاط للبناء-تحور الامم المتحدة، ولكن ليس من واحد تحور.
رقيقة الصفحات = "1"> 
الشكل 1. رسم تخطيطي لمحاذاة الجينومية التكنولوجيات السليمة بيئيا مع تسلسل الهوية Bcrp1 اكسون 2 مع كروموسوم الفئران 6. وقد تم تحديد هذه التحالفات في البحث انفجار dbEST أجريت في أبريل عام 2015. تم العثور على أربعة تحالفات متميزة، الموافق Bcrp1 الإكسونات الأولى بديلة E1U، E1A، E1B، وE1C. ويرد هذا الرقم من منشور السابق 5. 
الرقم 2. فحص (A) مراسلة Bcrp1 المروجين E1U، E1A، E1B، وE1C في BALB / ج سيرتولي الخلايا TM4 المستمدة من الخلية. يتم التعبير عن البيانات مثل التلألؤ من يراعة luciferase تطبيع إلى أن من Renilla وسيفيراز، وذلك باستخدام الأساليب المذكورة في القسم 2. أظهرت بيانات والمتوسط والانحراف المعياري لثلاث تجارب مختلفة، وفعلت في أيام مختلفة. وتشير النجمة فرق كبير من مكافحة ناقلات pGL3 فارغة باستخدام -test تي (P <0.01). ويرد هذا الرقم من منشور السابق 5. (ب) آثار الطفرة العنصر استجابة SF-1 في إعادة Bcrp1 E1U حمال بناء على luciferase النشاط. يبني مراسل Bcrp1 مع المنطقة ملزم المفترضة SF-1 (تحور أو غير المتحولة) و transfected في الخلايا TM4 مع (SF-1 transfected) ودون (ناقلات transfected) التعبير القسري للبيانات SF-1.THE المعروضة هي متوسط من 3 تجارب مختلفة، وفعلت في أيام مختلفة. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. لكل تجربة، وأجريت فحوصات الفردية في نسختين. في الشكل، (A) يدل على اختلاف كبير عن سيطرة pGL3 ناقلات فارغة (P <0.05) باستخدام ر -test؛ (ب) يدل على فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة المروج بناء E1U باستخدام ر -test (P < 0.05). ويرد هذا الرقم من منشور السابق 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الجدول 1 ابحث عن انفجار في قاعدة البيانات EST الماوس في سياق تسلسل اكسون الثاني من Bcrp1 25 -28. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت معظم الأساليب والنتائج التمثيلية التي قدمت في أعمال سابقة بعنوان "يتم التحكم ب crp1 النسخ في الخصية الماوس بواسطة مروج المنبع من اكسون الرواية الأولى (E1U) التي تنظمها عامل 1 الستيرويدي المنشأ"، والتي نشرت في عام 2013 5 بالإضافة إلى نتائج تمثيلية يصور هنا، قدمت ورقة السابقة تقديرات استخدام اكسون أول البديل باستخدام منهجية PCR و RT-PCR 5'-RACE. وعلاوة على ذلك، في سيليكون تم انجازه تحديد المفترض عنصر استجابة SF-1 في المروج المنبع من E1U، وأظهرت لونين مناعي (رقاقة) المقايسات التي SF-1 بد أن المفترض عنصر استجابة SF-1. وكشفت الدراسات الفنية التي في خلايا سيرتولي الفئران، ويتم التحكم Bcrp 1 النسخ من SF-1 عن طريق عنصر استجابة SF-1 في المروج E1U. وشملت هذه الدراسات وظيفية upregulation من SF-1 في خلايا TM4 من هيئة تنظيم الاتصالاتnsfection أو عن طريق استخدام مثبط هيستون deacetylase (vorinostat)، مما أدى إلى تعزيز التعبير عن Bcrp 1 E1U مرنا، وزيادة في Bcrp 1 البروتين وكذلك نشاط E1U المروج Bcrp 1 في مقايسة مراسل. وأخيرا، فإن هذه الدراسات تقدم دليلا على أن في الخصيتين من الكبار سيرتولي خلية محددة SF-1 الفئران خروج المغلوب، والتعبير عن Bcrp 1 E1U مرنا، البروتين الكلي Bcrp 1 مرنا، وBcrp1 وقد تضاءل بشكل ملحوظ 5. كما ذكرت نفس العمل وأنماط التعبير من الأشكال الإسوية Bcrp1 مرنا في مجموعة متنوعة من الأنسجة الفئران، بما في ذلك الكلى والكبد والخصية والمخ والقلب والرئة والعضلات، والطحال 5.
البروتوكولات وصفها هنا - استخدام تنظيم الأنسجة محددة من Bcrp 1 كنموذج - توفير إطار تجريبي سطحي لكشف التعقيد النسخي من أي الجينات لتحديد التفاضليةالتعبير في الأنسجة المختلفة أو أنواع فرعية الخلوية. ويجب التأكيد على أن النتائج التي تم الحصول عليها من الخطوات بروتوكول وصف للتقييمات في سيليكون قد يكون منذ العديد من المواقع التي تضم البرمجيات وقواعد البيانات المستخدمة قد تكون عرضة للتغيير تعتمد على الوقت. منهجية في-سيليكون المعروضة هنا يستخدم البحث في قاعدة البيانات بتوقيت شرق الولايات المتحدة (dbEST) كما ذكرت سابقا 29، والتي تشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 18٪ من مجموع الجينات البشرية في مجموعة البيانات بتوقيت شرق الولايات المتحدة توظف المروجين بديل. البحث في dbEST قد نقلل الإكسونات الأولى بديلة، لأن المحققين الآخرين - باستخدام "بنسبة ضئيلة من السد" طريقة لإنتاج 1.8 مليون تسلسل 5'-نهاية cDNAs من العديد من الأنسجة البشرية - تمكنوا من تحديد المواقع بداية النسخي المفترضة لجينات الإنسان وتقدير أن 52٪ من الجينات RefSeq الإنسان دراستها ربما تنظمها المروجين البديل 1. ومن المثير للاهتمام، وجدت الدراسة الأخيرة أنالأنسجة التي تستخدم المروجين البديل المفترض أن معظم كانت الخصية والمخ. علاوة على ذلك، وجدوا أن جينات ترميز البروتينات ذات الصلة للإشارة إلى مسارات نقل كانوا أكثر عرضة لتوظيف الأنسجة محددة المروجين البديل 1. وعلى الرغم من العيوب المذكورة، يحلل dbEST تقديم لمحة تقريبية 5 "استخدام UTR لجين معين في أنسجة متعددة مع الحد الأدنى من الجهد.
على الرغم من أن dbEST التحليل يقدم نظرة سطحية في البديل استخدام اكسون الأول، ونحن نوصي بشدة أداء 5 "التضخيم السريع لغايات كدنا] تحليل (5'-RACE) للتحقق من أول استخدام اكسون في خط الأنسجة أو الخلايا قيد التحقيق. تتوفر ل5'-RACE، مع إجراءات تفصيلية واضحة المقدمة من قبل الشركة المصنعة مجموعات تجارية (انظر قائمة المواد والمعدات). وعلى الرغم من بعض الشيء تستغرق وقتا طويلا، وتوفر دراسات 5'-RACE التقديرات الفعلية لوجود فضلا عن سلسلة من السابق أول البديلالإضافات في مرنا في المصالح؛ علاوة على ذلك، فإن وجود عدة مواقع بداية النسخي ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن 13. لضمان تمثيل كاف، مطلوب تسلسل ما لا يقل عن 15 إلى 25 الحيوانات المستنسخة. قبل التسلسل، لا بد من إزالة تلوث متواليات ناقلات من المنتجات سباق 5 '. إذا لم يتم ذلك، قد تفشل تحليل انفجار تماما للكشف عن محاذاة التسلسل مع جينوم الفأر. وبمجرد إنشاء استخدام اكسون الأول، والنتائج 5'-RACE يمكن استخدامها للتحقق من كمية فحوصات RT-PCR اللاحقة لالإكسونات الأولى بديلة. بشكل عام، وجد العمل السابق المؤلفين أن هناك علاقة جيدة بين نسبة أول استنساخ مرنا اكسون استردادها عن طريق 5'RACE والنسبة المئوية من الناتج PCR تعافى لاكسون أول بديل معين من نفس نسيج أو خلية خط 5. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على علاقة جيدة بين أنشطة يبني وسيفيراز المروج للBcrp1 المروجين بديل لالثانية تعبير عن اكسون أول بديل المقابلة في خط خلية معينة 5.
في البحث عن الاستخدام المروج البديل الأنسجة محددة، في حالة استخدام أجهزة كاملة، يجب على المرء أن يكون على علم بأن بديلة المروجين / الأولى الإكسونات وجدت سوف تعكس عدم التجانس أنسجة الجهاز مثل العناصر الغدية، والأوعية الدموية، سدى، وما إلى ذلك ل مثلا، من الخصية هي مزيج من جسدي (ايديغ، سيرتولي، عضلاني، والبطانية) الخلايا وجرثومي الخلايا (فرداني)، وكذلك الأوعية الدموية. للتحقيق للتعبير الأول اكسون الأنسجة محددة، وسوف يكون من الضروري عزل أنسجة معينة من الأجهزة.
وقد تم الإبلاغ عن وسائل أخرى لتحديد استخدام المروج البديل والتنظيم. ومع ذلك، هذه تحتاج إلى الجيل المقبل من التسلسل والمعلوماتية الحيوية الحوسبة قادر على تحليل كمية كبيرة من البيانات المنتجة. وتشمل هذه الأساليب التسلسل transcriptosome كله (RNA يليها)، ورقاقة وما يليها منالهستونات مثل H3K4me3 التي ترتبط بشكل تفضيلي لمروجي 30. على الرغم من أن هذه الأساليب يمكن أن تكون مكلفة لأداء دي نوفو، عندما يكون التركيز على التعبير عن جينات قليلة وأنسجة معينة، والتعدين والبيانات الموجودة قد يكون نهجا أكثر واقعية.
فحوصات لتقدير نشاط المروج المقدمة هنا تستخدم للناقلات pGL3 الأساسية، والذي يحتوي على منطقة استنساخ متعددة المنبع من الجين يراعة luciferase. يتم قياس نشاط المروج من إنتاج يراعة luciferase، الذي كميا بسهولة، بعد إضافة العوامل المساعدة وركيزة الانارة، عن طريق قياس التألق في luminometer التجاري (انظر قائمة المواد والمعدات). ويمكن إجراء متجه pGL4 ذات الصلة لاحتواء علامات اختيار (على سبيل المثال، النيومايسين، هيغروميسين، بوروميسين)، مما يتيح إنتاج الخلايا ستابلي. البروتوكولات الواردة في هذه الورقة تستخدم ترنسفكأيشن عابر. عادة، المقايسات مراسل العرض وتتم النشاط إيه باستخدام شارك في ترنسفكأيشن مع ناقلات التي تعبر بشكل جوهري Renilla (البحر بانسي) وسيفيراز (ااا-TK)، للسيطرة على التغيرات في عدد الخلايا وكفاءة ترنسفكأيشن. خطوة حاسمة في تأسيس فحص المروج لجين معين هو للتأكد من أن يتم التعبير عن الجينات في المصالح في خط الخلية التي يتم transfected مع بناء مراسل. ثانيا، عندما استخدام المروج البديل موجودا، فمن المهم استخدام بناء المروج الذي يتوافق مع اكسون أول بديل أعرب في خط الخلية transfected. على سبيل المثال، لا نتوقع أن نرى التألق لبناء المروج E1U التي transfected في الخلايا التي تعبر عن Bcrp1 فقط تحت سيطرة المروج E1B. بدلا من ذلك، كوسيلة لمراقبة سلبية، ترنسفكأيشن لمراسل بناء في خط الخلية التي لا تعبر عن الجين أو مرنا الإسوي من الفائدة يجب أن يؤدي إلى عدم إنتاج يراعة luciferase.
جonsequences من استخدام المروج بديلة تشمل إنتاج البروتين نفسه، وإنتاج البروتينات مع مختلف N-ترميني، أو إنتاج البروتينات المختلفة 29. في حالة Bcrp1 / BCRP، متعددة سيطرة (نسيجيا أو خلية نوع محدد) المروجين إنتاج البروتين نفسه. ويوجد نمط مماثل لCYP19 (الهرمونات) الجين 29 و 31. البروتوكولات المعروضة هنا تقدم خطوات أساسية يمكن للمرء أن استخدام فك في خط نسيج أو خلية آليات معقدة من السيطرة النسخي من البروتين من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
دوغلاس د روس وجامعة ماريلاند، بالتيمور عقد حقوق براءات الاختراع لBCRP البشري.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جوائز مراجعة الاستحقاق لدوغلاس د روس وعارف حسين من وزارة شؤون المحاربين القدامى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
