Abstract
Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren , um effizient und direkt Haemophilus influenzae liefern in die unteren Atemwege von Mäusen. Wir zeigen das Verfahren zur Herstellung von H. influenzae Inokulum, intratracheale Instillation von H. influenzae in die Lunge, Sammlung von broncho-alveolären Lavage (BALF), Analyse von Immunzellen in der BALF und RNA - Isolation für Differentialgenexpressionsanalyse. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Lungenentzündungsreaktion auf alle Bakterien, Viren oder Pilze zu untersuchen. Direkt tracheale Instillation wird meist über intranasale oder Aerosolinhalationsverfahren bevorzugt, da es effizienter das bakterielle Inokulum in die unteren Atemwege mit geringer Mehrdeutigkeit liefert.
Introduction
Die Entzündung ist eine grundlegende Immunabwehrmechanismus gegen infektiöse Erreger. Es fördert die Erreger Beseitigung und Reparatur von beschädigtem Gewebe. Es erleichtert auch die Erholung zu einem normalen , gesunden Zustand 1. Jedoch führt dysregulated Entzündung oft zu chronischen entzündlichen Erkrankungen 2. Entzündung der Atemwege ist ein erster Auslöser für verschiedene Lungenerkrankungen wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Asthma und Lungenfibrose 3.
Die nicht-typisierbaren (nicht eingekapselten) Haemophilus influenzae (NTHi) mit chronischen oberen und unteren Lungenentzündungserkrankungen 4,5 verbunden. Es ist die dominante Spezies aus den unteren Atemwege von Kindern und Erwachsenen mit chronisch - obstruktiver Lungenerkrankung 4,6,7 isoliert. Die Entzündungsantwort nach der NTHi-Infektion wird durch die Hochregulation von proinflammatorischen Zytokinen (wie TNF und IL-1β) gekennzeichnet, und es wird vermittelt by Mitogen - aktivierte Proteinkinase (MAPK) und nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) über Toll-like Rezeptoren (TLR) 8.
Mausmodelle sind sehr nützliche Werkzeuge zur Analyse der zugrundeliegenden Pathologie der Lungenentzündungskrankheit aufgrund der Verfügbarkeit der verschiedenen Gen-defizienten Linien. Live / attenuierten Bakterien und bakterielle Produkte zu inokulieren, einschließlich intranasale Instillation und aerosolized Inhalations 9,10 mehrere Verfahren verwendet worden. Hier zeigen wir, intratracheale Instillation. Obwohl weniger häufig verwendet wird, ist dieser Ansatz effizienter und hoch reproduzierbare wegen der direkten Abgabe des Inokulums auf den unteren Atemwege.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von Baylor Research Institute durchgeführt.
1. Anzucht nicht typisierbaren Haemophilus influenzae (NTHi) und Vorbereiten des Inokulums
- Platte NTHi auf einem Schokolade - Agar - Platte und halten die Platte den Kopf in einem befeuchteten CO 2 Inkubator über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. Am folgenden Tag Kultur der Bakterien in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe. Dann fügen Sie 1 ml der Brühe in eine sterile 1,5 ml-Tube.
- Zentrifuge bei 4.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Dann wird der Überstand verworfen und erneut zu suspendieren, das Pellet in 1 ml sterile 1x PBS. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt.
- Transfer von 100 & mgr; l der resuspendierten Lösung in 900 ul 1x PBS und Messen der Extinktion der verdünnten Kultur bei 600 nm Wellenlänge in einem Spektrophotometer.
- Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit und die Kolonie bildende Einheits (CFUs) des Inokulums durch Züchten 01.10 Reihenverdünnungen auf Schokolade - Agarplatten und über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert.
- Bezogen auf die Lebensfähigkeit und die CFUs aus dem vorherigen Schritt bestimmt wird , das Inokulum auf eine Endkonzentration von 20 x 10 6 CFU / ml einzustellen.
2. intratracheale (it) Einträufeln
- Injizieren Sie die Maus intraperitoneal (ip) mit 0,1 ml / 10 g Körpergewicht der Maus mit einer 150 mg / ml Ketamin + 20 mg / ml Xylazin Lösung. Das Verfahren sollte mit einer Lichtquelle in der Haube getan werden, um das Tier warm zu halten.
- Drücken Sie den Zehenzwischenraum der Maus, um zu überprüfen, dass die Maus ausreichend betäubt.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken. Shave den ventralen Bereich des Halses und desinfizieren mit Chlorhexidin und 70% Ethylalkohol.
- Heben Sie die Haut des oberen ventralen Teil des Halses unter Verwendung von Rattenzahnzange. Machen Sie einen kleinen Schnitt (0,5-1,0 cm) über dem Thymus mit einem Skalpellund sorgfältig den Muskel sezieren, um die Luftröhre aus.
- Unter Verwendung einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel, die Injektion sollte langsam 0,05 ml Luft, gefolgt von 0,05 ml NTHi erhalten von Abschnitt 1 oder Salzlösung als Kontrolle, gefolgt von einem weiteren 0,05 ml Luft. Halten Sie Tier vertikal für ca. 1 min.
- Schließen Sie den Schnitt mit chirurgischen Klebstoff. Halten Sie die Maus seitlich liegend und warm für ca. 10 min.
3. BALF Sammlung
- Opfere die Maus durch Genickbruch 24 Stunden nach der Infektion.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle der Maus mit anatomischen Schere und schneiden Sie die Bauchaorta zu bluten. Setzen Sie das ventrale Teil der Lunge.
- Setzen Sie die Luftröhre und intubieren es mit einem 20-Gauge-Katheter. Instill 0,8 ml BALF Puffer (1x PBS, 0,1% Dextrose, 10 U / ml Heparin) und die Spülung durch leichtes Ansaugen sammeln. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
- Zählen der Gesamtzahl der Zellen in 100 & mgr; l BALF Suspension unter Verwendung eines hemocytoMeter unter 10-facher Vergrößerung mit Trypan-Blau-Färbung.
- Bereiten Sie Folien für modifizierte Giemsa. Aliquot 100 ul BALF in die entsprechenden Vertiefungen der Cytospin und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Trocknen der Objektträger für 10 min und färben die Zellen modifiziert Giemsa-Färbung unter Verwendung von nach Protokollen des Herstellers.
- Verwenden , um die verbleibenden Zellen für eine nachfolgende Analyse, wie beispielsweise Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung (FACS), die konfokale Mikroskopie, die Genexpression und die Western - Blot - 11-13.
4. Histopathologie Vorbereitung
- Für histopathologische Analyse, infizieren Mäuse mit NTHi wie in Schritt 2.4 beschrieben. Nach 24 Stunden der Infektion opfern, um die Tiere durch Genickbruch. Schneiden Sie die Brusthöhle mit anatomischen Schere öffnen die Lunge und die Luftröhre freizulegen, wie bereits erwähnt. Dann legen Sie die 20-Gauge-Katheter in die Trachea.
- Füllen Sie die Lunge mit 2% warme Agarose-Lösung in 4% Formalin präpariert. Sobald derLungen sind voll aufgeblasen, statt Eis auf der Oberseite der Lunge die Agarose-Lösung zu verfestigen.
- Dann entfernen Sie vorsichtig die Brust Stecker und steckte es in eine 50 ml-Lösung von 4% Formalin in 1x PBS, bis sie für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Abschnitte verarbeitet wird.
5. FACS Zellen in der BALF Anfärben
- Stellen 1 x 10 5 Zellen von der BALF Fluid in einer 96-Well - V-Boden Mikrotiterplatte.
- Wasche die Zellen mit 300 ul kaltem PBS 1x und Schleudern bei 4.000 × g für 3 min bei 4 ° C.
- Stain die Zellen mit Zellfarblösung in 100 ul 1x PBS (1: 1000 Verdünnung) und halten bei Raumtemperatur für 15 min.
- Wasche die Zellen mit 300 ul kaltem PBS 1x bei 4.000 × g für 3 min bei 4 ° C.
- Halten Zellen in 100 & mgr; l FACS-Waschpuffer [Waschpuffer (1x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% Natriumazid], das 1: 100 verdünnt Fc-Block-für 15 min bei 4 ° C.
- Centrifuge Zellen bei 4.000 × g für 3 min und entsorgen supernatant.
- Stain Zellen mit 100 & mgr; l Oberflächenfärbung Cocktail (1: 100 Verdünnung) in FACS-Waschpuffer für 30 min bei 4 ° C.
- Waschen Zellen dreimal mit 300 & mgr; l FACS-Waschpuffer bei 4.000 × g für 3 min bei 4 ° C.
- Fix-Zellen in 100 & mgr; l von 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur.
- Wasche die Zellen zweimal mit 300 ul 1x PBS bei 400 × g für 3 min bei 4 ° C und resuspendieren in 300 & mgr; l FACS-Waschpuffer.
- Machen Sie einfarbige Färbung Kontrollen unter Verwendung von Durchflusszytometrie Perlen.
- Geben Sie einen Tropfen Perlen in den 96-Well-V-Boden-Mikrotiterplatte und waschen mit 200 ul 1x PBS.
- 1 & mgr; l-Färbung Antikörper auf 100 ul 1x PBS und Perlen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie Perlen zweimal mit 300 ul 1x PBS.
- Analysieren Sie einzelne gebeiztem Kontrollen und Zellen mittels Durchflusszytometrie 14.
6. Homogenisieren von Lungengewebe RNA zu isolieren
- Nach der Infektion über Nacht ein kleines Stück Lunge (20-40 mg) und halten Sie sie in RNA-stabilisierende Reagenz bei 4 ° C zu sammeln. Dann speichern Sie es bei -80 ° C bis zum nächsten Schritt.
- Waschen Sie die Lungengewebe in kaltem 1x PBS loswerden der RNA-Stabilisierung Reagenz zu erhalten.
- Platzieren das Gewebe in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, das Lyse-Puffer (1 ml Lyse-Puffer + 10 & mgr; l β-Mercaptoethanol).
- Hacken Sie das Gewebe in kleine Stücke spitzen Schere und homogenisieren für 20-40 sec ein schnurloses Motor Pellet zerstoßen.
- Halten Sie das Lysat auf Eis für 5 min und fahren Sie mit Schritt 7.1.
7. RNA-Isolierung aus der Lunge
- Zentrifugieren Sie das Lysat bei 18.000 × g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und vorsichtig Transfer in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
- 1 Volumen von 70% Ethanol zu dem Lysat. Mischen Sie sofort durch Pipettieren und warten 2-4 min.
- Übertragen Sie bis zu 700 & mgr; l Lysat auf eine Spin-Säule platziertin einem 2 ml Sammelröhrchen.
- Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden und den Durchlauf verwerfen.
- In 350 ul strengen Waschpuffer und Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- In 80 ul DNase I direkt auf die Spinsäule Membran und halten Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- In 350 ul strengen Waschpuffer auf die Spin-Säule und Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- In 500 ul RNA Waschpuffer und Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- In 500 ul RNA Waschpuffer und Schleudern bei 9.600 × g für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen und Zentrifuge bei 9.600 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Hinzufügen 30-50 & mgr; l RNase-freiem Wasser direkt auf die spin-Säule zentrifugieren bei 9.600 × g für 1 min. Store RNA bei -80 ° C.
- Führen RNA-Seq - Analyse 14.
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Representative Results
Intratracheale Instillation führte zu einer deutlich erhöhten Anzahl von Leukozyten in der BALF (1A, linkes Feld) als Anlage mit Kochsalzlösung. Die Differentialzählung Analyse der Leukozyten zeigte deutlich erhöhte neutrophile Infiltration (Abbildung 1, rechts). Die FACS - Analyse der Zellen in der BALF bestätigt weiter die erhöhte Anzahl von Neutrophilen (1B). Histologische Analyse von H & E-gefärbten Schnitten des Lungengewebes zeigten eine Entzündung der Atemwege (1C) erhöht. Diese Daten legen nahe, dass kollektiv intratracheale Instillation Atemwegsentzündung bei Mäusen induziert. Um die Verwendung dieses Ansatzes zur Untersuchung von Signalwegen zu unterstützen, die Atemwegs Pathogenese regulieren, haben wir Mäuse, die für die E3-Ubiquitin-Ligase Itch defizient sind. Krätze ist bekannt , bei der Regulierung der Entzündungssignalwege 15 mit einbezogen werden. Wir geimpftalters- und geschlechtsangepassten Wildtyp C57BL / 6-Steuerung und Itch - / - Mäuse mit NTHi. Wir isolierten RNA aus den Lungengeweben von Kontroll WT und Itch - / - Mäusen und ausgeführt ganze Transkriptom Sequenzierung der Entzündungs Gene zu identifizieren, die differentiell exprimiert werden. In differenzielle Expression von mehreren Genen , wie in Abbildung 2, Mangel führte Itch gezeigt. Dies legt nahe, daß intratracheale Instillation verwendet werden kann, Lungenentzündung, Genexpressionsprofile und Signalwege zu untersuchen.
Abbildung 1: intratrachealen Inokulation von NTHi induziert Lungenentzündung bei Mäusen Mäuse wurden mit NTHi geimpft (10 6 CFU / Maus) oder einer Salzkontrolle.. 24 Stunden nach der Inokulation wurden die Mäuse getötet (A) BALF wurde gesammelt. Die gesamten Leukozyten, Monozyten und Neutrophilen-Zahlen bestimmt. Die Daten sindals Mittelwert ± SEM. n = 4 Mäuse / Gruppe. * Zeigt p <0,05 im Vergleich zu Kochsalzlösung behandelten Mäusen. (B) Die Zellen in der BALF wurden mit anti-Gr1 - Antikörper gefärbt und durch FACS analysiert. (C) H & E-gefärbten Lungenschnitten Leukozyten - Infiltration und Entzündung zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Differentielle Genexpression in der Lunge von WT und Itch - / - Mäusen nach der intratrachealen NTHi Inokulation 24 Stunden nach NTHi Inokulation RNA aus den Lungen von zwei WT isoliert wurde (1, 2) und zwei Itch - / -. (1, 2) Mäusen. (A) wurde die RNA Qualität analysiert , um eine Bioanalyzers verwenden. (B) Heatmap zeigt Z-Scores (als Maß für sd interpretiert weg vonder Mittelwert) für die Zählung log 2 pro Million (log 2 CPM) von 172 differentiell exprimierten Gene mit Edger im Itch identifiziert - / -. im Vergleich zu WT - Mäusen Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine einzigartige und minimal-invasive Verfahren, um die Lungen von Mäusen, die mit einer bakteriellen Lungen Pathogen zu beimpfen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren verwendet werden kann, um die Funktion der verschiedenen Gene zu untersuchen, die in Mäusen unter Verwendung von Genen von Entzündungssignalwege defizient sind. Dieses Verfahren kann auch die Entzündungsreaktionen gegen virale und fungale Infektionen der Lunge zu untersuchen verwendet werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber anderen Verfahren, wie intranasale oder Aerosolinhalation sind (1) in diesem Verfahren wird das pathogene Inokulum direkt an die unteren Atemwege instilliert; (2) die Fähigkeit, das Inokulum Größe zu steuern; und (3) ein geringeres Risiko einer bakteriellen Exposition gegenüber dem Handler.
Die Exposition der Trachea chirurgisch für Bakterien Einträufeln ist ein entscheidender Schritt, wo Pflege Schäden an umliegenden Gewebe zu vermeiden, getroffen werden müssen, verursachen, vor allem die Blutgefäße.
Instillation von Bakterien in die Trachea should sorgfältig durch Erstickung die Möglichkeit des Todes der Mäuse zu vermeiden, durchgeführt werden. Es wird vorgeschlagen, dass das Inokulum (etwa 50 ul) langsam freigesetzt werden und die Luft vor und nach dem Inoculum injiziert werden. nach dem Einträufeln der Maus vertikal zu halten für eine Weile und halten sie seitlich erleichtert Liegerad schnellere Genesung. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass Mehrfachbelichtungen innerhalb kurzer Zeit nicht möglich sind aufgrund des Erfordernisses der Chirurgie. Ein mögliches Problem ist, dass, wenn der Katheter zu tief in die Bronchien platziert ist, wird der BALF-Zellzahl niedriger sein. Dieses Problem kann durch Ziehen des Rohres leicht nach oben gelöst werden.
Da die Inzidenz von Atemwegsentzündungserkrankungen sind weltweit 3,16 zu erhöhen, das Verständnis der Pathophysiologie dieser Krankheiten ist von zentraler Bedeutung. Die Technologien, die in dieser Studie beschriebenen könnte dazu beitragen, wichtige regulatorische Wege zu erkennen und könnten die Entwicklung erleichternneuer Behandlungsmethoden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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