Abstract
Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l'analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l'isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l'inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.
Introduction
L'infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute 1. Tuttavia, l'infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche 2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare 3.
L'Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superiori ed inferiori polmonari croniche 4,5. E 'la specie dominante isolati dalle vie aeree inferiori di bambini e adulti con cronica ostruttiva 4,6,7 malattia polmonare. La risposta infiammatoria dopo l'infezione NTHi è caratterizzata dalla sovraregolazione di citochine proinfiammatorie (come TNF e IL-1β), ed è mediata by mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) e fattore nucleare-kB (NF-kB) attraverso i recettori Toll-like (TLR) 8.
Modelli murini sono strumenti molto utili per analizzare la patologia sottostante del polmone malattia infiammatoria a causa della disponibilità di diverse linee gene-carenti. Diversi metodi sono stati utilizzati per inoculare batteri vivi attenuati / e prodotti batterici, tra intranasale instillazione e aerosolized 9,10 inalazione. Qui, dimostriamo intra-tracheale instillazione. Sebbene utilizzato meno frequentemente, questo approccio è più efficace e altamente riproducibili a causa della consegna diretta dell'inoculo al tratto respiratorio inferiore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Baylor Research Institute.
1. Coltura non tipizzabile Haemophilus influenzae (NTHi) e preparazione del Inoculo
- Piatto NTHi su una piastra di agar cioccolato e mantenere la piastra capovolta in un umidificata CO 2 incubatore notte a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno seguente, la cultura i batteri in brodo Brain Heart Infusion. Quindi, aggiungere 1 ml di brodo in una provetta sterile da 1,5 ml.
- Centrifugare a 4000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Poi, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile 1x. Ripetere questa operazione una sola volta.
- Trasferire 100 ml di soluzione di ri-sospeso in 900 ml di PBS 1x e misurare l'assorbanza della cultura diluito a 600 lunghezze d'onda nm in uno spettrofotometro.
- Determinare l'unità di vitalità e formazione di colonies (CFU) del inoculo di coltura 1:10 diluizioni seriali su piastre di agar cioccolato e incubando overnight a 37 ° C e 5% CO 2.
- Sulla base della vitalità e CFU determinata dal passaggio precedente, regolare l'inoculo ad una concentrazione finale di 20 x 10 6 CFU / ml.
2. intra-tracheale (esso) instillazione
- Iniettare il mouse per via intraperitoneale (ip) con 0,1 ml / 10 g di peso corporeo di mouse con un / ketamina + 20 mg / ml soluzione xylazina ml 150 mg. La procedura deve essere eseguita nel cappuccio con una sorgente luminosa per mantenere l'animale caldo.
- Pizzicare lo spazio interdigitale del mouse per verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato.
- Posizionare il mouse sul dorso. Radere la zona ventrale del collo e disinfettare con clorexidina e il 70% di alcol etilico.
- Sollevare la pelle della parte ventrale superiore del collo usando ratto pinze dente. Fai una piccola incisione (0,5-1,0 cm) sopra il timo con un bisturie sezionare accuratamente il muscolo per esporre la trachea.
- Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, iniettare lentamente 0,05 ml di aria, seguito da 0,05 ml NTHi ottenuti dalla sezione 1 o soluzione salina come controllo, seguita da un'altra 0,05 ml di aria. Tenere animali verticale per circa 1 min.
- Chiudere l'incisione con la colla chirurgica. Mantenere il mouse lateralmente reclinata e caldo per circa 10 min.
3. Raccolta BALF
- Sacrificare il mouse cervicale dislocazione 24 ore dopo l'infezione.
- Aprire la cavità addominale del mouse con forbici anatomiche e tagliare l'aorta ventrale a sanguinare. Esporre la parte ventrale del polmone.
- Esporre la trachea e intubare con un catetere 20 gauge. Instillare 0,8 ml di tampone BAL (1x PBS, 0.1% di destrosio, 10 U / ml di eparina) e raccogliere il lavaggio aspirando delicatamente. Ripetere questa procedura per tre volte.
- Contare il numero totale di cellule in 100 microlitri di sospensione BALF utilizzando un hemocytometro a 10 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione.
- Preparare vetrini per modificare la colorazione Giemsa. Un'aliquota di 100 ml di BAL nei rispettivi pozzetti della cytospin e centrifugare a 500 xg per 5 min. Asciugare le diapositive per 10 minuti e macchiare le cellule utilizzando modificato macchia Giemsa secondo protocolli del produttore.
- Utilizzare le cellule rimanenti per la successiva analisi, come la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), microscopia confocale, l'espressione genica e Western Blot 11-13.
4. istopatologia Preparazione
- Per l'analisi istopatologia, infettare i topi con NTHi come descritto al punto 2.4. Dopo 24 ore di infezione, sacrificare gli animali da dislocazione cervicale. Tagliare aprire la cavità toracica con le forbici anatomiche per esporre i polmoni e la trachea come accennato prima. Quindi, inserire il catetere 20 gauge nella trachea.
- Riempire il polmone con il 2% soluzione di agarosio calda preparata in formalina 4%. Una volta che ilpolmoni sono completamente gonfiati, posto ghiaccio sulla parte superiore dei polmoni a solidificare la soluzione di agarosio.
- Poi, rimuovere con attenzione la spina dorsale e metterlo in una soluzione 50 ml di formalina 4% in PBS 1x fino a quando non viene elaborato per (H & E) sezioni ematossilina eosina.
5. FACS colorazione delle cellule nel BALF
- Mettere 1 x 10 5 cellule dal fluido BALF in un piatto titolo micro V-bottom 96 pozzetti.
- Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS e far girare a 4000 xg per 3 min a 4 ° C.
- Macchiare le cellule con soluzione macchia cellule in 100 microlitri 1x PBS (1: 1.000 diluizione) e mantenere a temperatura ambiente per 15 min.
- Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C.
- Mantenere cellule in 100 ml di FACS tampone di lavaggio [tampone di lavaggio (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide] contenente 1: 100 diluito Fc-Block per 15 min a 4 ° C.
- cellule centrifugare a 4000 xg per 3 min e scartare supernatant.
- cellule macchia con 100 microlitri superficie colorazione cocktail (diluizione 1: 100) in tampone di lavaggio FACS per 30 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule tre volte con 300 ml di tampone di lavaggio FACS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C.
- Fix cellule in 100 ml di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule due volte con 300 microlitri di PBS 1x a 400 xg per 3 min a 4 ° C e risospendere in 300 ml di tampone di lavaggio FACS.
- Effettuare controlli per la colorazione monocolore citometria a flusso perline.
- Aggiungere una goccia di perle nel piatto microlitro 96 pozzetti V-parte inferiore e lavare con 200 microlitri 1x PBS.
- Aggiungere 1 ml di colorazione degli anticorpi a 100 l PBS 1x e perline e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Lavare perle due volte con 300 ml 1x PBS.
- Analizzare i controlli e le singole cellule macchiato mediante citometria di flusso 14.
6. L'omogeneizzazione di tessuto polmonare per isolare l'RNA
- Dopo l'infezione, raccogliere un piccolo pezzo di polmone (20-40 mg) e conservarlo in RNA stabilizzante reattivo a 4 ° C durante la notte. Poi, conservare a -80 ° C fino alla fase successiva.
- Lavare i tessuti del polmone a freddo 1x PBS per sbarazzarsi del reagente stabilizzazione RNA.
- Posizionare il tessuto in un tampone di lisi contenente 1,5 ml tubo da centrifuga (1 ml di buffer di lisi + 10 ml β-mercaptoetanolo).
- Tritare il tessuto in piccoli pezzi con le forbici a punta ed omogeneizzare con un cordless pestello pellet motore per 20-40 secondi.
- Mantenere il lisato in ghiaccio per 5 minuti e procedere con passo 7.1.
7. Isolamento RNA dal polmone
- Centrifugare il lisato a 18.000 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante pipettando e trasferire con cura in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Aggiungere 1 volume di etanolo 70% al lisato. Mescolare immediatamente pipettando e aspettare 2-4 minuti.
- Trasferire fino a 700 ml di lisato ad una colonna di spin localein un tubo di raccolta 2 ml.
- Centrifugare a 9.600 xg per 15 sec e scartare il flow-through.
- Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 80 microlitri DNasi direttamente alla membrana Spin Column e mantenere a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e far girare a 9.600 xg per 2 minuti. Gettare il flow-through.
- Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 30-50 acqua priva di RNasi microlitri direttamente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. RNA Conservare a -80 ° C.
- Eseguire l'analisi RNA-Seq 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Instillazione intra-tracheale provocato un marcato aumento del numero di leucociti nel BALF (Figura 1A, pannello di sinistra) di installazione con soluzione salina. L'analisi conteggio differenziale dei leucociti mostrato chiaramente migliore infiltrazione dei neutrofili (Figura 1, pannello di destra). L'analisi FACS delle cellule nel BALF confermato ulteriormente l'aumento del numero di neutrofili (Figura 1B). L'analisi istologica delle sezioni H & E-macchiati del tessuto polmonare ha mostrato un aumento infiammazione delle vie aeree (Figura 1C). Questi dati suggeriscono che collettivamente instillazione intra-tracheale induce infiammazione delle vie aeree nei topi. Per supportare l'uso di questo approccio per studiare vie di segnalazione che regolano vie aeree patogenesi, abbiamo utilizzato topi che sono carenti per l'E3 ubiquitina ligasi Itch. Prurito è noto per essere coinvolto nella regolazione della segnalazione infiammatoria vie di diffusione 15. abbiamo inoculatoC57BL di controllo per età e tipo selvaggio sesso-abbinato / 6 e Itch - / - mice con NTHi. Abbiamo isolato l'RNA dai tessuti polmonari di WT controllo e Itch - / - mice e svolta tutta trascrittoma sequenziamento per identificare i geni infiammatori che vengono espressi in modo differenziale. Come mostrato in figura 2, la carenza prurito provocato differenziale espressione di diversi geni. Ciò suggerisce che intra-tracheale instillazione può essere utilizzato per indagare infiammazione polmonare, profili di espressione genica e di vie di segnalazione.
Figura 1: inoculazione intra-tracheale di NTHi induce infiammazione polmonare nei topi I topi sono stati inoculati con NTHi (10 6 CFU / mouse) o un controllo soluzione salina.. 24 ore dopo l'inoculazione, i topi sono stati sacrificati (A) BALF è stato raccolto. Il numero totale di leucociti, monociti e neutrofili sono stati determinati. I dati sono presentaticome media ± SEM. n = 4 topi / gruppo. * Indica p <0,05 rispetto ai topi trattati con soluzione fisiologica. (B) Le cellule nel BAL sono state colorate con anticorpo anti-Gr1 ed analizzati mediante FACS. (C) H & E-macchiato sezioni polmonari mostrano l'infiltrazione dei leucociti e l'infiammazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: espressione genica differenziale nei polmoni di WT e Itch - / - mice seguenti intra-tracheale NTHi inoculazione 24 ore dopo NTHi inoculazione, l'RNA è stato isolato dai polmoni di due WT (1, 2) e due Itch - / -. (1, 2) topi. (A) di qualità RNA è stato analizzato utilizzando un Bioanalyzer. (B) Mappa termica mostrando punteggi Z (interpretato come una misura di sd distantila media) per il conteggio log 2 per milione (log 2 CPM) di 172 geni differenzialmente espressi identificati utilizzando edger nel Itch - / -. rispetto ai topi WT prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o inalatoria aerosol sono (1) in questa procedura, l'inoculo patogeno è direttamente instillato al tratto respiratorio inferiore; (2) la capacità di controllare le dimensioni dell'inoculo; e (3) riduzione del rischio di esposizione batterica al gestore.
L'esposizione della trachea chirurgicamente per instillare i batteri è un passo cruciale in cui bisogna fare attenzione per evitare di causare danni ai tessuti circostanti, in particolare i vasi sanguigni.
Instillazione di batteri nella trachea should essere fatto con attenzione per evitare la possibilità della morte dei topi a causa di asfissia. Si suggerisce che l'inoculo (circa 50 ml) viene rilasciato lentamente e aria essere iniettata prima e dopo l'inoculo. Mantenendo il mouse verticale dopo l'instillazione per un po 'e il loro mantenimento lateralmente reclinata facilita il recupero più veloce. Il principale svantaggio di questa procedura è che esposizioni multiple all'interno di un breve periodo di tempo non sono possibili a causa del requisito della chirurgia. Un potenziale problema è che, se il catetere è posizionato troppo in profondità nel bronco, il conteggio delle cellule BAL sarà più basso. Questo problema può essere risolto tirando il tubo leggermente verso l'alto.
Dal momento che l'incidenza delle malattie infiammatorie delle vie aeree sono in aumento in tutto il mondo 3,16, comprensione della fisiopatologia di queste malattie è di primaria importanza. Le tecnologie descritte in questo studio potrebbero aiutare a individuare percorsi normativi chiave e potrebbero facilitare lo sviluppodi nuove modalità di trattamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
