Artigo de método

Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em

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DOI:

10.3791/53975

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18 de abril de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Neste artigo

Resumo

A abundância de proteínas reflete as taxas de síntese e degradação de proteínas. Este artigo descreve o uso de perseguição de cicloheximida seguida de western blotting para analisar a degradação de proteínas no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento).

Resumo

Regulamento da abundância de proteína é crucial para praticamente todos os processos celulares. abundância proteína reflecte a integração das taxas de síntese de proteínas e a degradação da proteína. Muitos ensaios de relatórios sobre a abundância de proteínas (por exemplo, em tempo único ponto de transferência de Western, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, ou os ensaios reporter baseados em crescimento) não permitem discriminação dos efeitos relativos de tradução e proteólise nos níveis de proteína. Este artigo descreve a utilização de ciclo-heximida perseguição seguido de western blotting para analisar a degradação de proteínas especificamente no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de germinação). Neste procedimento, as células de levedura são incubadas na presença do inibidor de ciclo-heximida translacional. Alíquotas de células são recolhidas e imediatamente depois em pontos de tempo específicos seguintes adição de ciclo-heximida. As células são lisadas e os lisados ​​são separados por electroforese em gel de poliacrilamida for análise de Western blot de proteínas de abundância em cada ponto de tempo. O procedimento de ciclo-heximida perseguição permite a visualização da cinética de degradação da população do estado estacionário de uma variedade de proteínas celulares. O procedimento pode ser utilizado para investigar os requisitos para genéticos e influências ambientais sobre a degradação da proteína.

Introdução

Proteínas executar funções cruciais em praticamente todos os processos celulares. Muitos processos fisiológicos requerem a presença de uma proteína específica (ou proteínas) por um período de tempo definido, ou sob circunstâncias particulares. Organismos, portanto, monitorar e regular a abundância de proteína para atender às necessidades celulares 1. Por exemplo, as ciclinas (proteínas que controlam a divisão celular) estão presentes em fases específicas do ciclo celular, e a perda dos níveis de ciclina regulamentados tem sido associada com a formação do tumor maligno 2. Além de regular os níveis de proteína para satisfazer as necessidades celulares, células empregam mecanismos de controlo de qualidade degradativas para eliminar deformadas, as moléculas de proteína não montadas, ou de outro modo aberrantes 3. Controle de abundância de proteína envolve regulação tanto a síntese macromolecular (transcrição e tradução) e degradação (decomposição RNA e proteólise). a degradação da proteína deficiente ou excessiva contribui para várias patologias, Incluindo o cancro, fibrose cística, doenças neurodegenerativas, e desordens cardiovasculares 4-8. Mecanismos proteolíticas, portanto, representam alvos terapêuticos promissores para uma série de doenças 9-12.

Análise de proteínas em um único ponto do tempo (por exemplo, por western blot 13, citometria de fluxo 14, ou microscopia de fluorescência 15) fornece um instantâneo da abundância de proteína em estado estacionário, sem revelar as contribuições relativas de síntese ou degradação. Da mesma forma, ensaios repórter baseada em crescimento reflectem os níveis de proteína em estado estacionário durante um período de tempo prolongado sem discriminar entre as influências de síntese e degradação 15-20. É possível inferir a contribuição dos processos de degradação para os níveis de proteína em estado estacionário, comparando abundância antes e depois de inibir componentes específicos do mecanismo de degradação (por exemplo, por farmacologicamente inactiva o proteasome 21 ou batendo para fora um gene a hipótese de ser necessário para a degradação 13). Uma alteração nos níveis de proteína em estado estacionário após a inibição das vias degradativas proporciona forte evidência para a contribuição de proteólise para o controlo da abundância de proteína 13. No entanto, essa análise ainda não fornece informações sobre a cinética de retorno da proteína. Chase Cycloheximide seguida por western blot supera essas deficiências, permitindo que os investigadores para visualizar a degradação da proteína ao longo do tempo 22-24. Além disso, porque a detecção da proteína seguinte perseguição ciclo-heximida é tipicamente realizada por Western blotting, isótopos radioactivos e passos morosos imunoprecipitação não são necessários para a perseguição ciclo-heximida, ao contrário de muitas técnicas de pesquisa por pulso habitualmente utilizados, que são também realizados para visualizar a degradação da proteína de 25.

Ciclo-heximida foi pela primeira vez identificado como um composto com anti-fúngica adequadalaços produzidos por Streptomyces bactéria gram-positiva griseus 26,27. É uma molécula de células-permeável que inibe especificamente citosólica eucariótica (mas não organelar) por tradução ribossomal prejudicando translocação 28-31. Numa experiência cicloheximida Chase, ciclo-heximida é adicionado às células, e as alíquotas de células são recolhidas e imediatamente em pontos de tempo específicos após a adição do composto 22. As células são lisadas, e a abundância de proteína em cada ponto de tempo é analisado, tipicamente por western blot. Diminuições na abundância de proteínas após a adição de ciclo-heximida pode ser com confiança atribuídos a degradação da proteína. Uma proteína instável vai diminuir em abundância ao longo do tempo, enquanto que uma proteína relativamente estável irá apresentar pouca mudança em abundância.

Os mecanismos de degradação de proteínas selectiva têm sido altamente conservadas ao longo da Eukarya. Muito do que se sabe sobre a degradação das proteínas foi aprendido pela primeira vez emo eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) 25,32-36. Estudos com levedura tendem a continuar fornecendo insights novos e importantes para a degradação de proteínas. Um método para a perseguição de ciclo-heximida em células de levedura, seguido de análise Western blot de proteínas de abundância é aqui apresentada.

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Protocolo

1. Crescimento e colheita de células de levedura

  1. Se não análise cinética de degradação de uma proteína de levedura endógena, transformar a estirpe (s) desejado levedura com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse. Métodos fiáveis ​​para a transformação de leveduras foram previamente descrito 37.
  2. Inocular levedura em 5 ml de meio apropriado (por exemplo, definida SD) meio selectivo sintético (para manutenção de plasmídeo de células transformadas, ou de meio de levedura não selectivo-extracto de peptona-dextrose (YPD) para células não transformadas). Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
    NOTA: 30 ° C é a temperatura de crescimento óptima para típica de tipo selvagem estirpes de levedura de laboratório 38. No entanto, porque algumas estirpes de leveduras mutantes não crescem optimamente a 30 ° C e algumas proteínas sofrem degradação dependente da temperatura, as temperaturas utilizadas para o crescimento de células de levedura e Chase cicloheximida deve ser determinada empiricamente 39.
  3. Meça the a densidade óptica a 600 nm (OD600) de cada cultura durante a noite.
    NOTA: As células podem estar em fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deve ter minimamente atingiu uma densidade que vai permitir que a diluição para um OD 600 = 0,2 em 15 ml de meio fresco.
  4. Dilui-se as culturas durante a noite para um valor de DO 600 de 0,2 em 15 ml de meio fresco.
  5. Incubar levedura a 30 ° C, agitando até que as células atingem a fase de crescimento meio-logarítmica (ie, uma OD 600 entre 0,8 e 1,2).
  6. Durante o crescimento de células de levedura, faça o seguinte, em preparação para o procedimento cicloheximida perseguição:
    1. Definir um bloco de calor que pode acomodar tubos de 15 mL cónicos de 30 ° C durante a incubação das células na presença de ciclo-heximida. Adicionar água para os poços da placa de aquecimento para permitir a distribuição de calor eficiente para as culturas. Adiciona-se água a cada poço de tal modo que um tubo de 15 ml fará com que o nível da água suba para, mas não transbordar, o lábio do poço.
    2. Definir um segundo bloco de aquecimento que pode acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95 ° C para a desnaturação de proteínas após a lise celular.
    3. meio de crescimento fresco pré-aquecido (1,1 ml por ponto de tempo por cultura a ser testada) a 30 ° C.
    4. Adicionar 50 ul 20x Parar Mix de pré-rotulados microtubos (um tubo por tempo ponto por cultura a ser testada). Coloque os tubos em gelo.
      CUIDADO: A azida de sódio, um ingrediente em 20x Parar Mix, é tóxico por ingestão oral ou por contacto dérmico. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear azida de sódio. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
  7. Quando as células atingiram crescimento meio-logarítmica, recolher 2,5 OD 600 unidades de cada cultura por ponto de tempo a ser testada (por exemplo, 7,5 unidades de OD 600 para analisar a abundância da proteína em três pontos de tempo). Centrifugar as células recolhidas em tubos de 15 ml em 3,0 cónicas00 xg à temperatura ambiente durante 2 min.
    NOTA: Uma unidade DO600 é igual à quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a uma DO 600 de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita X OD 600 unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = X OD 600 unidades / DO600 medido. Por exemplo, para a colheita de 7,5 OD 600 unidades de cultura de células de levedura a uma DO 600 de 1,0, recolher 7,5 OD 600 unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultura de levedura.
  8. Ressuspender cada pelete de células em 1 ml de 30 ° C (pré-aquecido) por meio de crescimento fresco com 2,5 OD 600 unidades de células (por exemplo, 3 ml de 7,5 OD 600 unidades).

2. Cycloheximide perseguição

  1. Equilibrar as suspensões de células de levedura por incubação durante 5 min no bloco de calor a 30 ° C.
  2. Prepare um temporizador para contar até de 0:00.
  3. Para começar a perseguição cicloheximida, pressione "Start" no temporizador. rapidamente,mas com cuidado, execute os seguintes passos:
    1. Adicionar ciclo-heximida a uma concentração final de 250 ug / mL à suspensão de células de levedura primeiro (por exemplo, adicionar 37,5 ul de estoque de 20 mg de ciclo-heximida / ml a 3 ml de suspensão de células), e agitar com vortex para misturar brevemente.
      CUIDADO: Ciclo-heximida é um irritante dérmico e é tóxico por ingestão oral. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear cicloheximida. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
    2. Imediatamente após a adição de ciclo-heximida e vórtex, transferir 950 ul (~ 2,4 OD 600 unidades) da suspensão de células de levedura com ciclo-heximida adicionado a um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo 50 ul de mistura de 20x paragem gelada. Vortex o tubo de microcentrífuga e colocar no gelo até que todas as amostras foram coletadas.
    3. Retorno da suspensão de células de levedura a 30 ° C.
  4. Repita os passos 2.3.1 através de 2.30,3 para cada um dos restantes suspensões de células de levedura, a intervalos de tempo regulares (por exemplo, a cada 30 seg, de tal modo que a ciclo-heximida é adicionado à amostra # 1 a 0:00, Amostra # 2 a 0:30, a Amostra # 3 a 1:00 , etc.).
  5. Em cada momento posterior, as suspensões de células de levedura vortex e de transferência de 950 ul a tubos de microcentrífuga rotulado contendo 50 ul pré-refrigerado 20x Parar Mix. Vortex e células lugar recolhido no gelo. Retornar 15 ml tubos cônicos de bloco de calor a 30 ° C.
    1. Por exemplo, para a recolha de células de 30 minutos após a adição de ciclo-heximida (assumindo 30-sec intervalos entre a adição de ciclo-heximida a suspensões de células de levedura, no início do curso de tempo), de vórtice e remover 950 ul de suspensão celular a partir da amostra # 1 a 30:00 . Repita o procedimento para Amostra # 2 em 30:30, e assim por diante.
      NOTA: Para evitar a sedimentação de levedura, as suspensões de células de vórtice em tubos de 15 mL cónicos aproximadamente a cada 5 min durante todo o curso da perseguição. Alternativamente, a suspensão de células de leveduras podem ser mantidos num banho de água agitando continuamente durante o período da experiência cicloheximida perseguição.
  6. Quando todas as amostras terem sido recolhidas, as células recolhidas pelete por centrifugação a 6500 xg à temperatura ambiente durante 30 seg. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. As células estão agora prontos para lise alcalina. Alternativamente, snap-congelar as células peletizadas em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.

3. Pós-alcalina extração de proteínas (Modificado de 16,40)

  1. Adicionar 100 ul de água destilada a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex.
  2. Adicionar 100 uL de NaOH 0,2 M a cada amostra. Misturar por pipetagem cima e para baixo ou vórtex.
  3. Incubar as células em suspensão, à temperatura ambiente durante 5 min. Nesta fase, as células de levedura não foram lisadas e as proteínas não tenham sido introduzidos 40.
  4. células de pelotas por centrifugação a 18.000 xg no temperamento quartotura durante 30 segundos. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
  5. Para lisar as células, adicionar 100 ul de tampão de amostra de Laemmli a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex.
    NOTA: incubação sequencial de células com proteínas de NaOH e tampão de amostra Laemmli liberta de uma forma compatível com dodecilsulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina.
  6. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas totalmente.
    NOTA: A incubação a 95 ° C pode não ser adequado para análise de proteínas que são propensos a agregação (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares). Estas proteínas podem tornar-se insolúvel quando incubada a temperaturas elevadas 41. Assim, para a análise de tais proteínas, lisados ​​devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 minutos, tal como determinado empiricamente.
  7. lisados ​​centrifugar a 18.000 xg à room temperatura durante 1 min para sedimentar o material insolúvel. O sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está pronta para a separação por SDS-PAGE e subsequente análise de Western blot. Alternativamente, armazenar os lisados ​​a -20 ° C.

4. Representante SDS-PAGE e Western Blotting Procedimento (Adaptado de 16)

  1. Carga de proteína padrões de peso molecular e de volume determinada empiricamente de lisados ​​num gel de SDS-PAGE.
    NOTA: Escolha a percentagem de acrilamida e bis-acrilamida no gel de SDS-PAGE com base no peso molecular da proteína de interesse. Em geral, os géis percentuais mais baixos são mais adequados para a resolução de proteínas de maior peso molecular.
  2. Executar gel a 200 V até a frente do corante atingiu a borda inferior do gel.
  3. Transferir as proteínas do gel para fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C.
  4. Bloquear membrana por incubação em tampão Tris-salino tamponado (TBS) contendo 5% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 ° C durante a noite.
    NOTA: Para evitar o crescimento microbiano na presença de uma membrana é incubada durante a noite, recomenda-se a incluir azida de sódio na solução de bloqueio numa concentração final de 0,02%.
  5. Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) e 1% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  7. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
    NOTA: Os fluoróforos são sensíveis à luz. Portanto, as diluições de anticorpos conjugados com fluoróforos deve ser preparado no escuro, e a incubação de membranas na presença de anticorpos conjugados com fluoróforos e os passos de lavagem subsequentes devem ocorrer em prova de luz (por exemplo, embrulhado em papel alumínio) containers.
  8. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  9. membrana imagem usando LI-COR Odyssey CLx e software de imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), seguindo as recomendações do fabricante.
  10. Após a aquisição de imagem de membrana, a membrana incubar com um anticorpo primário específico para uma proteína de controlo de carga em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
  11. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  12. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
  13. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  14. membrana imagem como no passo 4.9.

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Resultados

Para ilustrar cicloheximida metodologia perseguição, a estabilidade de Deg1 -Sec62 (Figura 1), uma degradação -associated (ERAD) substrato modelo de levedura retículo endoplasmático (ER), foi analisada 42-44. Em ERAD, de controlo de qualidade enzimas ubiquitina ligase covalentemente atribuem cadeias da pequena proteína de ubiquitina para as proteínas aberrantes localizadas à membrana do RE. Tais proteínas polyubiquitylated são subsequentemente removid...

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Discussão

Neste trabalho, um método para a análise cinética de degradação da proteína é apresentada. Esta técnica pode ser facilmente aplicado a uma variedade de proteínas degradadas por uma variedade de mecanismos. É importante notar que os ensaios de ciclo-heximida chase informar sobre a cinética de degradação de piscina de estado estacionário de uma dada proteína. Outras técnicas podem ser usadas para analisar a cinética de degradação de populações específicas de proteínas. Por exemplo, o destino de degradação de polipeptídeos...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos atuais e ex-membros do laboratório Rubenstein por fornecer um ambiente de pesquisa de apoio e entusiasmo. Os autores agradecem a Mark Hochstrasser (Universidade de Yale) por compartilhar reagentes e conhecimentos. A E.M.R. agradece a Stefan Kreft (Universidade de Konstanz) e Jennifer Bruns (Universidade de Pittsburgh) por compartilharem conhecimentos inestimáveis em análise cinética de proteínas. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (R15 GM111713) para EMR, um prêmio de pesquisa ASPiRE da Ball State University para EMR, um prêmio de pesquisa do capítulo Sigma Xi da Ball State University para SME e fundos do Gabinete do Reitor e do Departamento de Biologia da Ball State University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cepas de levedura desejadas, plasmídeos, meio padrão e componentes
Tubos de vidro borossilicato descartáveisFisher Scientific14-961-32Disponível em uma variedade de fabricantes
Incubadora com temperatura regulada (por exemplo Incubadora Heratherm Modelo IMH180)Dot Scientific51028068Disponível em uma variedade de fabricantes
Tambor Intercambiável New Brunswick para tubos de 18 mm (rolo de tubo)New BrunswickM1053-0450Um rolo de tubo é recomendado para manter culturas de iniciação de células de levedura em suspensão durante a noite. Alternativamente, se um rolo tubular não estiver disponível, um agitador de plataforma em uma incubadora com temperatura controlada pode ser usado para culturas iniciais durante a noite. Um agitador de plataforma ou rolo tubular pode ser usado para manter culturas maiores em suspensão.
Novo Tambor de Rolo Brunswick TC-7 120 V 50/60 HNovo BrunswickM1053-4004Para uso com rolo de tubo
Espectrofotômetro SmartSpec PlusBio-Rad170-2525Disponível de uma variedade de fabricantes
Centrífuga 5430Eppendorf5427 000.216 O rotor que é vendido com unidade comporta tubos de microcentrífuga de 1,5 e 2,0 ml. O rotor pode ser trocado por um que contenha tubos cônicos de 15 e 50 ml
Rotor de ângulo fixo F-35-6-30 com tampa e adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, tubos cônicos de 15/50 ml, 6 lugaresEppendorfF-35-6-30
Tubo de tampa de rosca impresso em tela de 15 ml 17 x 20 mm cônico, polipropilenoSarstedt62.554.205Disponível em uma variedade de fabricantes
Tubo flexível de 1,5 ml, Tubos de microcentrífuga naturais e limpos por PCREppendorf22364120Disponível em uma variedade de fabricantes
Aquecedores analógicos Dri-BathFisher Scientific1172011AQRecomenda-se que dois aquecedores estejam disponíveis (um para incubar células durante o tratamento com cicloheximida e outro para ferver lisados para desnaturar proteínas). Alternativamente, 30 > C banho-maria pode ser usado para incubação de células na presença de cicloheximida. O banho-maria fervente com placa quente pode ser usado alternadamente para desnaturar proteínas.
Bloco de aquecimento para tubos cônicos de 12 x 15 mlFisher Scientific11-473-70Para uso com o aquecedor Dri-Bath durante a incubação de células na presença de cicloheximida.
Bloco de aquecimento para 20 tubos cônicos de 1,5 mlFisher Scientific11-718-9QPara uso com o Aquecedor Dri-Bath para ferver lisados para desnaturação de proteínas.
Aparelhos de corrida e transferência SDS-PAGE, fontes de alimentação e equipamentos de imagem ou câmaras escuras para SDS-PAGE e transferência para membranaIrá variar de acordo com o laboratório e a aplicação
Sistema de imagem Western blot (e.g. scanner Li-Cor Odyssey CLx e Image Studio Software)Li-Cor9140-01Irá variar de acordo com o laboratório e a aplicação
EMD Millipore Immobilon PVDF Membranas de TransferênciaFisher ScientificIPFL00010Variará de acordo com o laboratório e a aplicação
Anticorpos primários (por exemplo Fosfoglicerato Quinase (Pgk1) Anticorpo monoclonal, camundongo (clone 22C5D8))LifeTechnologies459250Variará de acordo com o laboratório e a aplicação
Anticorpos secundários (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))LifeTechnologiesA-21065Variará de acordo com o laboratório e a aplicação
tampão

Referências

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