A abundância de proteínas reflete as taxas de síntese e degradação de proteínas. Este artigo descreve o uso de perseguição de cicloheximida seguida de western blotting para analisar a degradação de proteínas no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento).
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Artigo de método
Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em
Neste artigo
Resumo
Resumo
Regulamento da abundância de proteína é crucial para praticamente todos os processos celulares. abundância proteína reflecte a integração das taxas de síntese de proteínas e a degradação da proteína. Muitos ensaios de relatórios sobre a abundância de proteínas (por exemplo, em tempo único ponto de transferência de Western, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, ou os ensaios reporter baseados em crescimento) não permitem discriminação dos efeitos relativos de tradução e proteólise nos níveis de proteína. Este artigo descreve a utilização de ciclo-heximida perseguição seguido de western blotting para analisar a degradação de proteínas especificamente no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de germinação). Neste procedimento, as células de levedura são incubadas na presença do inibidor de ciclo-heximida translacional. Alíquotas de células são recolhidas e imediatamente depois em pontos de tempo específicos seguintes adição de ciclo-heximida. As células são lisadas e os lisados são separados por electroforese em gel de poliacrilamida for análise de Western blot de proteínas de abundância em cada ponto de tempo. O procedimento de ciclo-heximida perseguição permite a visualização da cinética de degradação da população do estado estacionário de uma variedade de proteínas celulares. O procedimento pode ser utilizado para investigar os requisitos para genéticos e influências ambientais sobre a degradação da proteína.
Introdução
Proteínas executar funções cruciais em praticamente todos os processos celulares. Muitos processos fisiológicos requerem a presença de uma proteína específica (ou proteínas) por um período de tempo definido, ou sob circunstâncias particulares. Organismos, portanto, monitorar e regular a abundância de proteína para atender às necessidades celulares 1. Por exemplo, as ciclinas (proteínas que controlam a divisão celular) estão presentes em fases específicas do ciclo celular, e a perda dos níveis de ciclina regulamentados tem sido associada com a formação do tumor maligno 2. Além de regular os níveis de proteína para satisfazer as necessidades celul....
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Protocolo
1. Crescimento e colheita de células de levedura
- Se não análise cinética de degradação de uma proteína de levedura endógena, transformar a estirpe (s) desejado levedura com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse. Métodos fiáveis para a transformação de leveduras foram previamente descrito 37.
- Inocular levedura em 5 ml de meio apropriado (por exemplo, definida SD) meio selectivo sintético (para manutenção de plasmídeo de células transformadas, ou de meio de levedura não selectivo-extracto de peptona-dextrose (YPD) para células não transformadas). Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
NOTA: 30 ° C é....
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Resultados
Para ilustrar cicloheximida metodologia perseguição, a estabilidade de Deg1 -Sec62 (Figura 1), uma degradação -associated (ERAD) substrato modelo de levedura retículo endoplasmático (ER), foi analisada 42-44. Em ERAD, de controlo de qualidade enzimas ubiquitina ligase covalentemente atribuem cadeias da pequena proteína de ubiquitina para as proteínas aberrantes localizadas à membrana do RE. Tais proteínas polyubiquitylated são subsequentemente removid.......
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Discussão
Neste trabalho, um método para a análise cinética de degradação da proteína é apresentada. Esta técnica pode ser facilmente aplicado a uma variedade de proteínas degradadas por uma variedade de mecanismos. É importante notar que os ensaios de ciclo-heximida chase informar sobre a cinética de degradação de piscina de estado estacionário de uma dada proteína. Outras técnicas podem ser usadas para analisar a cinética de degradação de populações específicas de proteínas. Por exemplo, o destino de degradação de polipeptídeos.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos atuais e ex-membros do laboratório Rubenstein por fornecer um ambiente de pesquisa de apoio e entusiasmo. Os autores agradecem a Mark Hochstrasser (Universidade de Yale) por compartilhar reagentes e conhecimentos. A E.M.R. agradece a Stefan Kreft (Universidade de Konstanz) e Jennifer Bruns (Universidade de Pittsburgh) por compartilharem conhecimentos inestimáveis em análise cinética de proteínas. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (R15 GM111713) para EMR, um prêmio de pesquisa ASPiRE da Ball State University para EMR, um prêmio de pesquisa do capítulo Sigma Xi da Ball State University para SME e fundos do ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cepas de levedura desejadas, plasmídeos, meio padrão e componentes | |||
| Tubos de vidro borossilicato descartáveis | Fisher Scientific | 14-961-32 | Disponível em uma variedade de fabricantes |
| Incubadora com temperatura regulada (por exemplo Incubadora Heratherm Modelo IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Disponível em uma variedade de fabricantes |
| Tambor Intercambiável New Brunswick para tubos de 18 mm (rolo de tubo) | New Brunswick | M1053-0450 | Um rolo de tubo é recomendado para manter culturas de iniciação de células de levedura em suspensão durante a noite. Alternativamente, se um rolo tubular não estiver disponível, um agitador de plataforma em uma incubadora com temperatura controlada pode ser usado para culturas iniciais durante a noite. Um agitador de plataforma ou rolo tubular pode ser usado para manter culturas maiores em suspensão. |
| Novo Tambor de Rolo Brunswick TC-7 120 V 50/60 H | Novo Brunswick | M1053-4004 | Para uso com rolo de tubo |
| Espectrofotômetro SmartSpec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | Disponível de uma variedade de fabricantes |
| Centrífuga 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | O rotor que é vendido com unidade comporta tubos de microcentrífuga de 1,5 e 2,0 ml. O rotor pode ser trocado por um que contenha tubos cônicos de 15 e 50 ml |
| Rotor de ângulo fixo F-35-6-30 com tampa e adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, tubos cônicos de 15/50 ml, 6 lugares | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| Tubo de tampa de rosca impresso em tela de 15 ml 17 x 20 mm cônico, polipropileno | Sarstedt | 62.554.205 | Disponível em uma variedade de fabricantes |
| Tubo flexível de 1,5 ml, Tubos de microcentrífuga naturais e limpos por PCR | Eppendorf | 22364120 | Disponível em uma variedade de fabricantes |
| Aquecedores analógicos Dri-Bath | Fisher Scientific | 1172011AQ | Recomenda-se que dois aquecedores estejam disponíveis (um para incubar células durante o tratamento com cicloheximida e outro para ferver lisados para desnaturar proteínas). Alternativamente, 30 > C banho-maria pode ser usado para incubação de células na presença de cicloheximida. O banho-maria fervente com placa quente pode ser usado alternadamente para desnaturar proteínas. |
| Bloco de aquecimento para tubos cônicos de 12 x 15 ml | Fisher Scientific | 11-473-70 | Para uso com o aquecedor Dri-Bath durante a incubação de células na presença de cicloheximida. |
| Bloco de aquecimento para 20 tubos cônicos de 1,5 ml | Fisher Scientific | 11-718-9Q | Para uso com o Aquecedor Dri-Bath para ferver lisados para desnaturação de proteínas. |
| Aparelhos de corrida e transferência SDS-PAGE, fontes de alimentação e equipamentos de imagem ou câmaras escuras para SDS-PAGE e transferência para membrana | Irá variar de acordo com o laboratório e a aplicação | ||
| Sistema de imagem Western blot (e.g. scanner Li-Cor Odyssey CLx e Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Irá variar de acordo com o laboratório e a aplicação |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Membranas de Transferência | Fisher Scientific | IPFL00010 | Variará de acordo com o laboratório e a aplicação |
| Anticorpos primários (por exemplo Fosfoglicerato Quinase (Pgk1) Anticorpo monoclonal, camundongo (clone 22C5D8))Life | Technologies | 459250 | Variará de acordo com o laboratório e a aplicação |
| Anticorpos secundários (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life | Technologies | A-21065 | Variará de acordo com o laboratório e a aplicação |
Referências
- Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
- Amm, I., Sommer, T.,....
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Reimpressões e permissões
