Abstract
Reglering av protein överflöd är avgörande för praktiskt taget varje cellulär process. Protein överflöd återspeglar integrationen av andelen proteinsyntes och proteinnedbrytning. Många analyser rapportering om protein överflöd (t.ex. en enda tidpunkt western blotting, flödescytometri, fluorescensmikroskopi eller tillväxtbaserad reporteranalyser) tillåter inte diskriminering av de relativa effekterna av översättning och proteolys på proteinnivåer. I den här artikeln beskrivs användning av cykloheximid jaga följt av western blotting för att särskilt analysera proteinnedbrytning i modellen encelliga eukaryota, Saccharomyces cerevisiae (knoppande jäst). I detta förfarande är jästceller odlades i närvaro av translationell inhibitor cykloheximid den. Portioner av celler samlas omedelbart efter och vid specifika tidpunkter efter tillsats av cykloheximid. Cellerna lyseras, och lysaten separeras genom polyakrylamidgelelektrofores for western blot-analys av protein överflöd vid varje tidpunkt. Den cykloheximid chase förfarande medger visualisering av nedbrytningskinetiken av det stationära tillståndet population av en mängd olika cellulära proteiner. Förfarandet kan användas för att undersöka genetiska kraven för och miljöpåverkan på proteinnedbrytning.
Introduction
Proteiner utför viktiga funktioner i praktiskt taget varje cellulär process. Många fysiologiska processer kräver närvaro av ett specifikt protein (eller proteiner) för en bestämd tid eller under särskilda omständigheter. Organismer därför övervaka och reglera protein överflöd att möta cellulära behov 1. Till exempel, cykliner (proteiner som styr celldelningen) är närvarande vid specifika faser av cellcykeln, och förlusten av reglerade cyklin nivåer har associerats med malign tumörbildning två. Förutom att reglera proteinnivåer för att möta cellulära behov, celler använder nedbrytande mekanismer för kvalitetskontroll för att eliminera felveckade, lösa eller på annat sätt avvikande proteinmolekyler 3. Kontroll av protein överflöd innebär reglering av både makromolekylära syntes (transkription och translation) och nedbrytning (RNA förfall och proteolys). Nedsatt eller överdriven proteinnedbrytning bidrar till flera patologier, Inklusive cancer, cystisk fibros, neurodegenerativa tillstånd, och kardiovaskulära rubbningar 4-8. Proteolytiska mekanismer utgör därför lovande terapeutiska mål för en rad sjukdomar 9-12.
Analys av proteiner vid en enda tidpunkt (t.ex. genom western blot 13, flödescytometri 14, eller fluorescensmikroskopi 15) ger en ögonblicksbild av steady state protein överflöd utan att avslöja de relativa bidragen från syntes eller nedbrytning. På samma sätt, tillväxtbaserade reporter analyser reflekterar steady state proteinnivåer under en längre tidsperiod utan att diskriminera mellan påverkan av syntes och nedbrytning 15-20. Det är möjligt att sluta sig till bidrag nedbrytande processer till steady state proteinnivåer genom att jämföra överflöd före och efter att hämma vissa komponenter i den nedbrytande mekanismen (t.ex. genom farmakologiskt inaktivera proteasome 21 eller slå ut en gen som hypotes att krävas för nedbrytning 13). En förändring i steady state proteinnivåer efter att hämma nedbrytande vägar ger starka bevis för bidraget från proteolys kontroll av protein överflöd 13. Men en sådan analys fortfarande inte ge information om kinetiken för proteinomsättningen. Cykloheximid jaga följt av western blotting övervinner dessa brister genom att tillåta forskare att visualisera proteinnedbrytning över tiden 22-24. Vidare, eftersom proteindetektion efter cykloheximid chase utförs typiskt genom western blotting, radioaktiva isotoper och omständliga immunfällningssteg krävs inte för cykloheximid chase, till skillnad från många vanligen använda puls chase tekniker, som också utförs för att visualisera proteinnedbrytning 25.
Cykloheximid identifierades först som en förening med anti-svamp korrektband som produceras av grampositiva bakterien Streptomyces grisens 26,27. Det är en cell genomträngligt molekyl som specifikt hämmar eukaryot cytosoliskt (men inte organeller) översättning genom att försämra ribosomal translokation 28-31. I en cykloheximid chase experiment är cykloheximid sattes till celler, och alikvoter av celler uppsamlas omedelbart och vid specifika tidpunkter efter tillsats av föreningen 22. Cellerna lyseras, och protein överflöd vid varje tidpunkt analyseras, typiskt genom western blöt. Minskningar i protein överflöd efter tillsats av cykloheximid kan tryggt hänföras till proteinnedbrytning. Ett instabilt protein kommer att minska i överflöd över tiden, medan en relativt stabilt protein kommer att uppvisa liten förändring i överflöd.
Mekanismer för selektiv proteinnedbrytning har starkt konserverade hela Eukarya. Mycket av vad som är känt om proteinnedbrytning först lärt sig imodellen encelliga eukaryot, Saccharomyces cerevisiae (knoppande jäst) 25,32-36. Studier med jäst kommer sannolikt att fortsätta att ge nya och viktiga insikter i proteinnedbrytning. En metod för cykloheximid chase i jästceller, följt av western blot-analys av protein överflöd presenteras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillväxt och Skörd av jästceller
- Om inte analysera nedbrytningskinetiken av ett endogent jästprotein, omvandla önskad jäststam (er) med en plasmid som kodar för proteinet av intresse. Tillförlitliga metoder för jästtransformation har tidigare beskrivits 37.
- Inokulera jäst i 5 ml lämpligt medium (t.ex. selektiv syntetisk definierad SD) medium (för plasmid underhåll av transformerade celler eller icke-selektiv jästextrakt-pepton-dextros (YPD) -medium för icke-transformerade celler). Inkubera över natten vid 30 ° C, att rotera.
OBS: 30 ° C är den optimala tillväxttemperaturen för typiska vildtyp laboratoriejäststammar 38. Men eftersom vissa mutanta jäststammar inte växer optimalt vid 30 ° C och vissa proteiner undergår temperaturberoende nedbrytning, de temperaturer som används för jästcelltillväxt och cykloheximid chase bör bestämmas empiriskt 39. - mäta the optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) hos varje odling över natten.
OBS: Celler kan vara i logaritmisk eller stationär tillväxtfas men bör minimalt ha nått en densitet som kommer att tillåta spädning till en OD 600 = 0,2 i 15 ml färskt medium. - Späd övernattskulturer till ett OD 600-värde av 0,2 i 15 ml färskt medium.
- Inkubera jäst vid 30 ° C, skakning tills cellerna når mitten av logaritmisk tillväxtfas (dvs en OD 600 mellan 0,8 och 1,2).
- Under jästcelltillväxt, utföra följande i förberedelse för cykloheximid chase förfarande:
- Ställa ett värmeblock som kan rymma 15 ml koniska rör till 30 ° C för inkubering av celler i närvaro av cykloheximid. Tillsätt vatten till brunnarna i värmeblocket för att medge effektiv värmefördelning till kulturer. Tillsätt vatten till varje brunn, så att en 15 ml koniskt rör kommer att orsaka vattennivån att stiga till, men inte svämma över, läppen av väl.
- Ställa en andra värmeblock som kan rymma 1,5 ml mikrocentrifugrör till 95 ° C för proteindenaturering efter cell-lys.
- Pre-warm färskt tillväxtmedium (1,1 ml per tidpunkt per kultur som skall analyseras) och 30 ° C.
- Tillsätt 50 l 20x Stop Mix till pre-märkt mikrocentrifugrör (ett rör per tidpunkt per kultur som skall analyseras). Placera rören på is.
VARNING: Natriumazid, en ingrediens i 20x Stop Mix, är giftigt via oralt intag eller hudkontakt. Följ tillverkarens rekommendationer vid beredning, lagring och hantering av natriumazid. I händelse av oavsiktlig exponering, konsultera säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkaren.
- När cellerna har nått mitten av logaritmisk tillväxt, samla 2,5 OD 600 enheter av varje kultur per tidpunkt som skall analyseras (t.ex. 7,5 OD 600 enheter för att analysera protein överflöd vid tre tidpunkter). Centrifugera samlas cellerna i 15 ml koniska rör på 3,000 xg vid rumstemperatur under 2 min.
OBS: En OD 600 enhet är lika med den mängd jäst som föreligger i en ml odling vid en OD 600 av 1,0. Volymen av kulturen (i ml) som krävs för att skörda X OD 600 enheter (V) kan bestämmas med hjälp av följande ekvation: V = X OD 600 enheter / Uppmätt OD 600. Till exempel, att skörda 7,5 OD 600 enheter av jästcellkultur vid en OD 600 på 1,0, samla 7,5 OD 600 enheter / 1,0 = 7,5 ml jästkultur. - Resuspendera varje cellpelleten i 1 ml av 30 ° C (förvärmd) färskt tillväxtmedium per 2,5 OD 600 enheter av celler (t.ex., 3 ml för 7,5 OD 600 enheter).
2. Cykloheximid Chase
- Jämvikta jäst cellsuspensioner genom inkubation under 5 min i 30 ° C värmeblock.
- Förbered en timer för att räkna upp från 00:00.
- För att börja cykloheximid jaga, tryck på "Start" på timern. Snabbt,men noggrant genom att utföra följande steg:
- Lägg cykloheximid till en slutlig koncentration av 250 | j, g / ml till den första jästcellsuspension (t.ex., tillsätt 37,5 | il av 20 mg / ml cykloheximid lager till 3 ml cellsuspension), och kort virvel för att blanda.
VARNING: cykloheximid är en hudirriterande och är giftigt via oralt intag. Följ tillverkarens rekommendationer vid beredning, lagring och hantering av cykloheximid. I händelse av oavsiktlig exponering, konsultera säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkaren. - Omedelbart efter tillsats av cykloheximid och virvling, överföra 950 | j, l (~ 2,4 OD 600 enheter) av jästcellsuspension med tillsatt cykloheximid till en i förväg märkt mikrocentrifugrör innehållande 50 | j, l iskall 20x stop mix. Vortex mikrocentrifugrör och placera på is tills alla prover har samlats in.
- Returnera jästcellsuspension till 30 ° C.
- Lägg cykloheximid till en slutlig koncentration av 250 | j, g / ml till den första jästcellsuspension (t.ex., tillsätt 37,5 | il av 20 mg / ml cykloheximid lager till 3 ml cellsuspension), och kort virvel för att blanda.
- Upprepa steg 2.3.1 till 2,30,3 för var och en av de kvarvarande jäst cellsuspensioner vid regelbundna tidsintervall (t.ex. var 30 sekund, så att cykloheximid tillsätts till prov nr 1 vid 00:00, prov # 2 vid 00:30, prov # 3 vid 01:00 etc.).
- Vid varje efterföljande tidpunkt, virvel jäst cellsuspensioner och överförings 950 mikroliter till märkta mikrocentrifugrör innehållande 50 ul pre-kyld 20x Stop Mix. Vortexa och placera uppsamlades cellerna på is. Återvända 15 ml koniska rör till 30 ° C värmeblock.
- Till exempel, för uppsamling av celler 30 min efter cykloheximid tillsats (under antagande av 30-sek intervall mellan cykloheximid förutom jäst cellsuspensioner vid början av tidsförloppet), virvel och avlägsna 950 pl av cellsuspensionen från prov nr 1 vid 30:00 . Upprepa för Prov nr 2 vid 30:30, och så vidare.
OBS: För att förhindra sedimentering av jäst, virvel cellsuspensioner i 15 ml koniska rör ungefär var 5 min under hela jakten. Alternativt jästcellsuspensions kan bibehållas i en kontinuerligt agitera vattenbad under varaktigheten av cykloheximid chase experiment.
- Till exempel, för uppsamling av celler 30 min efter cykloheximid tillsats (under antagande av 30-sek intervall mellan cykloheximid förutom jäst cellsuspensioner vid början av tidsförloppet), virvel och avlägsna 950 pl av cellsuspensionen från prov nr 1 vid 30:00 . Upprepa för Prov nr 2 vid 30:30, och så vidare.
- När har samlats in alla prover, samlas pellet celler genom centrifugering vid 6500 x g vid rumstemperatur under 30 sek. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration. Cellerna är nu redo för alkalisk lys. Alternativt snap-frysa pellet celler i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
3. Post-alkaliskt Protein Extraction (Ändrad från 16,40)
- Tillsätt 100 | il destillerat vatten till varje cellpellet. Resuspendera genom att pipettera upp och ned eller vortexa.
- Tillsätt 100 pl av 0,2 M NaOH till varje prov. Blanda genom att pipettera upp och ner eller virvling.
- Inkubera suspenderade cellerna vid rumstemperatur under 5 min. I detta skede har jästceller inte lyserats, och proteiner har inte släppts 40.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 18.000 xg vid rums- humörratur under 30 sek. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration.
- Att lysera celler, tillsätt 100 pl Laemmli-provbuffert till varje cellpellet. Resuspendera genom att pipettera upp och ned eller vortexa.
OBS: Sekventiell inkubation av celler med NaOH och Laemmli frigör provbuffert proteiner i en form som är kompatibel med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) med användning av en Tris-glycin löpande buffertsystem. - Inkubera vid 95 ° C under 5 minuter för att helt denaturera proteiner.
OBS: Inkubation vid 95 ° C får inte vara lämplig för analys av proteiner som är benägna att aggregering (t.ex. proteiner med flera transmembransegment). Dessa proteiner kan bli olösligt vid inkubation vid förhöjda temperaturer 41. Således, för analys av sådana proteiner, lysat bör inkuberas vid lägre temperaturer (t.ex. 37 ° C - 70 ° C) under 10 - 30 min, som bestäms empiriskt. - Centrifugera lysat på 18.000 xg vid roabout temperatur under 1 min för att pelletera olösligt material. Supernatanten (solubiliseras extraherat protein) är klar för separation genom SDS-PAGE och efterföljande Western blot-analys. Alternativt, lagra lysat vid -20 ° C.
4. Representativa SDS-PAGE och Western blotting (Anpassad från 16)
- Belastning proteinmolekylviktsstandarder och empiriskt bestämd volym av lysat på en SDS-PAGE-gel.
OBS: Välj den procentuella andelen av akrylamid och bis-akrylamid i SDS-PAGE-gel baserad på molekylvikten för proteinet av intresse. I allmänhet lägre procent geler är bättre lämpade för att lösa med högre molekylvikt proteiner. - Kör gelén vid 200 V tills färgfronten har nått den nedre kanten av gelén.
- Överföra proteiner från gelén till polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran genom våt överföring vid 20 V under 60 till 90 min vid 4 ° C.
- Blockera membran genom inkubering i Tris-buffrad saltlösning (TBS) innehållande 5% skummjölk, gungande, vid rumstemperatur under 1 h eller vid 4 ° C över natten.
OBS: För att förhindra mikrobiell tillväxt i närvaro av ett membran inkuberades över natten, är det rekommenderat att innefatta natriumazid i blockeringslösningen vid en slutlig koncentration av 0,02%. - Inkubera membranet med primär antikropp som är specifik för proteinet av intresse i TBS med 0,1% Tween-20 (TBS / T) och 1% skummjölk, gungande, vid rumstemperatur under en timme.
- Tvätta membran vid rumstemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gunga.
- Inkubera membran med lämplig fluorofor-konjugerad sekundär antikropp i TBS / T med 1% skummjölk vid rumstemperatur under 1 h, gunga.
OBS: fluoroforer ljuskänsliga. Därför bör spädningar av antikroppar konjugerade till fluoroforer framställas i mörker, och inkubation av membran i närvaro av antikroppar konjugerade med fluoroforer och efterföljande tvättsteg skulle inträffa i ljustäta (t.ex. folie-lindade) containers. - Tvätta membran vid rumstemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gunga.
- Bild membran med hjälp av LI-COR Odyssey CLX och bild Studio (eller jämförbar bildutrustning och programvara), enligt tillverkarens rekommendationer.
- Efter att ha förvärvat membran bild, inkubera membranet med en primär antikropp som är specifik för en laddningskontrollprotein i TBS / T med 1% skummjölk vid rumstemperatur under 1 h, gunga.
- Tvätta membran vid rumstemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gunga.
- Inkubera membran med lämplig fluorofor-konjugerad sekundär antikropp i TBS / T med 1% skummjölk vid rumstemperatur under 1 h, gunga.
- Tvätta membran vid rumstemperatur 3 x 5 min med TBS / T, gunga.
- Bild membran som i steg 4,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera cykloheximid chase metodik, var stabiliteten hos Deg1 -Sec62 (figur 1), en modell jäst endoplasmatiska retiklet (ER) substrat -associated nedbrytning (ERAD) analyserade 42-44. I ERAD, kvalitetskontroll ubiquitin ligas enzymer kovalent fästa kedjor av litet protein ubiquitin till avvikande proteiner lokaliserade till ER-membranet. Sådana polyubiquitylated proteiner avlägsnas därefter från ER och bryts ned av proteasomen, en stor, cytosoliskt proteas 45. Den Deg1 -Sec62 proteinet är riktad till nedbrytning efter det ihärdigt och avvikande ingrepp med translocon, en kanal som underlättar proteintranslokation in i ER lumen eller membran 43. På samma sätt, däggdjur apolipoprotein B, en proteinkomponent av low-density lipoprotein, griper ständigt ER translocon och därefter genomgår nedbrytning av en relaterad mekanism när dess läppid bindningspartner är frånvarande 46-48. Således, analyser av Deg1 -Sec62 nedbrytning i jästceller kan ge insikt i nedbrytningen av proteiner som envist eller onormalt i ingrepp med translocon, provisoriskt benämnd ERAD-T (för translocon-associerade) substrat 43.
Tidigare studier har visat att ER-bosatt ubiquitin ligas Hrd1 funktioner med ubiquitin-konjugerande enzym Ubc7 att katalysera nedbrytning av Deg1 -Sec62 16,42-44. Transmembranproteinet Cue1 förankrar Ubc7 till ER-membranet och aktiverar enzymet 49-51. Emellertid ett krav för Cue1 i nedbrytningen av Deg1 -Sec62 har inte direkt undersökt. För att testa hypotesen att Cue1, liksom Hrd1 och Ubc7, krävs för effektiv nedbrytning av Deg1 -Sec62 ades vildtyp och mutanta jästceller som uttrycker Deg1 -Sec62 kastades cykloheximid chase och westärna blot-analys (Figur 2A). Den Deg1 -Sec62 proteinet migrerar på SDS-PAGE som flera arter. Detta överensstämmer med tidigare studier som tyder på omfattande post-translationell modifiering av proteinet 43,44,52. I vildtyp jästceller, Deg1 -Sec62 var lätt försämras. Som tidigare observerats, förlust av antingen Hrd1 eller Ubc7 väsentligt stabiliserade Deg1 -Sec62 proteinet 42-44. Som förutspått var Deg1 -Sec62 stabiliserades i frånvaro av Cue1 (i liknande utsträckning som i frånvaro av Ubc7), vilket bekräftar en roll för Ubc7-interagerande protein i ERAD-T.
Andelen Deg1 -Sec62 protein som återstår vid varje tidpunkt kvantifierades och plottas i figur 2B. Vi noterar att den skenbara hastigheten för försvinnandet av Deg1 -Sec62 i celler av vild typ kan vara en underskattning av nedbrytningshastigheten i nascent Deg1 -Sec62(Dvs proteinets halveringstid, som kan mest direkt bestämmas genom puls chase analys 43). Eftersom vildtyp jäst aktivt försämra Deg1 -Sec62 proteinet före cykloheximid Dessutom steady state överflöd av Deg1 -Sec62 minskat kraftigt i dessa celler (jämfört med celler i vilka nedbrytning osäkra). Detta kan inses genom att jämföra överflöd av Deg1 -Sec62 vid de initiala tidpunkter för varje stam i figur 2A. Vidare, någon försämring resistent subpopulation av substratproteinet (t.ex. om proteinet ackumuleras i intracellulära pooler som nedbrytning förhindras) kan tyckas relativt stabila i vildtypceller över tidsförloppet av experimentet.
Figur 1. Modell för Nedbrytning av Deg1 -Sec62 Efter Aberrant Engagement av Translocon (A) Schematisk bild av Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 består av följande delar, i tur och ordning:.. Deg1 (de aminoterminala 67 aminosyrorna från jästen transkriptionsrepressor MATα2), en flagga (F) epitop, 2-transmembranproteinet Sec62 och två kopior av Staphylococcus aureus protein A (PRA). (B) Efter normal co-translationell införande av sina två transmembransegment i det endoplasmatiska nätverket (ER) membran, ihållande förening av Deg1 -Sec62 med translocon utlöser onormal, Deg1 -beroende, posttranslationell translocon engagemang. En del av den cytosoliska aminoänden inträder-och abnormt sannolikt förblir inom-the translocon. (C) Efter translocon engagemang, Hrd1 ubiquitin ligas ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 bistås av ubiquitin-konjugerande enzym Ubc7, som är förankrad i ER-membranet av Cue1. Ub, ubiquitin protein monomerer. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 utvinns ur ER-membranet och bryts ned av proteasomen, lindra translocon obstruktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. cykloheximid Chase följt av Western blotting Indikerar att Cue1 krävs för effektiv Deg1 -Sec62 nedbrytning. (A) Jästceller av de angivna genotyper transformerades med en jäst centromerisk plasmid kodande Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -FLAG-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) och utsattes för cykloheximid chase analys. Proteinar från varje tidpunkt (ekvivalent med 0,125 OD 600 enheter) separerades på en 8% SDS-PAGE-gel och detekterades med western blotting med kanin-anti-mus-sekundära antikroppar, som direkt binder de C-terminala protein A-epitoper av Deg1 - Sec62 fusionsprotein. Som en laddningskontroll, var membranet inkuberades därefter med antikroppar specifika för Pgk1. Detta experiment har upprepats tre gånger; representativa resultat bilden. (B) Kvantifiering av data i (A) utfördes med användning av bildbehandlingsprogram (se tabell of Materials). Den totala fluorescensintensiteten hos ett område som omfattar den Deg1 -Sec62 protein bestämdes för varje prov. Bakgrundsfluorescensintensitet för varje prov extrapolerades från den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos pixlar i närheten av den Deg1 -Sec62 proteinet. Detta extrapolerade bakgrundsfluorescensintensiteten var subtraheras från den sammanlagda fluorescensintensiteten för att ge justerade fluorescerrensintensiteten för varje prov. Liknande kvantifieringar för total, bakgrund, och justerade fluorescensintensiteter utfördes för Pgk1, en laddningskontroll protein vars överflöd varierar inte under de förhållanden som analyseras. Att jämföra det överflöd av Deg1 -Sec62 protein bland proverna, blev ett förhållande av de justerade signalintensiteterna hos Deg1 -Sec62 till Pgk1 bestämdes för varje prov. Den Deg1 -Sec62 / Pgk1 förhållande definierades som 100% för den första tidpunkten (dvs. omedelbart efter cykloheximid tillsats) för varje stam som analyseras. Mängden Deg1 -Sec62 kvar vid efterföljande tidpunkter (dvs de Deg1 -Sec62 / Pgk1 förhållanden) beräknades som en procentandel av den Deg1 -Sec62 / Pgk1 uppgick vid första tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Syntetisk Defined (SD) Minimal jäst Medium | 2% dextros, 0,67% jästkvävebas utan aminosyror, 0,002% adenin, 0,004% uracil, 0,002% arginin, 0,001% histidin, 0,006% isoleucin, 0,006% leucin, 0,004% lysin, 0,001% metionin, 0,006% fenylalanin, 0,005 % treonin, 0,004% tryptofan. För fast (platta) medium, omfattar 2% agar. | 1. Selektivt medium ställdes genom att utesluta lämpliga aminosyran (er) eller kvävehaltiga baser. |
| 2. För enkelhets skull kan dessa ingredienser bibehållas som koncentrerade stamlösningar enligt följande. Aminosyror kan bibehållas som 100x stamlösning innehållande alla önskade aminosyror. Jästkvävebas kan bibehållas i en 20x stamlösning (13,4%). Dextros kan bibehållas i ett 40% stamlösning. Adenin och uracil kan bibehållas som en% förrådslösningar i 0,1 M NaOH. | ||
| 3.Sterilisera mediet genom autoklavering. | ||
| Jästextrakt-Pepton dextros (YPD) Rich jäst Medium | 1% jästextrakt, 2% pepton, 2% dextros (tillval: 0,002% adenin). För fast (platta) medium, omfattar 2% agar. | 1. För att förhindra den långsamma tillväxten och rödfärgning kännetecknande för vissa laboratoriejäststammar i frånvaro (eller låg förekomst) adenin kan adenin tillsättas YPD odlingsmedium. |
| 2. Av lämplighetsskäl kan vissa ingredienser bibehållas som koncentrerade stamlösningar enligt följande. Dextros kan bibehållas i ett 40% stamlösning. Adenin kan bibehållas som en 1% stamlösning i 0,1 M NaOH. | ||
| 3. Sterilisera medium genom autoklavering. | ||
| 20x Stop Mix | 200 mM natriumazid, 5 mg / ml bovint serumalbumin | Natriumazid är giftigt via oralt intag eller hudkontakt. Följ tillverkarerekommendationer vid beredning, lagring och hantering av natriumazid. I händelse av oavsiktlig exponering, konsultera säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkaren. |
| 20 mg / ml cykloheximid | 1. Förbered i etanol. Förvara vid -20 ° C. | |
| 2. cykloheximid är en hudirriterande och är giftigt via oralt intag. Följ tillverkarens rekommendationer vid beredning, lagring och hantering av cykloheximid. I händelse av oavsiktlig exponering, konsultera säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkaren. | ||
| 0,2 M natriumhydroxidlösning | Förbereda i vatten. Natriumhydroxid reagerar med glas. Därför, för långtidsförvaring, 0,2 M natriumhydroxid bör bibehållas i plastbehållare. | |
| Laemmli provbuffert | 2% SDS, 10% glycerol, 5% &# 946; merkaptoetanol, 60 mM Tris HCI pH 6,8, 0,008% bromofenolblått | 1. Laemmli provbuffert är ofta framställd genom utspädning av en mer koncentrerad (t.ex. 5x) lager. |
| 2. Färgämnes bromofenolblått kan sättas till önskad intensitet. En "nypa" (mycket liten mängd tappas från kanten av en spatel) är typiskt tillräcklig. | ||
| Laemmli Running Buffer (5x) | 125 mM Tris, 960 mM glycin, 0,5% SDS | För att framställa en liter 1x Laemmli Running Buffer, späd 1: 5 i dH 2 O. |
| Tris Acetat-SDS Transfer Buffer (5x) | 125 mM Tris-acetat (pH 8,8), 960 mM glycin, 0,05% SDS | För att framställa 20 L av 1x Tris Acetat-SDS överföringsbuffert, kombinera 4 L av 5x lager, 4 liter metanol, och 12 L av dH 2 O. |
| 10x Tris-buffrad saltlösning (TBS) | 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH justerat till 7,5 | För att framställa ett L av 1x TBS, utspädd 1:10 i dH2O 1x TBS kan kompletteras med detergenten Tween-20 och pulveriserad skummjölk, som är lämpligt. |
Tabell 1. lösningar som används i denna studie.
| stam Namn | Alias | relevant Genotyp | referenser |
| VJY42 | MHY501 | MATa | Chen et al., 1993 |
| his3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| VJY47 | YWO55; MHY507 | MATa | Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al., 2012 |
| his3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| ubc7Δ :: LEU2 | |||
| VJY56 | YTX105; MHY1364 | MATa | Biederer et al., 1997; Ravid et al., 2006 |
| his3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| cue1Δ :: HIS3 | |||
| VJY172 | MHY6199 | MATa | Den här studien |
| his3-Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| hrd1Δ :: kanMX4 |
Tabell 2. Jäststammar som används i denna studie. Alla stammar är kongena med MHY500 53. VJY42, VJY47 och VJY56 beskrevs tidigare 49,53,54. En detaljerad stam generation och bekräftelse strategi för VJY172 (förberedd för denna studie) finns tillgänglig på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta papper, är en metod för att analysera proteinnedbrytningskinetiken presenteras. Denna teknik kan enkelt tillämpas på en rad olika proteiner bryts ned genom en mängd olika mekanismer. Det är viktigt att notera att cykloheximid chase experiment rapportera om nedbrytningskinetiken av det stationära tillståndet pool av ett givet protein. Andra tekniker kan användas för att analysera nedbrytningskinetiken av specifika populationer av proteiner. Till exempel, kan den nedbrytande öde begynnande polypeptider spåras av puls chase analys 55. I sådana experiment, begynnande proteiner är kort pulsmärktes (t.ex. med radioaktiva aminosyror). Förändringar i överflöd av de märkta begynnande proteiner (som kanske eller kanske inte speglar förändringar i steady state protein överflöd) kan spåras över tid.
Cykloheximid chase är lämplig för analys av proteinstabilitet under en relativt kort tidsförlopp (dvs upp till två timmar). Över längre tid courses (dvs, två timmar till dagar), cykloheximid, en global hämmare av översättning, är giftigt för celler, troligen på grund av utarmning av ubiquitin 56. Vidare analyser av proteinstabilitet över längre tidsförlopp är mer sannolikt att äventyras av indirekta effekter av globalt försämras proteinsyntes på nedbrytningen av proteinet av intresse (t.ex. nedbrytning av en kortlivad protein involverat i nedbrytningen av proteinet av intressera). Andra tekniker, såsom puls chase metabolisk märkningsexperiment, är därför bättre lämpade för att studera nedbrytningen av långlivade proteiner och kan utföras för att bekräfta resultat som erhållits i cykloheximid chase experiment.
Tidpunkten för tillsats av cykloheximid och insamling av celler är en viktig faktor i detta förfarande. Precision är särskilt viktigt vid analys av mycket kortlivade proteiner, eftersom små avvikelser i den tid som förflutit från cykloheximid Addining till cell skörd kan ha en betydande inverkan på uppenbara nedbrytnings kinetik. Vidare, utan en tydlig plan för att utföra dessa tidskänsliga steg, ett experiment kan snabbt överlåta i kaos och frustration. Av denna anledning är det rekommenderat att lägga cykloheximid till kulturer med planerade, regelbundna intervall. 30-sek intervall föreslås i detta protokoll, men tidpunkten kan justeras för att matcha komforten och fingerfärdighet utredaren. Nybörjare utredare kan vara bra att skriva ett schema för provtagning gånger före initiering av försöket och att stryka varje schemalagd samling som det inträffar.
I steg 1,7 och 1,8 av det protokoll som beskrivs här, är jäst cellkulturer koncentreras till minskade volymer av odlingsmedium för att underlätta hantering under den efterföljande cykloheximid jaga förfarande. Men centrifugering av jästceller inducerar snabbt vissa cellstressreaktioner (t.ex. signalvägar somaktiveras av glukosbrist) 57,58. Utredarna därför varnade längre perioder av centrifugering. Vid analys av stabiliteten hos proteiner som kan vara känslig för centrifugering kan utredarna vill lägga cykloheximid direkt till mitten av log-fasen kulturer utan föregående centrifugering. I sådana fall bör cykloheximid tillsättas till samma slutkoncentration (250 | j, g / ml), och jästcellprover kan skördas genom metoder som inte kräver ett initialt centrifugeringssteg (t ex snabb filtrering) 57. Vidare, i steg från 2,3 till 2,5, prover som tagits vid varje tidpunkt överförs till en lösning innehållande natriumazid och placerades på is. Dessa förhållanden hämmar fortsatt proteinnedbrytning under hela jakten. Det bör noteras att azid reducerar den cellulära koncentrationen av ATP 59, därmed specifikt inhibera aktiviteten hos ATP-beroende proteaser. Medan reducerad temperatur bör enLSO minska den hastighet med vilken icke-ATP-beroende proteolytiska processer fungerar, kan utredarna studerar proteiner som skadats av sådana mekanismer alternativt välja att snap-frysa cellpellets i flytande kväve som varje prov skördas.
Ett prov protokoll för cellys och ett representativt protokoll för western blotting i detta manuskript har anpassats efter tidigare rapporter 16,40. I den post-alkalisk lysering som beskrivs här, förbättrar NaOH förbehandling extraktion av jästproteiner vid efterföljande tillsats av Laemmli provbuffert. Den mekanism genom vilken denna förbättring sker är dåligt kännetecknas 40. Emellertid är polysackarider, såsom de som finns i jästcellväggar löses i alkaliska förhållanden 60. Det är därför lockande att spekulera i att inkubation i närvaro av NaOH partiellt eller fullständigt sfäroplaster jästceller (dvs., avlägsnar cellväggskomponenter), vilket gör dem mer sensitive till den SDS detergenten är närvarande i provbufferten Laemmli. Eftersom proteiner släpps under mycket denaturerande betingelser, behöver proteashämmare inte ingå i Laemmli provbuffert. Den specifika metoden för cell-lys kan modifieras på lämpligt sätt för en given experiment. Exempelvis kan den post-alkalisk lysering inte lämpliga för låg-abundans proteiner eller proteiner som är dåligt påvisades med Western blot. I sådana fall, metoder som inkluderar en triklorättiksyra utfällningssteg att koncentrera proteinprover kan vara mest lämpliga 61. Dessutom har flera viktiga överväganden rörande val antikropp, lastning kontroll val, och alternativa metoder för upptäckt (t.ex. kemiluminescerande western blotting med hjälp av film eller digital avbildningssystem) har nyligen diskuterat 16. Kvantifiering av protein överflöd efter cykloheximid behandling kan utföras. Många bildsystem säljs med programpaket som underlättardenna analys.
Cykloheximid chase kan implementeras för att analysera nedbrytningen av en mångfald av jästproteiner och kan anpassas för att studera proteinstabilitet i andra eukaryota celler. Som beskrivs i detta protokoll är cykloheximid behandling följs av cellys och detektion av protein överflöd av Western blot-analys. Beroende på användningsområde, dock protein överflöd efter cykloheximid behandling kan bedömas genom en rad olika tekniker, som är lämpligt för forskningsmålen. Till exempel, om protein storlek är inte en relevant faktor för analys, cellysat kan utsättas för dot blot eller enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) analys, som rapporterar om protein överflöd, men inte skenbar molekylvikt 62. För proteiner på cellytan (eller intern fluorescensmärkta interna proteiner), flödescytometri kan användas för att kvantifiera protein överflöd av prover vid olika tidpunkter efter cykloheximid tillsats 51. fluorescence mikroskopi efter cykloheximid behandling skulle ge information om både protein överflöd och lokalisering 18. Utbudet av substrat, organismer och program nedströms mottagliga för cykloheximid jaga gör tekniken en mycket mångsidig och informativa sätt att studera proteinnedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
| Heating block for 12 x 15 ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
| Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
- Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
- Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
- Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A.
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
- Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
- Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
- Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
- Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
- Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
- Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
- Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
- Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
- Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
- Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
- Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
- Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
- Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
- Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
- Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
- Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
- Varshavsky, A.
- Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
- Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
- Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
- Bergman, L. W.
- Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
- Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
- Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
- Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
- Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
- Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
- Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
- Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
- Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
- Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
- Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
- Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
- Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
- Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
- Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
- Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
- Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
- Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
- Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
- Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
- Hornbeck, P. V.
