Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em Saccharomyces cerevisiae

A abundância de proteínas reflete as taxas de síntese e degradação de proteínas. Este artigo descreve o uso de perseguição de cicloheximida seguida de western blotting para analisar a degradação de proteínas no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento).

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a degradação da população em estado estacionário de uma proteína específica em Saccharomyces cerevisiae. Este método pode ser usado para determinar os requisitos genéticos e os efeitos ambientais sobre a degradação de uma proteína de interesse. A principal vantagem dessa técnica é que não são necessários isótopos radioativos e longas etapas de imunoprecipitação, ao contrário das técnicas de busca de pulso, que também são usadas para visualizar a degradação de proteínas.

Este procedimento pode ser usado para analisar uma proteína de levedura endógena ou uma proteína expressa a partir de um plasmídeo. Para este último, a cepa de levedura é transformada com um plasmídeo que codifica a proteína de interesse seguindo um protocolo padrão de transformação de levedura. Inocular a levedura em cinco mililitros de meio apropriado.

Incube durante a noite a 30 graus Celsius com rotação. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD600, de cada cultura noturna. Diluir as culturas até um OD600 de 0,2 em 15 mililitros de meio fresco.

Incubar a 30 graus Celsius com agitação até que as células atinjam a fase de crescimento logarítmico médio. Enquanto as células de levedura estão crescendo, prepare-se para o procedimento de perseguição de cicloheximida. Defina um bloco de calor que possa acomodar tubos cônicos de 15 mililitros a 30 graus Celsius para a incubação de células na presença de cicloheximida.

Para garantir uma distribuição eficiente de calor para as culturas, adicione água a cada poço do bloco de calor de modo que um tubo cônico de 15 mililitros faça com que o nível da água suba, mas não transborde, a borda do poço. Defina um segundo bloco de calor que possa acomodar tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro a 95 graus Celsius para desnaturação de proteínas após a lise celular. Pré-aqueça o meio de crescimento fresco a 30 graus Celsius.

São necessários 1,1 mililitros de meio por ponto de tempo por cultura a ser analisada. Adicione 50 microlitros de 20x Stop Mix aos tubos de microcentrífuga pré-rotulados. Prepare um tubo por ponto de tempo por cultura a ser analisada.

Coloque os tubos no gelo. Quando as células de levedura atingirem o crescimento logarítmico médio, colete 2,5 unidades OD600 de cada cultura por ponto de tempo a ser analisado. Uma unidade OD600 é igual à quantidade de levedura presente em um mililitro de cultura a um OD600 de 1,0.

Centrifugar as células recolhidas em tubos cónicos de 15 mililitros a 3 000 vezes g à temperatura ambiente durante dois minutos. Remova o sobrenadante. Ressuspenda cada pellet celular em um mililitro de meio de crescimento fresco a 30 graus Celsius por 2,5 unidades OD600 de células.

Antes de iniciar a perseguição da cicloheximida, equilibre as suspensões de células de levedura incubando no bloco de calor de 30 graus Celsius por cinco minutos. O aspecto mais difícil desse procedimento é o momento da adição de cicloheximida e a coleta de células para cada amostra. Garantimos o sucesso estabelecendo e aderindo a um cronograma para adição de cicloheximida e coleta de células.

Para iniciar a perseguição de cicloheximida, pressione Iniciar"no cronômetro. Adicione cicloheximida de forma rápida, mas cuidadosa, a uma concentração final de 250 microgramas por mililitro à primeira suspensão de células de levedura e vortex brevemente para misturar. Transfira imediatamente 950 microlitros, ou aproximadamente 2,4 unidades OD600, da suspensão de células de levedura com adição de cicloheximida para um tubo de microcentrífuga pré-rotulado contendo 50 microlitros de 20x Stop Mix gelado.

Vortex o tubo de microcentrífuga e coloque no gelo até que todas as amostras tenham sido coletadas. Comece a caça à cicloheximida, conforme demonstrado para cada uma das suspensões de células de levedura restantes, em intervalos de tempo regulares. Em cada ponto de tempo subsequente, faça um vórtice das suspensões de células de levedura e transfira 950 microlitros para tubos de microcentrífuga rotulados contendo 50 microlitros de 20x Stop Mix pré-resfriado.

Vórtice e coloque as células coletadas no gelo. Para evitar o assentamento das células de levedura, vórtice as suspensões celulares nos tubos cônicos de 15 mililitros aproximadamente a cada cinco minutos durante o curso da perseguição. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, granular as células coletadas por centrifugação a 6.500 vezes g e temperatura ambiente por 30 segundos.

Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. As células estão agora prontas para a lise alcalina. Prepare as células para a lise alcalina adicionando 100 microlitros de água destilada a cada pellet celular e ressuspenda pipetando para cima e para baixo.

Adicione 100 microlitros de hidróxido de sódio 0,2 molar a cada amostra. Misture por vórtice. Incube as células em temperatura ambiente por cinco minutos.

Nesta fase, as células de levedura não foram lisadas e as proteínas não foram liberadas. Em seguida, pulverizar as células por centrifugação a 18.000 vezes g à temperatura ambiente por 30 segundos. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.

Para lisar as células, adicione 100 microlitros de Laemmli Sample Buffer a cada pellet de célula. Ressuspenda pipetando para cima e para baixo. Incube a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar totalmente as proteínas.

Centrifugar os lisados a 18 000 vezes g e à temperatura ambiente durante um minuto para granular o material insolúvel. O sobrenadante, que é a proteína extraída solubilizada, está pronto para separação por SDS PAGE e subsequente análise de Western blot. Alternativamente, os lisados podem ser armazenados a 20 graus Celsius negativos.

A estabilidade de Deg1-Sec62, um substrato de degradação associado ao retículo endoplasmático de levedura modelo, foi analisada pela metodologia de perseguição de cicloheximida. A proteína Deg1-Sec62 migra em SDS PAGE como várias espécies e é prontamente degradada em células do tipo selvagem. Pgk1 é um controle de carregamento cuja abundância não varia nas condições analisadas.

A perda da ubiquitina ligase hrd1 residente no ER ou da enzima conjugadora de ubiquitina ubc7 estabilizou substancialmente a proteína Deg1-Sec62, o que confirma o papel previamente observado dessas proteínas na degradação de Deg1-Sec62. Cue1 é uma proteína transmembrana que ancora ubc7 à membrana do ER e ativa a enzima, mas um requisito para cue1 na degradação de Deg1-Sec62 não foi investigado diretamente. A observação deste estudo de que Deg1-Sec62 foi estabilizado na ausência de cue1, confirmou um papel para cue1 na degradação associada ao ER de Deg1-Sec62.

O resultado do Western blot foi quantificado usando um software de imagem. Para comparar a abundância da proteína Deg1-Sec62 entre as amostras, uma razão das intensidades de sinal ajustadas de Deg1-Sec62 para Pgk1 foi determinada para cada amostra. É importante lembrar que este procedimento relata mais diretamente a cinética de degradação de uma população de estado estacionário de uma proteína de interesse.

Para visualizar a degradação da população nascente de uma proteína de interesse, outras técnicas, como experimentos de perseguição de pulso, podem ser usadas. Não se esqueça de que a cicloheximida e a azida sódica são extremamente tóxicas e deve-se tomar cuidado para evitar o contato direto com esses produtos químicos durante a realização deste procedimento.