Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em
18 de abril de 2016
A abundância de proteínas reflete as taxas de síntese e degradação de proteínas. Este artigo descreve o uso de perseguição de cicloheximida seguida de western blotting para analisar a degradação de proteínas no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento).
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a degradação da população em estado estacionário de uma proteína específica em Saccharomyces cerevisiae. Este método pode ser utilizado para determinar os requisitos genéticos e os efeitos ambientais sobre a degradação de uma proteína de interesse. A principal vantagem desta técnica é que não são necessários isótopos radioativos nem etapas demoradas de imunoprecipitação, ao contrário das técnicas de pulse-chase, que também são usadas para visualizar a degradação proteica.
Este procedimento pode ser usado para analisar uma proteína endógena de levedura ou uma proteína expressa a partir de um plasmídeo. Para o último caso, a linhagem de levedura é transformada com um plasmídeo que codifica a proteína de interesse, seguindo um protocolo padrão de transformação de levedura. Inocule a levedura em cinco mililitros de meio apropriado.
Incubar durante a noite a 30 graus Celsius com rotação. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica a 600 nanômetros, ou OD600, de cada cultura de crescimento noturno. Dilua as culturas até uma OD600 de 0,2 em 15 mililitros de meio fresco.
Incubar a 30 graus Celsius com agitação até que as células atinjam a fase de crescimento logarítmico médio. Enquanto as células de levedura estiverem crescendo, prepare-se para o procedimento de chase com cicloeximida. Ajuste um bloco de aquecimento que possa acomodar tubos cónicos de 15 mililitros a 30 graus Celsius para a incubação das células na presença de cicloeximida.
Para garantir uma distribuição eficiente de calor às culturas, adicione água a cada poço do bloco térmico de modo que o nível da água atinja, mas não transborde, a borda do poço quando um tubo cônico de 15 mililitros for inserido. Ajuste um segundo bloco térmico, capaz de acomodar tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, a 95 graus Celsius para desnaturação proteica após a lise celular. Pré-aqueça o meio de crescimento fresco a 30 graus Celsius.
São necessários 1,1 mililitro de meio por ponto de tempo por cultura a ser analisada. Adicione 50 microlitros de Stop Mix 20x a tubos de microcentrífuga previamente rotulados. Prepare um tubo por ponto de tempo por cultura a ser analisada.
Coloque os tubos no gelo. Quando as células de levedura atingirem o crescimento na fase logarítmica média, colete 2,5 unidades de OD600 de cada cultura por ponto temporal a ser analisado. Uma unidade de OD600 equivale à quantidade de levedura presente em um mililitro de cultura com uma OD600 de 1,0.
Centrifugue as células coletadas em tubos cónicos de 15 mililitros a 3.000 × g, à temperatura ambiente, durante dois minutos. Remova o sobrenadante. Re-suspenda cada pellet celular em um mililitro de meio de crescimento fresco a 30 °C por 2,5 unidades de OD600 de células.
Antes de iniciar o ensaio de chased com cicloeximida, equilibre as suspensões de células de levedura incubando-as no bloco térmico a 30 graus Celsius por cinco minutos. O aspecto mais difícil deste procedimento é o cronograma da adição de cicloeximida e a coleta das células para cada amostra. Garantimos o sucesso estabelecendo e seguindo rigorosamente um cronograma para a adição de cicloeximida e a coleta das células.
Para iniciar o teste de chasede cicloeximida, pressione "Start" no cronômetro. Adicione rapidamente, mas com cuidado, cicloeximida a uma concentração final de 250 microgramas por mililitro à primeira suspensão de células de levedura e vortexe brevemente para homogeneizar. Transfira imediatamente 950 microlitros, ou aproximadamente 2,4 unidades de OD600, da suspensão de células de levedura com cicloeximida adicionada para um tubo de microcentrífuga previamente rotulado contendo 50 microlitros de Mistura Padrão 20x gelada.
Vortexe o tubo de microcentrífuga e coloque-o no gelo até que todas as amostras tenham sido coletadas. Inicie o rastreamento com cicloheximida conforme demonstrado para cada uma das suspensões restantes de células de levedura em intervalos regulares de tempo. Em cada ponto de tempo subsequente, vortexe as suspensões de células de levedura e transfira 950 microlitros para tubos de microcentrífuga identificados contendo 50 microlitros de Mistura Padrão 20x previamente resfriada.
Agite em vórtex e coloque as células coletadas no gelo. Para evitar a sedimentação das células de levedura, agite em vórtex as suspensões celulares nos tubos cónicos de 15 mililitros aproximadamente a cada cinco minutos durante todo o período de acompanhamento. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, pelletize as células coletadas por centrifugação a 6.500 × g e temperatura ambiente por 30 segundos.
Remova o sobrenatante por pipetagem ou aspiração. As células estão agora prontas para a lise alcalina. Prepare as células para a lise alcalina adicionando 100 microlitros de água destilada a cada pellet celular e re-suspendendo por pipetagem para cima e para baixo.
Adicione 100 microlitros de hidróxido de sódio 0,2 molar a cada amostra. Misture por vortexagem. Incube as células à temperatura ambiente por cinco minutos.
Nesta etapa, as células de levedura ainda não foram lisadas e as proteínas não foram liberadas. Em seguida, pelotize as células por centrifugação a 18.000 ×g, em temperatura ambiente, durante 30 segundos. Remova o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
Para lisar as células, adicione 100 microlitros de Tampão Amostral de Laemmli a cada pellet celular. Re-suspenda pipetando para cima e para baixo. Incube a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar completamente as proteínas.
Centrifugue os lisados a 18.000 × g e temperatura ambiente por um minuto para obter o pellet do material insolúvel. O sobrenadante, que corresponde à proteína extraída solubilizada, está pronto para separação por SDS-PAGE e subsequente análise por Western blot. Alternativamente, os lisados podem ser armazenados a -20 °C.
A estabilidade de Deg1-Sec62, um substrato modelo de degradação associada ao retículo endoplasmatico em levedura, foi analisada pelo método de chase com cicloeximida. A proteína Deg1-Sec62 migra em SDS-PAGE como múltiplas espécies e é prontamente degradada em células selvagens. Pgk1 é um controle de carregamento cuja abundância não varia nas condições analisadas.
A perda da ligase de ubiquitina residente no RE, hrd1, ou da enzima conjugadora de ubiquitina ubc7, estabilizou substancialmente a proteína Deg1-Sec62, o que confirma o papel previamente observado dessas proteínas na degradação de Deg1-Sec62. Cue1 é uma proteína transmembrana que ancora ubc7 à membrana do RE e ativa a enzima, mas a necessidade de cue1 na degradação de Deg1-Sec62 ainda não foi diretamente investigada. A observação deste estudo de que Deg1-Sec62 foi estabilizada na ausência de cue1 confirmou o papel de cue1 na degradação associada ao retículo endoplasmático de Deg1-Sec62.
O resultado do Western blot foi quantificado utilizando um software de imagem. Para comparar a abundância da proteína Deg1-Sec62 entre as amostras, determinou-se a razão entre as intensidades de sinal ajustadas de Deg1-Sec62 e Pgk1 para cada amostra. É importante lembrar que este procedimento relata mais diretamente a cinética de degradação de uma população em estado estacionário de uma proteína de interesse.
Para visualizar a degradação de uma população nascente de uma proteína de interesse, outras técnicas, como experimentos de pulso-afastamento, podem ser utilizadas. Não se esqueça de que cicloheximida e azida de sódio são extremamente tóxicos e precauções devem ser tomadas para evitar o contato direto com esses produtos químicos durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para visualizar a degradação de proteínas em Saccharomyces cerevisiae utilizando o método de bloqueio com cicloheximida seguido de western blot. A técnica permite aos pesquisadores analisar a degradação de proteínas específicas sem a necessidade de isótopos radioativos ou etapas demoradas de imunoprecipitação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Degradação de proteínas
- Biologia celular
- Sistemas modelo de levedura
Antecedentes
- A abundância de proteínas é influenciada pelas taxas de síntese e degradação.
- A técnica do chase com cicloeximida é um método utilizado para estudar a estabilidade de proteínas.
- O western blotting é uma técnica para detectar proteínas específicas.
- Compreender a degradação de proteínas é essencial para obter insights sobre processos celulares.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a degradação de uma proteína específica em levedura.
- Determinar os fatores genéticos e ambientais que afetam a degradação de proteínas.
- Fornecer uma alternativa mais simples às técnicas tradicionais de pulso-remendo.
Métodos Utilizados
- Uso de cicloheximida para inibir a síntese proteica.
- Western blotting para analisar os níveis de proteína ao longo do tempo.
- Transformação de levedura com plasmídeos que codificam proteínas de interesse.
- Inoculação de levedura em meio de crescimento apropriado.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da degradação proteica em levedura.
- Identificação dos requisitos genéticos para a degradação proteica.
- Avaliação dos efeitos ambientais na estabilidade proteica.
- Demonstração da eficiência do método em comparação com técnicas tradicionais.
Conclusões
- O método de chasede cicloheximida é eficaz para estudar a degradação de proteínas.
- Essa técnica simplifica a análise da estabilidade de proteínas em leveduras.
- Os achados contribuem para uma melhor compreensão da dinâmica de proteínas nas células.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A cinética de degradação de proteínas é fundamental para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. O método de acompanhamento com cicloheximida permite a avaliação quantitativa da estabilidade de proteínas em um modelo geneticamente manipulável, apoiando a verificação de hipóteses e a elucidação de vias. Essa abordagem fornece confiança preditiva para priorizar alvos e reduzir riscos em hipóteses mecanicistas antes da triagem de compostos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição das taxas de degradação de populações proteicas em estado estacionário.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da análise de perturbações genéticas e ambientais.
- Valor Preditivo: Gera dados quantitativos de cinética de degradação para orientar decisões sobre a confiança no alvo e a triagem de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Produz resultados padronizados e reprodutíveis de western blot para medições temporais da estabilidade proteica.
- Escalabilidade: Compatível com testes de múltiplas condições para avaliar os efeitos de compostos sobre vias de degradação proteica.
- Utilidade da plataforma: Estabelece uma capacidade reutilizável para avaliar o engajamento do alvo por meio da modulação da degradação em sistemas baseados em levedura.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Utiliza Saccharomyces cerevisiae como um sistema relevante para modelar mecanismos conservados de degradação.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a validação de alvos na fase de descoberta a estudos pré-clínicos por meio da análise do caminho conservado do ubiquitina-proteassoma.
- Avanço Ajustado ao Risco: Identifica modificadores genéticos e ambientais da degradação para reduzir os riscos dos mecanismos-alvo antes da validação em mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo dados de cinética de degradação que orientam a seleção do alvo e estudos sobre o mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao isolar variáveis de degradação dos efeitos de síntese.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para triagem de compostos ao estabelecer taxas de degradação de referência em linhagens de levedura modificadas.
- Análises: Gera leituras quantitativas de western blot normalizadas em relação aos controles de carga para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona descobertas de degradação baseadas em levedura com sistemas mamíferos por meio de componentes conservados da degradação associada ao retículo endoplasmático.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada para desmistificação de alvos em múltiplos projetos por meio de estudos de perturbação genética e química.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Proporciona desvio de risco mecanicista ao quantificar a meia-vida da proteína e identificar dependências das vias de degradação.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e livre de isótopos, compatível com a infraestrutura convencional de western blot.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao reduzir a ambiguidade sobre o mecanismo do alvo e os efeitos de compostos moduladores na estabilidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na viabilidade de degradação e na conservação da via.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de culturas de levedura, nos protocolos de segurança com cicloeximida e na quantificação de western blot.
- Depende do acesso a blocos térmicos de 30 °C e 95 °C, centrífugas e equipamentos padrão para SDS-PAGE e western blot.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de coleta de pontos temporais, eficiência de lise e normalização de sinais.
- As considerações para adaptação incluem sistemas de expressão baseados em plasmídeos, marcação com epítopos e compatibilidade com bibliotecas de leveduras com genes interrompidos.
- As limitações práticas incluem a toxicidade da cicloeximida, possíveis efeitos colaterais sobre a tradução e a necessidade de detecção dentro da faixa linear no western blot.
