Abstract
على الرغم من أن من المسلم به أن القلب لديها امكانات محدودة لتجديد العضلية بسبب الإصابة بجانب أن انخفاض مستويات دوران cardiomyocyte تحدث أثناء الشيخوخة الطبيعية، وتحديد حجم هذه الأحداث لا يزال تحديا. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى ندرة هذه العملية وحقيقة أن مصادر الخلوية متعددة تساهم في صيانة عضلة القلب. وعلاوة على ذلك، ازدواجية الحمض النووي داخل العضلية وغالبا ما يؤدي إلى cardiomyocyte المتعددة الصبغيات ونادرا ما يؤدي إلى العضلية الجديدة عن طريق الانقسام الخلوي. من أجل تحديد بدقة التمييز دوران cardiomyocyte بين هذه العمليات أمر ضروري. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم العلامات نوكليوزيد على المدى الطويل من أجل تسمية كل نوى التي نشأت نتيجة لنوى تكرار الحمض النووي وcardiomyocyte التي تم تحديدها من خلال الاستفادة من العزلة النوى وimmunolabeling PCM1 لاحق. معا وهذا يسمح بتحديد دقيق وحساس من وضع العلامات نوكليوزيد من جardiomyocyte السكان أنويتها. وعلاوة على ذلك، 4 "، ووضع العلامات وتحليل الصيغة الصبغية أنويتها 6 diamidino-2-phenylindole، يمكن التمييز نوى الجدد cardiomyocyte من نوى التي أدرجت نوكليوزيد خلال polyploidization. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن السيطرة على ازدواجية النواة cardiomyocyte، لأنها تتيح الكمي السريع والقوي من نوى الجدد cardiomyocyte بينما يمثل polyploidization. هذا الأسلوب لديه عدد من التطبيقات المصب بما في ذلك تقييم العلاجات المحتملة لتعزيز تجديد cardiomyocyte أو التحقيق في آثار أمراض القلب على دوران cardiomyocyte والصيغة الصبغية. هذا الأسلوب هو أيضا متوافقة مع تقنيات immunohistological المصب إضافية، مما يسمح الكمي التأسيس نوكليوزيد في جميع أنواع الخلايا في القلب.
Introduction
في السنوات الأخيرة كان هناك تراكم الأدلة تتحدى الافتراض بأن القلب هو متباينة عضال، بعد الإنقسامية الجهاز 1،2. ومع ذلك، وتحديد حجم دوران cardiomyocyte وتجديد يبقى تحديا.
وذكرت الصعوبات في تحديد بدقة الجيل cardiomyocyte نادر باستخدام تقنيات المناعى القياسية أيضا 3. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مصدر الخلوية من الجيل cardiomyocyte لا يزال غير مؤكد مع الدليل على مساهمات من انتشار cardiomyocyte فضلا عن الخلايا الجذعية التمايز 4-6. ولذلك، فإن استخدام نماذج النسب تتبع التي تتطلب معرفة النمط الظاهري cardiomyocyte السلف مستحيل وتقدير الانتشار في عدد السكان واحد، بما في ذلك العضلية، غير مناسب. وعلاوة على ذلك لcardiomyocyte ديه القدرة على endoreplication دون الحرائك النووية (مما أدى إلى السيارة المتعددة الصبغياتdiomyocyte) أو الحرائك النووية في غياب الانقسام السيتوبلازمي (مما أدى إلى cardiomyocyte binucleated) 7،8. والتقدير الدقيق دوران cardiomyocyte يعتمد على القدرة على التمييز بين هذه الأحداث وجيل صحيح الجدد cardiomyocyte. وهذا يخلق تعقيدات فريدة من نوعها لتكرار الحمض النووي والتعبير عن تحركات تعتمد على السيكلين في العضلية لا تظهر على وجه الحصر انقسام الخلايا الحقيقية 9،10.
للمساعدة في القياس الكمي للجيل الجدد cardiomyocyte، جمعنا بين تقنية أنشئت العزلة نوى، ووضع العلامات المناعي من المواد محيط بالمريكز 1 (PCM1) لتحديد نوى cardiomyocyte كما وصفها برغمان وآخرون 7،11 مع طرق جديدة للالمدى الطويل وضع العلامات الحمض النووي وتحليل الصيغة الصبغية. PCM-1 هو بروتين الجسيم المركزي التي تتراكم على سطح النووي متباينة، myocytes غير ركوب الدراجات. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الأجسام المضادة ضدPCM-1 تسمية تحديدا نوى cardiomyocyte 7،11 وكما تم استخدام هذا PCM1 من قبل عدد من جماعات مستقلة لتحديد العضلية 1،12،13. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا أن PCM1 التعبير خرائط لنوى cardiomyocyte المسمى وراثيا في نموذج لجنة المساواة العرقية تي ان تي المعدلة وراثيا الماوس 14 (الشكل التكميلي 1).
بروتوكول صفها هنا يمكن تحديد دقيق وحساس من جيل cardiomyocyte نوى الجدد في قلب فأر، بغض النظر عن أصول الخلوية (الشكل 1A و B) مع استبعاد في نفس الوقت وضع العلامات نوكليوزيد بسبب polyploidization من التحليل (الشكل 1C و D). على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن السيطرة على ازدواجية النواة cardiomyocyte، لأنها تتيح الكمي السريع والقوي من نوى الجدد cardiomyocyte وهو مطلوب لتقدير دقيق لدوران cardiomyocyte. علاوة على ذلك،أنه يوفر أداة الفرز السريع لتقييم التغيرات المحتملة في ديناميات الجيل cardiomyocyte.
في حين وصفها الحمض النووي وعادة ما ينطوي 5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) كما التناظرية ثيميدين، وبروتوكول الموصوفة هنا يستخدم فحص 5-إيثينيل-2'-deoxyuridine (EDU) استنادا لأنه يتطلب خطوات المعالجة أقل لأسرع من خلال-وضع ولا يتطلب تغيير طبيعة الحمض النووي للالمناعية الكشف، مما يجعلها متوافقة مع بروتوكولات المناعية الأخرى، وبالتالي زيادة التطبيقات المصب المحتملة لهذه الطريقة.
الشكل 1: ينبض المستمر مع ايدو تسميات الجدد العضلية بغض النظر عن الأسلاف الخاصة بهم. أدرج (A) EDU في الحمض النووي العضلية أثناء انقسام الخلية. وانتشار بين السكان cardiomyocyte بالنتيجهتي في زيادة أو استبدال الخلايا العضلية وهو توليف الحمض النووي وبالتالي إنتاجية (يساهم في صيانة الأنسجة وإصلاح). أدرج (ب) EDU في الحمض النووي للخلايا السلف القلب أثناء انقسام الخلية. سيتم الاحتفاظ هذا في الخلية خلال التمايز إلى النسب cardiomyocyte. وهذا تمايز الخلايا الجذعية يؤدي أيضا إلى زيادة في عدد الخلايا العضلية، وبالتالي يساهم في صيانة الأنسجة والإصلاح. (C) العضلية لديها القدرة على الخضوع لتكرار الحمض النووي "غير منتجة" مما أدى إلى زيادة الصيغة الصبغية cardiomyocyte، الذي يرتبط مع تضخم cardiomyocyte وإعادة عضلة القلب، ولكن لا يحل محل العضلية المفقودة. عملية polyploidization تختلف عن ازدواجية النواة كما أنه يؤدي إلى cardiomyocyte مع نواة واحدة والذي يحتوي على أربعة أو أكثر من مجموعات من اثنين من الكروموزومات المتماثلة (> 2N). (D) وبعد نوى ص المستمرulse، يصف هذا البروتوكول العزلة النوى وتحديد نوى cardiomyocyte من التعبير PCM1 للسماح الكمي لكلا الصيغة الصبغية cardiomyocyte وايدو التأسيس. PCM1 التعبير وايدو التأسيس الكشف باستخدام التدفق الخلوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
وقد أذن عمل الحيوانية والموافقة عليها من قبل مجلس مراجعة نيوكاسل أخلاقيات الجامعة. تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية مطابقة للمبادئ التوجيهية من التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية.
1. إدارة EDU
- حل ايدو في محلول ملحي معقم (0.9٪ ث / ت) بتركيز نهائي من 12.5 ملغ / مل.
- الحرارة الحل إلى 40 درجة مئوية، ودوامة من أجل حل تماما. تخزين ما يكفي من ايدو / المالحة في 4 درجات مئوية لحقن جميع الفئران في دراسة السماح ل6 حقن يومية.
ملاحظة: يطلب عادة أكثر من 6 الفئران لكل مجموعة التجريبية. ومع ذلك، يجب أن يتم تنفيذ العمليات الحسابية السلطة لدراسات مستقلة.
- الحرارة الحل إلى 40 درجة مئوية، ودوامة من أجل حل تماما. تخزين ما يكفي من ايدو / المالحة في 4 درجات مئوية لحقن جميع الفئران في دراسة السماح ل6 حقن يومية.
- وزن الفئران الفردية. حساب حجم المطلوبة لإدارة 100 ميكروغرام / غرام من ايدو حل / المالحة إلى كل فأر (8 ميكرولتر من محلول المخزون ايدو في ز).
- رسم نظام القبول المناسب(ه) من ايدو / المالحة إلى حقنة الأنسولين مع إبرة 25 G.
- أداء داخل الصفاق (IP) حقن أثناء التعامل مع الفئران باستخدام تقنيات وزارة الداخلية وافقت.
- ضع الماوس على غطاء القفص. سحب بلطف مرة أخرى على قاعدة الذيل ونتشبث الماوس من القفا.
- كشف البطن للحقن من خلال عقد الماوس مع السبابة والإبهام بالقرب من قاعدة الرأس والبقشيش رأس الحيوان إلى الوراء نحو الأرض.
- مسح البطن مع 70٪ محلول الكحول. تحديد خط الوسط الحيوان والربع السفلي الأيمن. حقن محلول ايدو / المالحة في الحيوان في الربع السفلي الأيمن.
- حقن الفئران مع ايدو حل / المالحة وتسجيل الوقت من اليوم.
- كرر الخطوات من 1،2-1،4 في نفس الوقت من اليوم، لمدة 6 أيام متتالية.
ملاحظة: كما هو مطلوب عنصر تحكم السلبية ايدو لتعيين النابضة لتحليل تدفق cytometric، وضخ عصر إضافي ونوع الجنس وتطابق تجريبياإد الماوس مع حجم ما يعادلها من المياه المالحة دون EDU. هذا وسوف توفر الرقابة المطلوبة (أي سيطرة EDU). وينبغي أن تدرج هذه الرقابة على كل دراسة للسماح الاختلافات في دفعات من الكواشف والكريات اقامة.
2. حصاد القلوب
- في 24 ساعة بعد ال 6 حقن ايدو، التضحية الفئران باستخدام خلع عنق الرحم (أو جدول البديل وافقت وزارة الداخلية 1 طريقة).
- وضع يذبح في موقف ضعيف وجعل شق الجلد من البطن منتصف إلى الحجاب الحاجز مع مقص جراحي.
- قطع الحجاب الحاجز، وعقد القص بعيدا عن تجويف الجسم، وقطع ثنائيا لفضح القلب.
- رفع القلب قليلا وقطع الأوعية الدموية الرئيسية في المسالك تدفق لتشريح القلب من تجويف الصدر.
- المكان على الفور كل قلب في ل15 مل أنبوب الطرد المركزي الفردية التي تحتوي على 10 مل PBS المبردة إلى 4 درجات مئوية.
- نقل القلوب إلى سبتمبرarate 10 سم أطباق بتري، باستخدام مشرط قطع كل قلب في اثنين في اتجاه سهمي ويغسل القلب عن طريق الضغط بلطف مع زوج من الملقط. ثم استبدال برنامج تلفزيوني لإزالة الكثير من الدم ممكن. كرر هذه الخطوة مرتين.
- وضع كل من أجزاء من كل القلب في نفس الفرد أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- انتقل إلى الخطوة 3 أو بدلا من العينات مخزن -80 ° C كما هو موضح في الخطوات 2.9 و 2.10.
- باستخدام إبرة G 25، وجعل ثقب صغير في الغطاء أنبوب microcentrifuge لمنع غطاء من فتح نتيجة لتمدد الغازات عند معالجة القلب.
- تسمية كل أنبوب microcentrifuge ومكان في وعاء يحتوي على النتروجين السائل لتجميد.
3. النواة التفكك وCardiomyocyte النوى وصفها
ملاحظة: يتم تكييف هذا أنويتها التفكك وcardiomyocyte نوى وضع العلامات من أن من برغمان وآخرون 11 تنفيذ هذا الإجراء على جميع العينات حقن.مع ايدو والمالحة حقن (أي سيطرة EDU) مراقبة سلبية. انظر الجدول رقم 1 لصفة الحلول المطلوبة لتنفيذ هذه الخطوات.
- لكل قلب لتحليلها، ووضع 36 مل من 1٪ BSA / حل PBS في أنبوب نابذة، واحتضان لمدة 30 دقيقة، ونبذ الحل ومن ثم السماح للهواء الجاف.
ملاحظة: يستخدم هذا الأنبوب في الخطوة 3.6. - ضع قلوب المجمدة الفردية على طبق 10 ملم على الجليد واللحم المفروم باستخدام مشرط السماح للقلوب لتذويب أثناء عملية تنميق.
- ضع قلوب المفروم إلى 15 مل من تحلل الخلايا مخزن في أنبوب الطرد المركزي 50 مل والتجانس مع الخالط التحقيق لمدة 15 ثانية في 25000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة مزيد من 15 مل من خلية الاحتياطي تحلل إلى أنبوب الطرد المركزي ونقل إلى 40 مل dounce مع مدقة تخليص كبيرة. أداء 10 السكتات الدماغية مع مدقة وتصفية من خلال 100 ميكرون من 40 مصفاة ميكرومتر الخلية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة لر 700 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
- resuspend الكرية النووي في 25 مل من السكروز التدرج الحل وطبقة نواة خلية تحتوي على حل على رأس 10 مل من محلول السكروز التدرج جديدة في أنبوب نابذة أعد في 3.1.
- أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية باستخدام أرجوحة خارج الأنبوب الدوار.
- بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend بيليه أنويتها في 1300 ميكرولتر من العازلة التخزين أنويتها في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل والتسمية PCM1.
- إزالة 300 ميكرولتر من تعليق لأنبوب microcentrifuge جديدة وإضافة 700 ميكرولتر من العازلة التخزين نواة جديدة. تسمية هذا الأنبوب كما تحكم ISO.
- إضافة مكافحة PCM1 بتركيز نهائي من 8 ميكروغرام / مل إلى أنبوب microcentrifuge المسمى PCM1 وإضافة أرنب مفتش الأضداد isotype السيطرة بتركيز 8 ميكروغرام / مل إلى أنبوب microcentrifuge المسمى السيطرة ISO.
- احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد incubأوجه، الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة، تجاهل طاف، مع استبدال 1 مل من العازلة التخزين نواة جديدة، و resuspend وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة على 700 ز س. تجاهل طاف واستبدالها مع 1 مل من العازلة التخزين نواة جديدة.
- إضافة 1 ميكرولتر من F (أ ب ') 2 قطعة من الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L) الأجسام المضادة (FITC أو ما يعادلها الصبغة الخضراء الفلورسنت) لتحقيق تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: استخدام F (أ ب ') 2 جزء الأجسام المضادة يقلل من إمكانية لوضع العلامات غير محدد من الخلايا المناعية بما في ذلك الضامة والخلايا البائية. - أنابيب التفاف في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
4. الكشف عن EDU التأسيس
- تتركز المخفف 10X EDU رد فعل عازلة 1:10 مع الماء منزوع الأيونات.
- أجهزة الطرد المركزي في PCM-1 و ISO السيطرة وصفت نوى تعليق في 700 x ج لمدة 10 دقيقة، ونبذ طاف و resuspend بيليه نوى في 1 مل من1٪ BSA / حل برنامج تلفزيوني. يغسل بيليه نوى مرتين.
- بعد غسل النهائي، تجاهل طاف واستبدالها مع 100 ميكرولتر من ايدو تثبيتي.
- لف الأنابيب في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- غسل العينات مرتين مع 1 مل من 1٪ BSA / حل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 700 x ج واحتضان مع 1X حل permeabilization القائم على سابونين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إعداد 1X EDU الوسم كوكتيل (الجدول 2). سوف تكون هناك حاجة ما لا يقل عن 2 ردود الفعل لتشمل أي سيطرة EDU.
- إضافة 500 ميكرولتر من 1X EDU الوسم كوكتيل مباشرة إلى كل عينة تحتوي بالفعل نوى في 100 ميكرولتر من 1X حل permeabilization القائم على سابونين ويحضن في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج و resuspend في 1 مل من 1٪ BSA / برنامج تلفزيوني وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج، تجاهل طاف واستبدالها مع 400 ميكرولتر من محلول الحمض النووي تلطيخ (انظر الجدول المواد).
| اسم كاشف |
| 1. خلية تحلل العازلة |
| 0.32 M السكروز |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8) |
| 5 ملي CaCl 2 |
| 5 خلات المغنيسيوم ملي |
| 2.0 ملي EDTA |
| 0.5 ملي EGTA |
| 1 ملم DTT |
| 2.Sucrose التدرج الحل |
| 2.1 M السكروز |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8) |
| 5 خلات المغنيسيوم ملي |
| 1 ملم DTT |
| 3. عازلة تخزين النوى (جهاز الأمن القومي) |
| 0.44 M السكروز |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 7.2) |
| 70 ملي بوكل |
| 10 ملي MgCl 2 |
| 1.5 ملي السبرمين |
الجدول 1: نوى عازلة عزل المكونات وصفة لجميع المخازن المستخدمة في قسم البروتوكول 3 (نوى التفكك وcardiomyocyte نوى التوسيم).
5. تحليل تدفق Cytometric
ملاحظة: إجراء التدفق الخلوي على نواة معزولة كما هو موضح سابقا 7،11،15.
- أولا، إنشاء مؤامرة اصفا الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) للسماح للتمييز من نوى من الحطام (الشكل 2A).
- إنشاء مخطط لتميز نواة واحدة من المجاميع (الشكل 2B) بالتآمر 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole) دابي) منطقة ((3-405 / 450/50-A) مقابل ارتفاع (33-405 / 450 / 50-H). ضمان ثاتي يتم جمع 3-405 / 450/50-A إشارة على مقياس خطي للسماح للتقرير الصحيح من محتوى الحمض النووي.
- إنشاء مؤامرة اصفا 488/535 / 30 ألف (PCM-1) مقابل SSC وعرض الأحداث فقط من بوابة القميص إنشاؤها في 5.2 وذلك لتقييم PCM-1 التعبير في عدد السكان القميص.
- تشغيل العينة isotype السيطرة من أجل إقامة PCM-1 بوابة إيجابية (الشكل 2C). تشغيل كمية صغيرة من PCM1 صفت عينة للتحقق من PCM1 التعبير عن موقف السكان والمعزولة.
- إنشاء مؤامرة اصفا SSC-A مقابل 405/450/50-ألف (للكشف عن دابي). في هذه المؤامرة، عرض القميص فقط PCM1 نوى التعبير، وذلك باستخدام البوابات التي تم إنشاؤها في 5.3. استخدام هذه مؤامرة لإنشاء بوابة الهرمية إضافية تحتوي فقط 2N النوى (الشكل 2D).
- إنشاء المؤامرة التي تصف 488/535 / 30 ومقابل 1-633 / 660/20-A للسماح بتحديد EDU وضع العلامات على PCM1 معربا عن السكان cardiomyocyte. عرض نوى الوحيدة التي هي القميص، P CM1 + و2N باستخدام النابضة أعلاه.
- تشغيل عينة القلب من أي سيطرة ايدو لضبط EDU بوابة إيجابية (الشكل 2E). إنشاء البوابة المناسبة لايدو خلايا +.
- سجل وقياس القميص، PCM-1 التعبير، نوى 2N التي أدرجت ايدو.
- حساب هذه الفئة من السكان كنسبة مئوية من إجمالي القميص، PCM1 + نوى. هذا وسوف توفر معدل توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte، خلال فترة إيدو نبض مدة 7 أيام، كنسبة مئوية من إجمالي نوى cardiomyocyte.
ملاحظة: كما دابي ملزمة لالحمض النووي هو القياس المتكافئ كثافة مضان يتناسب مع كمية من الحمض النووي. تحديد الصيغة الصبغية على أساس كثافة 405/450/50-A إشارة، كما هو موضح سابقا 7. - لتقييم الصيغة الصبغية ضمن مجموع السكان cardiomyocyte استخدام مؤامرة أنشئت في 5.5 واستراتيجية المحاصرة على أساس تركيز الحمض النووي (7).
/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/>
يتم التمييز المحاصرة استراتيجية لتحديد cardiomyocyte EDU التأسيس والصيغة الصبغية (A) النوى من الحطام على أساس مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC): الشكل 2. تم تحديد (B) يتم إنشاء بوابة الخطية والسكان نوى القميص على أساس دابي وضع العلامات وارتفاع 405/450/50 مقابل إشارة المنطقة. (C) النابضة نيون يسمح للفصل من نوى cardiomyocyte النوى (PCM-1-إيجابي) وعدم cardiomyocyte (PCM-1-سلبية) من أنسجة القلب. يستخدم (D) كثافة إشارة دابي لتحديد تركيز الحمض النووي والصيغة الصبغية وبالتالي أنويتها من السكان cardiomyocyte PCM1 +. في الماوس> 80٪ من نوى cardiomyocyte هي مضاعفا (2N). (E) النابضة نيون يسمح للفصل 2N، نوى cardiomyocyte التي أدرجت ايدو (PCM + / EDU + = 0.9٪) من 2N، العضلية التي لم تدرج ايدو (PCM + EDU-). وترد تفاصيل عن الخطوات في بروتوكول 5.0. المثال المعروض من MDX - / الفئران ص على خلفية C57 / BL10 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
يسمح هذا الأسلوب الكمي لزيادة دمج EDU بسبب انقسام نواة cardiomyocyte في حين السيطرة على زيادة polyploidization. عن طريق فحص BrdU القائمة، ونحن أثبتنا سابقا أن قلب الثدييات يستجيب لفقدان cardiomyocyte المزمنة، في نموذج الفأر MDX ضمور العضلات دوشين، مع تجديد الخلايا العضلية الجديدة. وقد استخدمنا الأساليب المذكورة هنا لمزيد من التحقق من صحة النتائج التي نشرت لدينا، وإثبات فائدة من البروتوكول. وفقا للبروتوكول وصفها. ونابض الكبار (12 أسبوع من العمر) MDX والسيطرة الفئران bl10 مع الحقن اليومي واحدة من ايدو لمدة 7 أيام، وذكرت في وقت سابق للسماح للتحليل إحصائيا بين المجموعات التجريبية 5،13. تحليل Immunohistological القلوب نابض يوضح وجود PCM1 التعبير العضلية التي أدرجت ايدو (الشكل 3A). النقيب ومع ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليهاز طرق immunohistological يمكن أن يساء تفسيرها، وأنواع الخلايا الأخرى التي أدرجت ايدو يمكن أخطأ في التعرف كما العضلية. ويتجلى مثال على هذا في الشكل 1A التكميلي وباء. وعلاوة على ذلك أساليب immunohistological لا تميز polyploidization من الانقسام النووي. تدفق تحليل الخلوي بالتفصيل في هذا البروتوكول تمكن الكمي السريع لتقسيم النووي cardiomyocyte في الفئران MDX والسيطرة، مع استبعاد الخلايا التي أدرجت ايدو بسبب polyploidization. على غرار البيانات المنشورة سابقا 13، وكشف التحليل زيادة في معدلات توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte في قلوب MDX الماوس بالمقارنة مع سن يقابل الضوابط (1.2٪ مقابل 0.17٪، الشكل 3B و C).
الشكل (3): الكمي من ايدو صفت العضلية في wildtype وقلوب MDX. (أ) صورة من التوقعات Z كومة مأخوذة من 40 ميكرون أبواب سميكة من قلوب MDX. PCM-1 التعبير عن نوى cardiomyocyte (الأخضر) التي أدرجت ايدو (الحمراء). يشير السهم الأصفر EDU المسمى العضلية. الأول والثاني يشير الفردية EDU المسمى العضلية هو مبين في Z-الطائرة. وصفت نوى مع دابي (الأزرق) (B و C) التدفق الخلوي من نواة معزولة تظهر المؤامرات تمثيلية 12-13 أسبوع النوع القديم البرية (C57 / BL10) والفئران MDX (MDX - / ص على C57 / خلفية BL10). (ب) رسم بياني يظهر دابي كثافة والتمييز بين 2N و> 2N نوى. (C) المؤامرات التي تبين التأسيس ايدو في عدد السكان نوى 2N cardiomyocyte عند تحليلها على النحو المفصل في هذا البروتوكول. لجميع الفئران كانت تدار ايدو ل1 أسبوع من 12 أسابيع من العمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: PCM-1 هو علامة معينة لنوى cardiomyocyte باستخدام بروتوكول وصف تم عزل نواة من الماوس المعدلة وراثيا المزدوج التي تنتجها عبور الفئران TNT-لجنة المساواة العرقية 14 مع ROSA NT / NG خط مراسل لجنة المساواة العرقية حساسة 16. في ينجم عن ذلك من تفعيل الماوس لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة تروبونين تي (TNT) المروج يؤدي إلى التعبير لا رجعة فيه GFP مع المترجمة إلى نوى. وصفت نوى مع isotype السيطرة (ايزو) يدل على القدرة على تحديد GFP معربا عن cardiomyocyte نوى السكان (488/530/30-A). وضع العلامات من نوى مع مكافحة PCM1 (الضد الثانوية الكشف عنها بواسطة 633-660 / 20-A) يدل على ارتباط التعبير PCM1 مع cardiomyocy GFP التعبيرالسكان أنويتها الشركة المصرية للاتصالات. في هذا المثال 98.8٪ من نوى cardiomyocyte كما حددها نشاط المروج تي ان تي، وصفت من قبل PCM1 الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لتحميل الشكل التكميلي 1.
معارض التحديات لقياس تجديد cardiomyocyte بواسطة تقنيات immunohistological (A) 2D صورة اثنين PCM-1 التعبير عن نوى cardiomyocyte (الأخضر) التي يبدو أنها وصفت أيضا لايدو (الأحمر): الشكل التكميلي 2. وتشير الأسهم الصفراء على ما يبدو العضلية التي أدرجت ايدو. هذا ويرجع ذلك إلى ظاهر شارك في توطين التعبير PCM1 وEDU الوسم عندما تصور باستخدام التصوير 2-dimentional. (ب) إسقاط 3-الأبعاد من هذه الصورة يحدد ايدو وصفت الخلايا ليست العضلية ولكن هي خلايا غير cardiomyocyte المغطي PCM1 معربا عن نوى cardiomyocyte. الفئران C57 / BL10 في 12 أسابيع من العمر المستخدمة في التجارب. يرجى النقر هنا لتحميل التكميلي الشكل 2A. يرجى النقر هنا لتحميل التكميلية الشكل 2B.
| مكونات رد فعل | عدد من ردود الفعل | |
| 2 | 5 | |
| برنامج تلفزيوني | 875 ميكرولتر | 2.19 مل |
| بروتيكتانت النحاس | 20 ميكرولتر | 50 ميكرولتر |
| صبغة الفلورسنت picolyl أزيد | 5 ميكرولتر | 12.5 ميكرولتر |
| رد فعل مخففالمخزن المؤقت أعد 4.1 | 100 ميكرولتر | 250 ميكرولتر |
| إجمالي حجم رد الفعل | 1 مل | 2.5 مل |
الجدول 2: ايدو المكونات كوكتيل. وصفة لEDU الوسم كوكتيل المطلوبة في القسم بروتوكول 4 (الكشف عن EDU التأسيس).
Discussion
لتحديد بدقة دوران cardiomyocyte ويجب أن المقايسات تجديد تميز بين جيل cardiomyocyte صحيح والانقسام الحمض النووي غير منتجة. لا تزال العديد من الدراسات ببساطة تجاهل هذه الأحداث غير منتجة، قياس انتشار cardiomyocyte فقط عن طريق التعبير عن الحركية عند السيكلين وعلامات دورة الخلية. حتى الآن أسلوب واحد الذي يسمح للتقدير دقيق لدوران cardiomyocyte في حين السيطرة على هذه الأحداث غير منتجة يبقى ملمح. وعلى وجه الخصوص ما زال من الصعب حساب لpolyploidization cardiomyocyte الذي يسهم تصل الى ~ 65٪ من cardiomyocyte تكرار الحمض النووي (13). لذلك للمساعدة في تقدير دقيق للجيل cardiomyocyte قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح الكمي القوي لمعدلات نوى cardiomyocyte الجدد مع استبعاد تكرار الحمض النووي أن يؤدي إلى زيادة الصيغة الصبغية. على الرغم من أن هذا البروتوكول لا يمكن التمييز بين الأجناس الجدد cardiomyocyteنشوئها وcardiomyocyte ثنائية التنوي، ويمكن استخدامه بسرعة وبدقة حساب الجزء العلوي من الحد (المحاسبة عن الصيغة الصبغية) من الجيل cardiomyocyte. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول أداة فحص لتقييم التغيرات المحتملة في معدلات توليد cardiomyocyte وpolyploidization في نماذج المرض أو لتقييم كفاءة المحتملة من العلاجات. مرة واحدة يتم تحديد التغيرات في معدل توليد أنويتها الجدد cardiomyocyte باستخدام هذا البروتوكول دراسات لاحقة يمكن أن تستخدم للتأكد ما إذا كان هذا نتيجة للتغيرات في الجيل cardiomyocyte عدد cardiomyocyte التنوي، كما هو موضح سابقا 2،13،17،18. وتشمل هذه استخدام النسيجية ديناميات التنوي الكمي cardiomyocyte خلال الفترة النبض أو تحليلات أقسام الأنسجة التي تم الحصول عليها من ايدو الحيوانات نابض في لمقارنة EDU التأسيس في السكان cardiomyocyte mononucleated ومتعددة النوى.
ويرجع ذلك إلى انخفاض مستويات دوران cardiomyocyte هذايستخدم بروتوكول الحقن متعددة من ايدو على مدى 7 أيام. وهذا يسمح أيضا "مطاردة" من جميع المصادر المحتملة الخلوية من الجيل cardiomyocyte ويسمح الكمي من الجيل cardiomyocyte نوى التراكمي خلال هذه الفترة الزمنية. اعتمادا على هذه الدراسة، يمكن تعديل هذا الإطار الزمني لتتناسب مع المستويات المتوقعة من الجيل cardiomyocyte. لتقدير دقيق لايدو التأسيس في نوى cardiomyocyte، لا بد من أن ليس هناك وسم غير محدد من النوى مع الأجسام المضادة الثانوية تستخدم لكشف PCM-1 التفاعل. وبالتالي سيكون من الحكمة لإجراء التجارب الأجسام المضادة المعايرة الثانوية إضافية من أجل تحسين هذا الجانب من البروتوكول، لا سيما إذا كان الضد الثانوية غير أن اقترح في هذا البروتوكول هو لاستخدامها. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم PCM-1 التعبير لتحديد نوى cardiomyocyte. في حين أن هذا هو علامة cardiomyocyte المعمول بها، علامات بديلة يمكن استخدامها للتحقق من صحةالبيانات؛ وتشمل هذه الأجسام المضادة المحددة للالقلب تروبونين تي والتي تم تحديدها على أنها مترجمة جزئيا في نوى cardiomyocyte 1. وبالمثل، يمكن استخدام البروتينات المترجمة النووية بديلة لتحديد وقياس EDU التأسيس في السكان أنويتها غير ذلك من العضلية. من المهم أن كل نواة cardiomyocyte التي تشهد بنشاط الانقسام مستثناة من التحليل، ومصير هذه توليف الحمض النووي غير معروف ويمكن أن يؤدي في أي انقسام الخلية أو زيادة الصيغة الصبغية. تم تفكيكها PCM1 خلال المرحلة M من دورة الخلية وبالتالي العضلية تمر الانقسام لن يتم تحديدها من قبل التعبير PCM1. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تستبعد كل نواة في مرحلة من مراحل دورة الخلية من تحليل لاحقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق المعزولة من جميع نوى مع كثافة دابي فوق السكان 2N بما في ذلك تلك التي لديها كثافة دابي بين 2N و4N السكان.
على الرغم من أنها على نحو متزايدقبلت أن القلب لديه القدرة على استبدال العضلية أثناء الشيخوخة الطبيعية، وبعد الإصابة الحادة، ويبقى مصدر ودرجة هذه الإمكانات المثير للجدل. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن معدلات متباينة من دوران cardiomyocyte 1،7،20-22. قد يكون هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات في تحديد بدقة وقياس الجدد cardiomyocyte جيل 19. حتى الآن غالبية الدراسات اعتمدوا فقط على استخدام التحليل النسيجي وتحديد العضلية عن طريق التعبير عن بروتينات حشوية، بما في ذلك البروتينات من قسيم عضلي، لتقدير حجم دوران cardiomyocyte وتجديد 2،4،23،24. استخدام هذه الأساليب للكشف عن التعبير عن علامات انتشار الأسلحة النووية، أو كما هو موضح هنا، وإدماج نظائرها ثيميدين يمكن أن يؤدي بسهولة في عدم التعرف على أنواع الخلايا القلبية الأخرى العضلية. في حين أن استخدام التصوير متحد البؤر 3D يمكن أن يساعد على التخفيف من حدة هذه المشاكل عشرطرق جنوب شرقي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. ومن المثير للاهتمام، وبروتوكول الموصوفة هنا يوضح يحدث جيل أنويتها الجدد cardiomyocyte بمعدل 0.17٪ في الأسبوع. وهذا يتفق مع تدفق الآخر الخلوي الدراسات التي تعتمد إظهار معدلات دوران أسبوعية تصل إلى 0.13٪ 5. على الرغم من أنه من المغري لاستقراء معدلات دوران السنوية بناء على هذه البيانات، كما هو الحال في الدراسات السابقة 2،5،25،26، وهذا هو صورة غير ملائمة معدلات دوران ديناميكية خلال فترة حياة الحيوان (13).
هذا الأسلوب لديه عدد من التطبيقات المحتملة بما في ذلك تقييم العلاجات المحتملة لتعزيز تجديد cardiomyocyte أو التحقيق في آثار أمراض القلب على دوران cardiomyocyte ومعدلات polyploidization cardiomyocyte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.32 M sucrose | Sigma | 84100 | |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
| 5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
| 5 mM magnesium acetate | sigma | M-5661 | |
| 2.0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
| 0.5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
| 1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
| 70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
| 10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 1.5 mM spermine | Sigma | 85590 | |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody | Sigma | HPA023374 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A-11070 | |
| cell strainers 70 μm and 100 μm | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
| Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance | Sigma | D9188-1SET | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Life technologies | A10044 | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Life technologies | C10634 | This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail. |
| CyStain DNA 2 step kit, | Sysmex Partec | 05 5005 | This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution) |
| Probe homogeniser, e.g., TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
| TissueRuptor Disposable Probes | Qiagen | 990890 | |
| ultracentrifuge | Sorvall | ||
| Facscanto II | BD Biosciences | ||
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J.
- Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).
- Malliaras, K., et al. Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart. EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).
- Hsieh, P. C., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, 970-974 (2007).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).
- Carmena, M., Earnshaw, W. C. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. , e4205 (2012).
- Gilsbach, R., et al. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun. 5, 5288 (2014).
- Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Bergmann, O., et al.
- Prigge, J. R., et al. Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei. Mamm Genome. , (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157, 795-807 (2014).
- Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1. Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).
- Kajstura, J., et al. Myocyte turnover in the aging human heart. Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).
- Kajstura, J., et al.
- Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei. Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).
- Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J.
- Gonzalez-Valdes, I., et al. Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence. Nat Commun. 6, 6473 (2015).
- Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523, 226-230 (2015).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).
