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Developmental Biology

Cardiomyocyte डीएनए संश्लेषण और Ploidy का एक साथ आकलन: एक तरीका है cardiomyocyte उत्थान और कारोबार की मात्रा असिस्ट करने के लिए

Published: May 23, 2016 doi: 10.3791/53979
Automatic Translation
1
1Institute of Genetic Medicine, International Centre for Life, Newcastle University

Abstract

हालांकि यह स्वीकार किया जाता है दिल एक सीमित क्षमता और सामान्य उम्र बढ़ने के दौरान निम्नलिखित चोट cardiomyocytes cardiomyocyte कारोबार के निम्न स्तर होते पुनर्जीवित करने के लिए है कि, इन घटनाओं की मात्रा का ठहराव चुनौती बनी हुई है। इस प्रक्रिया की दुर्लभता और तथ्य यह है कि कई सेलुलर सूत्रों दौरे रखरखाव के लिए योगदान की वजह से भाग में है। इसके अलावा, cardiomyocytes के भीतर डीएनए दोहराव अक्सर एक polyploid cardiomyocyte की ओर जाता है और शायद ही कभी सेलुलर प्रभाग द्वारा नए cardiomyocytes की ओर जाता है। आदेश में सही इन प्रक्रियाओं के बीच cardiomyocyte कारोबार भेदभाव यों करने के लिए आवश्यक है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आदेश सभी नाभिक जो नाभिक अलगाव और बाद PCM1 immunolabeling के उपयोग द्वारा की पहचान डीएनए प्रतिकृति और cardiomyocyte नाभिक का एक परिणाम के रूप में पैदा हुई है लेबल करने में लंबी अवधि के nucleoside लेबलिंग कार्यरत हैं। साथ में यह ग के nucleoside लेबलिंग की सटीक और संवेदनशील पहचान की अनुमति देतानाभिक आबादी ardiomyocyte। इसके अलावा, '4, 6-diamidino-2-phenylindole लेबलिंग और नाभिक ploidy के विश्लेषण, नाभिक जो polyploidization दौरान nucleoside शामिल किया है से नव-cardiomyocyte नाभिक के भेदभाव सक्षम बनाता है। हालांकि इस पद्धति cardiomyocyte binucleation के लिए नियंत्रित नहीं कर सकते, यह नव-cardiomyocyte नाभिक की एक तेजी से और मजबूत मात्रा का ठहराव, जबकि polyploidization के लिए लेखांकन की अनुमति देता है। इस विधि cardiomyocyte उत्थान को बढ़ाने के लिए संभावित चिकित्सा विज्ञान का आकलन करने या cardiomyocyte कारोबार और ploidy पर हृदय रोग के प्रभाव की जांच सहित बहाव के अनुप्रयोगों के एक नंबर है। इस तकनीक को भी अतिरिक्त बहाव के immunohistological तकनीक, सभी हृदय प्रकार की कोशिकाओं में nucleoside समावेश की मात्रा का ठहराव की अनुमति के साथ संगत है।

Introduction

हाल के वर्षों में अनुमान है कि दिल एक टर्मिनली विभेदित, बाद mitotic अंग 1,2 है चुनौती देने के सबूत का एक संग्रह किया गया है। हालांकि, cardiomyocyte कारोबार और उत्थान की मात्रा का ठहराव चुनौती बनी हुई है।

सही दुर्लभ cardiomyocyte पीढ़ी की पहचान मानक प्रतिरक्षाऊतकरसायन तकनीक का उपयोग करने में कठिनाइयों का अच्छी तरह से 3 रिपोर्ट कर रहे हैं। इसके अलावा, cardiomyocyte पीढ़ी के सेलुलर स्रोत cardiomyocyte प्रसार के साथ ही स्टेम सेल भेदभाव 4-6 से योगदान के लिए सबूत के साथ अनिश्चित बनी हुई है। इसलिए, वंश अनुरेखण मॉडल जो cardiomyocyte पूर्वज phenotype के ज्ञान की आवश्यकता के उपयोग असंभव है और cardiomyocytes सहित एक एकल जनसंख्या में प्रसार की मात्रा का ठहराव है, अनुचित है। इसके अलावा एक cardiomyocyte karyokinesis बिना endoreplication के लिए क्षमता है (एक polyploid कार में जिसके परिणामस्वरूपdiomyocyte) या cytokinesis (एक binucleated cardiomyocyte में जिसके परिणामस्वरूप) 7.8 के अभाव में karyokinesis। cardiomyocyte कारोबार की सही मात्रा का ठहराव इन घटनाओं और सच नव-cardiomyocyte पीढ़ी के बीच भेद करने की क्षमता पर निर्भर करता है। इस अनूठी जटिलताओं बनाता है क्योंकि डीएनए प्रतिकृति और cardiomyocytes में cyclin निर्भर kinases की अभिव्यक्ति के लिए विशेष रूप से सच कोशिका विभाजन 9,10 का प्रदर्शन नहीं करते।

नव-cardiomyocyte पीढ़ी की मात्रा का ठहराव करने में सहायता करने के लिए, हम के रूप में लंबे समय तक के उपन्यास तरीकों के साथ द्वारा Bergmann एट अल। 7,11 वर्णित एक स्थापित नाभिक अलगाव तकनीक, और cardiomyocyte नाभिक की पहचान के लिए pericentriolar सामग्री 1 (PCM1) की रोग प्रतिरोधक लेबलिंग संयुक्त है डीएनए लेबलिंग और ploidy विश्लेषण। पीसीएम -1 एक केंद्रपिंड प्रोटीन है कि भेदभाव, गैर साइकिल चालन myocytes के परमाणु सतह पर जम जाता है। पिछले अध्ययनों से पता है कि के खिलाफ एंटीबॉडी का प्रदर्शन किया हैपीसीएम -1 विशेष cardiomyocyte नाभिक 7,11 लेबल और cardiomyocytes 1,12,13 की पहचान के रूप में इस तरह के PCM1 स्वतंत्र समूहों की एक संख्या से इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, हम दिखा दिया है कि PCM1 अभिव्यक्ति टीएनटी-CRE ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 14 (पूरक चित्रा 1) में आनुवंशिक रूप से लेबल cardiomyocyte नाभिक के लिए नक्शे है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल विश्लेषण (चित्रा 1 सी और डी) से polyploidization के कारण सेलुलर मूल (चित्रा 1 ए और बी), जबकि एक साथ nucleoside लेबलिंग को छोड़कर की परवाह किए बगैर, माउस दिल में नव cardiomyocyte नाभिक पीढ़ी की सटीक और संवेदनशील पहचान सक्षम बनाता है। हालांकि इस पद्धति cardiomyocyte binucleation के लिए नियंत्रित नहीं कर सकते, यह नव-cardiomyocyte नाभिक जो cardiomyocyte कारोबार की सही मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है की एक तेजी से और मजबूत मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसके अलावा,यह cardiomyocyte पीढ़ी की गतिशीलता में संभावित परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक तेजी से जांच के लिए उपकरण प्रदान करता है।

जबकि डीएनए लेबलिंग आमतौर पर thymidine अनुरूप के रूप में 5-ब्रोमो 2'- deoxyuridine (BrdU) शामिल है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक 5 ethynyl 2'- deoxyuridine (edu) आधारित परख के रूप में यह एक और अधिक तेजी के लिए कम प्रसंस्करण कदम की आवश्यकता का उपयोग करता है के माध्यम से डाल दिया और इम्युनो-पता लगाने के लिए डीएनए के denaturing की आवश्यकता नहीं है, यह अन्य immunostaining प्रोटोकॉल और जिससे विधि के संभावित बहाव के अनुप्रयोगों में वृद्धि के साथ संगत कर रही है।

आकृति 1
चित्रा 1: edu के साथ सतत स्पंदन लेबल नव-cardiomyocytes उनकी पूर्वज की परवाह किए बगैर। (ए) edu कोशिका विभाजन के दौरान cardiomyocytes के डीएनए में शामिल किया है। cardiomyocyte आबादी में परमाणु अप्रसार resul होगाcardiomyocytes के में वृद्धि हुई है, या बदलने में टी और इसलिए उत्पादक डीएनए संश्लेषण (ऊतक के रखरखाव और मरम्मत के लिए योगदान देता है)। (बी) edu कोशिका विभाजन के दौरान हृदय पूर्वज कोशिकाओं के डीएनए में शामिल किया है। इस cardiomyocyte वंश को भेदभाव के दौरान सेल में रखा जाएगा। यह स्टेम सेल भेदभाव भी cardiomyocytes की संख्या में वृद्धि का परिणाम देगा और इसलिए ऊतक के रखरखाव और मरम्मत के लिए योगदान देता है। (सी) cardiomyocytes संभावित "गैर उत्पादक" डीएनए वृद्धि हुई cardiomyocyte ploidy, जो cardiomyocyte अतिवृद्धि और दौरे remodeling के साथ जुड़ा हुआ है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिकृति से गुजरना है, लेकिन हार गए cardiomyocytes की जगह नहीं है। polyploidization की प्रक्रिया के रूप में यह एक एकल नाभिक जो दो मुताबिक़ गुणसूत्रों (> 2N) के चार या अधिक सेट शामिल है के साथ एक cardiomyocyte में यह परिणाम binucleation से अलग है। (डी) एक सतत नाभिक पी के बादulse, इस प्रोटोकॉल नाभिक अलगाव और PCM1 अभिव्यक्ति द्वारा cardiomyocyte नाभिक की पहचान का वर्णन दोनों cardiomyocyte ploidy और edu समावेश की मात्रा का ठहराव की अनुमति है। PCM1 अभिव्यक्ति और edu समावेश प्रवाह cytometry का उपयोग कर पाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

पशु काम अधिकृत और न्यूकैसल विश्वविद्यालय आचार समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी पशु प्रक्रियाओं वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संसद के यूरोपीय संघ से दिशा-निर्देशों के अनुरूप प्रदर्शन किया गया।

1. एडू प्रशासन

  1. बाँझ खारा समाधान में edu भंग (0.9% w / v) 12.5 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में।
    1. आदेश में पूरी तरह से भंग करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस और भंवर का हल हीट। 4 डिग्री सेल्सियस पर पर्याप्त edu / खारा स्टोर 6 दैनिक इंजेक्शन के लिए अनुमति अध्ययन में सभी चूहों इंजेक्षन करने के लिए।
      नोट: आमतौर पर 6 चूहों प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, बिजली गणना स्वतंत्र अध्ययन के लिए किया जाना चाहिए।
  2. व्यक्तिगत चूहों वजन। 100 माइक्रोग्राम / प्रत्येक माउस के लिए edu / खारा समाधान के ग्राम (प्रति शेयर जी edu समाधान के 8 μl) प्रशासन के लिए आवश्यक मात्रा की गणना।
  3. उचित volum ड्राएक 25 जी सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज में edu / खारा के ई।
  4. जबकि गृह मंत्रालय को मंजूरी दे दी तकनीकों का प्रयोग चूहों से निपटने intraperitoneal (आईपी) इंजेक्शन प्रदर्शन करना।
    1. पिंजरे ढक्कन पर एक माउस रखें। धीरे पूंछ के आधार पर वापस खींचने के लिए और मजबूती से कूड़ा द्वारा माउस समझ।
    2. तर्जनी और सिर के आधार के पास अंगूठे के साथ माउस पकड़ रहा है और मंजिल की ओर पीछे की ओर पशु के सिर ढोने द्वारा इंजेक्शन के लिए पेट को बेनकाब।
    3. 70% शराब के समाधान के साथ पेट साफ कर लें। जानवर के midline और निचले सही चक्र का पता लगा। निचले सही चक्र में जानवर में edu / खारा समाधान इंजेक्षन।
    4. Edu / खारा समाधान के साथ चूहों इंजेक्षन और दिन के समय रिकॉर्ड है।
  5. दोहराएँ दिन के एक ही समय 1.4 करने के लिए 1.2 कदम, लगातार 6 दिनों के लिए।
    नोट: एक edu नकारात्मक नियंत्रण प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए gating स्थापित करने के लिए आवश्यक है के रूप में, एक अतिरिक्त आयु, लिंग इंजेक्षन और प्रयोगात्मक से मेलEdu के बिना खारा के एक बराबर मात्रा के साथ एड माउस। यह आवश्यक नियंत्रण (कोई edu नियंत्रण) प्रदान करेगा। हर अध्ययन के लिए अभिकर्मकों के बैच में बदलाव के लिए अनुमति देने के लिए इस पर नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए और कोशिकामापी की स्थापना की।

2. फसल काटने दिल

  1. 6 वें edu इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (या एक वैकल्पिक अनुसूची 1 गृह मंत्रालय को मंजूरी दे दी विधि) का प्रयोग चूहों बलिदान।
  2. एक लापरवाह स्थिति में बलिदान पशु प्लेस और शल्य कैंची के साथ डायाफ्राम के मध्य पेट से त्वचा चीरा बनाते हैं।
  3. डायाफ्राम काटें, और उरोस्थि शरीर गुहा से दूर पकड़े, द्विपक्षीय कटौती दिल को बेनकाब करने के लिए।
  4. दिल से थोड़ा लिफ्ट और बहिर्वाह पथ के प्रमुख रक्त वाहिकाओं में कटौती वक्ष गुहा से बाहर दिल टुकड़े करना।
  5. इसके तत्काल बाद पीबीएस 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा 10 मिलीग्राम से युक्त एक व्यक्ति 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में हर दिल जगह है।
  6. सितंबर दिलों स्थानांतरणarate 10 सेमी पेट्री डिश, एक छुरी एक बाण के अभिविन्यास में दो में हर दिल में कटौती और धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ फैलाएंगे द्वारा दिल धोने का उपयोग कर। तो जितना संभव हो उतना खून को दूर करने के लिए पीबीएस की जगह। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  7. हर दिल के दोनों भागों में एक ही व्यक्ति को 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखें।
  8. 3 या वैकल्पिक रूप से दुकान नमूनों कदम करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस के रूप में कदम 2.9 और 2.10 में विस्तृत जारी रखें।
  9. एक 25 जी सुई का प्रयोग, जब दिल से कार्रवाई की है गैसों के विस्तार की वजह से खोलने से रोकने के लिए ढक्कन microcentrifuge ट्यूब ढक्कन में एक छोटा सा छेद करना।
  10. तरल नाइट्रोजन का एक कंटेनर को फ्रीज करने के लिए प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब और जगह लेबल।

3. नाभिक हदबंदी और cardiomyocyte नाभिक लेबल

नोट: यह नाभिक हदबंदी और cardiomyocyte नाभिक लेबलिंग Bergmann एट अल के उस से अनुकूलित है 11 इंजेक्शन सभी नमूनों पर इस प्रक्रिया को पूरा करें।Edu और खारा इंजेक्शन (कोई edu नियंत्रण) नकारात्मक नियंत्रण के साथ। इन चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक समाधान का नुस्खा के लिए 1 टेबल देखें।

  1. प्रत्येक दिल का विश्लेषण किया जाए, ultracentrifuge एक ट्यूब में 1% BSA / पीबीएस समाधान के 36 मिलीलीटर जगह है, 30 मिनट के लिए सेते हैं, समाधान त्यागें और फिर हवा शुष्क करने की अनुमति।
    नोट: इस ट्यूब कदम 3.6 में प्रयोग किया जाता है।
  2. व्यक्तिगत जमे हुए दिलों को बर्फ और कीमा एक छुरी दिल नख़रेबाज़ प्रक्रिया के दौरान defrost करने के लिए अनुमति के प्रयोग पर एक 10 मिमी पकवान पर रखें।
  3. सेल बफर के 15 एमएल में कीमा बनाया हुआ दिल एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और कमरे के तापमान पर 25,000 rpm पर 15 सेकंड के लिए एक जांच homogenizer के साथ homogenize।
  4. अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल बफर का एक और 15 मिलीलीटर जोड़ें और एक बड़ी निकासी मूसल के साथ एक 40 मिलीलीटर Dounce के लिए स्थानांतरण। मूसल के साथ 10 स्ट्रोक प्रदर्शन और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 100 माइक्रोन के माध्यम से फिर 40 माइक्रोन सेल झरनी फिल्टर।
  5. के लिए 10 मिनट के एक अपकेंद्रित्रटी 4 डिग्री सेल्सियस पर 700 XG और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. सुक्रोज ढाल समाधान के 25 मिलीलीटर में परमाणु गोली Resuspend और 3.1 में तैयार ultracentrifuge ट्यूब में ताजा सूक्रोज ढाल समाधान के 10 मिलीलीटर की चोटी पर समाधान युक्त सेल नाभिक परत।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र एक स्विंग बाहर ट्यूब रोटर का उपयोग कर।
  8. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और लेबल PCM1 में नाभिक भंडारण बफर के 1,300 μl में नाभिक गोली resuspend।
  9. एक नया microcentrifuge ट्यूब निलंबन के 300 μl निकालें और ताजा नाभिक भंडारण बफर के 700 μl में जोड़ें। आईएसओ नियंत्रण के रूप में इस ट्यूब लेबल।
  10. विरोधी PCM1 8 माइक्रोग्राम / लेबल PCM1 microcentrifuge ट्यूब मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और लेबल आईएसओ नियंत्रण microcentrifuge ट्यूब 8 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में खरगोश आईजीजी निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी जोड़ें।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। बाद incubसमझना, 10 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला त्यागें, पर 700 x जी 10 मिनट के लिए फिर से ताजा नाभिक भंडारण बफर, resuspend और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा नाभिक भंडारण बफर के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  12. 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एफ (एबी ') बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + L) एंटीबॉडी (FITC या समकक्ष हरी फ्लोरोसेंट डाई) के 2 टुकड़ा के 1 μl जोड़ें।
    ध्यान दें: एक एफ (एबी) के उपयोग के 2 टुकड़ा एंटीबॉडी मैक्रोफेज और बी कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के गैर विशिष्ट लेबलिंग के लिए संभावित कम हो जाती है।
  13. एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें ट्यूबों के प्रकाश से बचाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।

4. edu निगमन की जांच

  1. पतला 10x विआयनीकृत पानी के साथ edu प्रतिक्रिया बफर 01:10 ध्यान केंद्रित किया।
  2. अपकेंद्रित्र पीसीएम -1 और 10 मिनट के लिए 700 XG पर आईएसओ नियंत्रण लेबल नाभिक निलंबन, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और के 1 मिलीलीटर में नाभिक गोली resuspend1% BSA / पीबीएस समाधान। नाभिक गोली दो बार धोएं।
  3. अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और edu लगानेवाला के 100 μl के साथ बदलें।
  4. एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें ट्यूबों के प्रकाश से बचाने के लिए और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. 700 XG पर 1% BSA / पीबीएस समाधान, सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार के नमूने को धो लें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x सैपोनिन आधारित permeabilization समाधान के साथ सेते हैं।
  6. 1x edu लेबलिंग कॉकटेल (तालिका 2) तैयार करें। 2 प्रतिक्रियाओं की एक न्यूनतम कोई edu नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।
  7. सीधे पहले से ही 1x सैपोनिन आधारित permeabilization समाधान के 100 μl में नाभिक युक्त प्रत्येक नमूने के लिए 1x edu लेबलिंग कॉकटेल के 500 μl जोड़ें और कमरे के तापमान 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित पर सेते हैं।
  8. 700 XG और 1% बीएसए / पीबीएस के 1 मिलीलीटर में resuspend पर अपकेंद्रित्र और इस कदम को दो बार दोहराएँ।
  9. 700 XG पर अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला त्यागें और 4 के साथ बदलेंडीएनए धुंधला समाधान के 00 μl (सामग्री की तालिका देखें)।
अभिकर्मक के नाम
1. सेल बफर
0.32 एम सुक्रोज
10 मिमी Tris एचसीएल (पीएच = 8)
5 मिमी 2 CaCl
5 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट
2.0 मिमी EDTA
0.5 मिमी EGTA
1 मिमी डीटीटी
2.Sucrose ढाल समाधान
2.1 मीटर सुक्रोज
10 मिमी Tris एचसीएल (पीएच = 8)
5 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट
1 मिमी डीटीटी
3. नाभिक भंडारण बफर (NSB)
0.44 एम सुक्रोज
10 मिमी Tris एचसीएल (पीएच = 7.2)
70 मिमी KCl
10 मिमी 2 MgCl
1.5 मिमी spermine

तालिका 1: नाभिक अलगाव बफर सामग्री सभी बफ़र प्रोटोकॉल धारा 3 (नाभिक हदबंदी और cardiomyocyte नाभिक लेबलिंग) में इस्तेमाल के लिए पकाने की विधि।।

5. प्रवाह cytometric विश्लेषण

नोट: के रूप में पहले 7,11,15 वर्णित प्रवाह cytometry पृथक नाभिक पर प्रदर्शन करना।

  1. सबसे पहले, एक साजिश आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) का वर्णन मलबे (2A चित्रा) से नाभिक के भेदभाव की अनुमति के लिए पैदा करते हैं।
  2. (DAPI) क्षेत्र (3-405 / 450/50-ए) बनाम ऊंचाई 4 साजिश रचने के द्वारा समुच्चय (चित्रा 2 बी) से एकल नाभिक भेदभाव करने के लिए एक साजिश ', 6-diamidino-2-phenylindole) बनाएँ (33-405 / 450 / 50-एच)। Tha सुनिश्चित करेंटी 3-405 / 450/50-ए संकेत डीएनए सामग्री का सही निर्धारण की अनुमति के लिए रैखिक पैमाने पर एकत्र किया जाता है।
  3. एसएससी बनाम एक भूखंड 488/535/30-ए का वर्णन (पीसीएम -1) बनाएँ और आदेश स्वेटर जनसंख्या में पीसीएम -1 अभिव्यक्ति का आकलन करने में 5.2 में बनाया स्वेटर गेट से केवल घटनाओं प्रदर्शित करते हैं।
  4. आदेश में एक पीसीएम -1 सकारात्मक गेट (चित्रा 2 सी) की स्थापना के लिए निर्धारण नियंत्रण नमूना चलाएँ। भागो PCM1 की एक छोटी राशि लेबल जनसंख्या और gating स्थिति को व्यक्त करने PCM1 सत्यापित करने के लिए नमूना।
  5. एक साजिश बनाम 405/450/50-ए (DAPI पता लगाने के लिए) एसएससी-ए का वर्णन बनाएँ। इस साजिश में, प्रदर्शन केवल PCM1 व्यक्त नाभिक स्वेटर, 5.3 में बनाया फाटकों का उपयोग। एक अतिरिक्त hierarchal गेट कि केवल 2N नाभिक (चित्रा 2 डी) शामिल हैं बनाने के लिए इस साजिश का प्रयोग करें।
  6. एक साजिश है कि बनाम 1-633 / 660/20-एक 488/535/30-ए का वर्णन PCM1 की edu लेबलिंग cardiomyocyte आबादी व्यक्त की पहचान की अनुमति के लिए बनाएँ। केवल नाभिक जो स्वेटर, पी रहे हैं प्रदर्शन CM1 + और 2N ऊपर gating का उपयोग कर।
  7. कोई edu नियंत्रण से चलाने के दिल नमूना edu सकारात्मक गेट (चित्रा 2 ई) स्थापित करने के लिए। Edu + कोशिकाओं के लिए उचित गेट बनाएँ।
  8. रिकार्ड और यों स्वेटर, पीसीएम -1 व्यक्त 2N नाभिक कि edu शामिल किया है।
  9. कुल स्वेटर, PCM1 + नाभिक का एक प्रतिशत के रूप में इस आबादी की गणना। यह नव-cardiomyocyte नाभिक पीढ़ी की दर प्रदान करेगा 7 दिन edu पल्स अवधि के दौरान कुल cardiomyocyte नाभिक का एक प्रतिशत के रूप में।
    नोट: DAPI डीएनए के लिए बाध्य stoichiometric है के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता डीएनए की राशि के लिए आनुपातिक है। 405/450/50-ए संकेत की तीव्रता के आधार पर ploidy निर्धारण करते हैं, जैसा कि पहले 7 में वर्णित है।
  10. कुल cardiomyocyte आबादी के भीतर ploidy मूल्यांकन करने के लिए साजिश 5.5 में स्थापित किया गया है और एक gating डीएनए एकाग्रता 7 पर आधारित रणनीति का उपयोग करें।

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चित्रा 2:। Cardiomyocyte edu समावेश और ploidy यों की रणनीति Gating (ए) नाभिक आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) के आधार पर मलबे से भेदभाव कर रहे हैं। (बी) के एक रेखीय गेट बनाई गई है और स्वेटर नाभिक आबादी DAPI लेबलिंग और 405/450/50 ऊंचाई बनाम क्षेत्र संकेत के आधार पर पहचान की है। (सी) फ्लोरोसेंट gating हृदय के ऊतकों से cardiomyocyte नाभिक (पीसीएम -1 पॉजिटिव) और गैर cardiomyocyte (पीसीएम-1-नकारात्मक) नाभिक की जुदाई की अनुमति देता है। (डी) DAPI संकेत की तीव्रता डीएनए एकाग्रता और PCM1 + cardiomyocyte आबादी की जिससे नाभिक ploidy निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। माउस में> cardiomyocyte नाभिक का 80% द्विगुणित (2n) कर रहे हैं। (ई) फ्लोरोसेंट gating 2N की जुदाई की अनुमति देता है, cardiomyocyte नाभिक जो 2N से edu (पीसीएम + / EDU + = 0.9%) को शामिल किया है, जो cardiomyocytes edu शामिल नहीं किया है (पीसीएम + EDU- संपूर्ण)। सभी कदम प्रोटोकॉल 5.0 में विस्तृत रहे हैं। उदाहरण MDX से दिखाया -। C57 / BL10 पृष्ठभूमि पर / y चूहों यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

इस विधि जबकि वृद्धि polyploidization के लिए नियंत्रित करने cardiomyocyte नाभिक विभाजन के कारण बढ़ edu समावेश की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। एक BrdU आधारित परख का उपयोग करना, हम पहले से दिखा दिया है कि स्तनधारी दिल पुरानी cardiomyocyte नुकसान का जवाब, Duchenne पेशी dystrophy के MDX माउस मॉडल में, नए cardiomyocytes के उत्थान के साथ। हम यहाँ वर्णित विधियों आगे हमारे प्रकाशित निष्कर्षों को मान्य करने के लिए और प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया है। प्रोटोकॉल वर्णित के अनुसार; वयस्क (12 सप्ताह पुरानी) MDX और नियंत्रण bl10 चूहों 7 दिनों के लिए edu में से एक दैनिक इंजेक्शन के साथ स्पंदित कर रहे थे, पहले से सूचना दी स्थिर रुप से प्रयोगात्मक समूहों के बीच 5,13 विश्लेषण की अनुमति है। स्पंदित दिल की Immunohistological विश्लेषण cardiomyocytes जो edu (चित्रा 3 ए) को शामिल किया है व्यक्त PCM1 की उपस्थिति को दर्शाता है। हालांकि, डेटा प्राप्त usinजी immunohistological तरीकों, गलत व्याख्या की जा सकती है के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं जो edu को शामिल किया है cardiomyocytes के रूप में गलत पहचान की जा सकती है। इस का एक उदाहरण पूरक चित्रा 1 ए और बी में प्रदर्शन किया है। इसके अलावा immunohistological तरीकों परमाणु विभाजन से polyploidization अंतर नहीं है। प्रवाह इस प्रोटोकॉल में विस्तृत cytometry विश्लेषण, MDX और नियंत्रण चूहों में cardiomyocyte परमाणु विभाजन की तेजी मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है, जबकि कोशिकाओं जो polyploidization के कारण edu शामिल किया था छोड़कर। पहले प्रकाशित डेटा 13 के लिए इसी प्रकार, विश्लेषण उम्र की तुलना MDX माउस दिलों में नव-cardiomyocyte नाभिक पीढ़ी की दरों में वृद्धि से पता चला नियंत्रण (चित्रा 3 बी और सी बनाम 0.17% 1.2%) मिलान नहीं हुआ।

चित्र तीन
चित्र तीन: Edu की मात्रा wildtype और MDX दिलों में cardiomyocytes लेबल। (ए) 40 माइक्रोन MDX दिल की मोटी वर्गों से लिया Z ढेर अनुमानों की छवि। पीसीएम -1 व्यक्त cardiomyocyte नाभिक (हरा) जो शामिल किया गया है edu (लाल)। पीले तीर इंगित करता है edu लेबल cardiomyocytes। मैं और द्वितीय व्यक्तिगत edu लेबल Z विमान में दिखाया गया cardiomyocytes इंगित करता है। (- / C57 / BL10 पृष्ठभूमि पर Y MDX) नाभिक DAPI (नीला) (बी और सी) पृथक नाभिक के प्रवाह cytometry 12-13 सप्ताह पुरानी जंगली प्रकार (C57 / BL10) और MDX चूहों से प्रतिनिधि भूखंडों दिखाने के साथ लेबल। (बी) हिस्टोग्राम 2N और> 2N नाभिक के बीच DAPI तीव्रता और भेदभाव को दर्शाता है। (सी) 2N cardiomyocyte नाभिक आबादी में edu समावेश दिखा जब विश्लेषण के रूप में इस प्रोटोकॉल में विस्तृत भूखंड। सभी चूहों के लिए एडू 1 से 1 सप्ताह के लिए दिलाईउम्र के 2 हफ्तों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1:। पीसीएम -1 cardiomyocyte नाभिक के लिए एक विशिष्ट मार्कर है प्रोटोकॉल का उपयोग वर्णित नाभिक रोजा NT / एनजी सीआरई संवेदनशील संवाददाता लाइन 16 के साथ टीएनटी-सीआरई चूहों 14 पार करके उत्पादित डबल ट्रांसजेनिक माउस से अलग थे। ट्रोपोनिन टी (टीएनटी) प्रमोटर के नियंत्रण में है, जिसके परिणामस्वरूप माउस सीआरई सक्रियण में साथ नाभिक के लिए स्थानीय है GFP के अपरिवर्तनीय अभिव्यक्ति की ओर जाता है। नाभिक निर्धारण नियंत्रण (आईएसओ) के साथ लेबल व्यक्त GFP cardiomyocyte नाभिक आबादी (488/530/30-ए) की पहचान करने की क्षमता को दर्शाता है। विरोधी PCM1 साथ नाभिक की लेबलिंग (द्वारा पता लगाया माध्यमिक एंटीबॉडी 633-660 / 20-ए) GFP व्यक्त cardiomyocy साथ PCM1 अभिव्यक्ति के संबंध को दर्शाता हैते नाभिक आबादी। Cardiomyocyte नाभिक के रूप में टीएनटी प्रमोटर गतिविधि द्वारा की पहचान, PCM1 एंटीबॉडी द्वारा चिह्नित कर रहे हैं की इस उदाहरण में 98.8%। अनुपूरक चित्रा 1 डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2:। Immunohistological तकनीक से cardiomyocyte नवीकरण बढ़ाता के लिए चुनौतियां (ए) 2 डी छवि दो पीसीएम -1 व्यक्त cardiomyocyte नाभिक (हरा) जो भी edu (लाल) के लिए लेबल किया जा करने के लिए प्रकट चलता। पीले तीर से संकेत मिलता है क्या cardiomyocytes जो edu को शामिल किया है प्रतीत होता है। इस PCM1 अभिव्यक्ति और edu लेबलिंग जब 2-आयामी इमेजिंग उपयोग करते हुए कल्पना की स्पष्ट सह स्थानीयकरण के कारण है। (ख) इस छवि का एक 3 आयामी प्रक्षेपण पहचानती edu लेबल की कोशिकाओं cardiomyocytes नहीं हैं, लेकिन गैर cardiomyocyte पीसी overlying कोशिकाओं रहे हैंएम 1 cardiomyocyte नाभिक व्यक्त। प्रयोगों के लिए इस्तेमाल की उम्र के 12 सप्ताह में C57 / BL10 चूहों। कृपया यहां अनुपूरक चित्रा 2A डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें। अनुपूरक चित्रा 2B डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

रिएक्शन अवयव प्रतिक्रियाओं की संख्या
2 5
पीबीएस 875 μl 2.19 मिलीलीटर
कॉपर protectant 20 μl 50 μl
फ्लोरोसेंट रंजक picolyl azide 5 μl 12.5 μl
पतला प्रतिक्रिया4.1 में तैयार बफर 100 μl 250 μl
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 1 मिलीलीटर 2.5 मिलीलीटर

तालिका 2: edu कॉकटेल सामग्री। Edu लेबलिंग कॉकटेल के लिए पकाने की विधि प्रोटोकॉल की धारा 4 (edu समावेश की जांच) में की आवश्यकता है।

Discussion

सही cardiomyocyte कारोबार यों और उत्थान assays सच cardiomyocyte पीढ़ी और अनुत्पादक डीएनए विभाजन के बीच अंतर करना चाहिए। कई अध्ययनों से पूरी तरह cyclin Kinesis और सेल चक्र मार्कर की अभिव्यक्ति के माध्यम से cardiomyocyte प्रसार बढ़ाता है, बस इन अनुत्पादक घटनाओं की अनदेखी करने के लिए जारी है। तिथि के लिए एक ही तरीका है कि cardiomyocyte कारोबार की सही मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, जबकि इन घटनाओं के लिए अनुत्पादक को नियंत्रित करने सांकेतिक बनी हुई है। विशेष रूप से यह cardiomyocyte polyploidization जो ~ को cardiomyocyte डीएनए प्रतिकृति 13 के 65% अप योगदान देता है के लिए खाते में करने के लिए मुश्किल बनी हुई है। इसलिए cardiomyocyte पीढ़ी की सही मात्रा का ठहराव में हम एक प्रोटोकॉल है कि नव cardiomyocyte नाभिक की दरों की मजबूत मात्रा का ठहराव, जबकि डीएनए प्रतिकृति है कि वृद्धि की ploidy में परिणाम को छोड़कर अनुमति देता है विकसित किया है की सहायता के लिए। हालांकि इस प्रोटोकॉल कर सकते हैं नव-cardiomyocyte पीढ़ी के बीच भेदभाव नहींtion और cardiomyocyte द्वि-केंद्रक, यह तेजी से इस्तेमाल किया जा सकता है और इसे सही ऊपरी सीमा cardiomyocyte पीढ़ी की (ploidy के लिए लेखांकन) की गणना। इस प्रोटोकॉल इसलिए रोग मॉडल में cardiomyocyte पीढ़ी और polyploidization की दरों में संभावित परिवर्तन का आकलन करने के लिए या चिकित्सा विज्ञान की संभावित क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण प्रदान करता है। एक बार जब नव-cardiomyocyte नाभिक पीढ़ी की दर में परिवर्तन के इस प्रोटोकॉल का उपयोग पहचान कर रहे हैं बाद में पढ़ाई करता है, तो इस cardiomyocyte nucleation संख्या के cardiomyocyte पीढ़ी में परिवर्तन के कारण, पहले 2,13,17,18 वर्णित के रूप में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये नाड़ी की अवधि के दौरान ऊतकीय मात्रा का ठहराव cardiomyocyte nucleation गतिशीलता का उपयोग शामिल है या mononucleated और multinucleated cardiomyocyte आबादी में edu समावेश तुलना करने के लिए edu स्पंदित जानवरों से प्राप्त ऊतक वर्गों का विश्लेषण करती है।

cardiomyocyte कारोबार इस के निम्न स्तर के कारणप्रोटोकॉल एक 7 दिन की अवधि में edu के कई इंजेक्शन का उपयोग करता है। यह भी अनुमति देता cardiomyocyte पीढ़ी के सभी संभावित स्रोतों की सेलुलर "पीछा" और इस समय अवधि में संचयी cardiomyocyte नाभिक पीढ़ी की मात्रा का ठहराव के लिए परमिट। अध्ययन के आधार पर, इस समय सीमा cardiomyocyte पीढ़ी की भविष्यवाणी के स्तर के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है। cardiomyocyte नाभिक में edu समावेश की सही मात्रा का ठहराव के लिए, यह जरूरी है माध्यमिक पीसीएम -1 जेट का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के साथ नाभिक का कोई गैर विशिष्ट लेबलिंग नहीं है। इसलिए यह आदेश विशेष रूप से अगर एक माध्यमिक कि अन्य की तुलना में एंटीबॉडी सुझाव में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया जा रहा है प्रोटोकॉल के इस पहलू का अनुकूलन करने में अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोगों शुरू करने के लिए विवेकपूर्ण होगा। यहां वर्णित प्रोटोकॉल पीसीएम -1 अभिव्यक्ति का उपयोग करता है cardiomyocyte नाभिक की पहचान। हालांकि यह एक स्थापित cardiomyocyte मार्कर है, वैकल्पिक मार्कर मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताजानकारी; इन हृदय ट्रोपोनिन टी जो पहचान की गई है के रूप में आंशिक रूप से cardiomyocyte नाभिक 1 में स्थानीय के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी शामिल हैं। इसी तरह, वैकल्पिक परमाणु स्थानीय प्रोटीन cardiomyocytes की तुलना में अन्य नाभिक आबादी में पहचान करने और edu समावेश यों इस्तेमाल किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि सभी cardiomyocyte नाभिक कि सक्रिय रूप से बँटवारा के दौर से गुजर रहे हैं, विश्लेषण से बाहर रखा गया है के रूप में इस डीएनए संश्लेषण के भाग्य अज्ञात है और या तो कोशिका विभाजन या बढ़ा ploidy में हो सकता है। PCM1 कोशिका चक्र इसलिए दौर से गुजर बँटवारा cardiomyocytes PCM1 अभिव्यक्ति से पहचान नहीं की जाएगी एम चरण के दौरान disassembled है। इसके अलावा, सेल चक्र के एस चरण में सभी नाभिक बाद के विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। इस 2N और 4N आबादी के बीच एक DAPI तीव्रता के साथ उन सहित 2N आबादी के ऊपर एक DAPI तीव्रता के साथ सभी नाभिक बाहर gating द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

हालांकि यह तेजी से हैस्वीकार किए जाते हैं दिल क्षमता सामान्य उम्र बढ़ने और निम्न गंभीर चोट के दौरान cardiomyocytes को बदलने के लिए है, स्रोत और इस क्षमता की डिग्री विवादास्पद बना हुआ है। इसके अलावा, cardiomyocyte कारोबार का असमान दरों 1,7,20-22 सूचना दी गई है। यह सही पहचान करने और नव-cardiomyocyte पीढ़ी 19 बढ़ाता में कठिनाइयों की वजह से भाग में हो सकता है। तारीख के अध्ययन के बहुमत ही ऊतकीय विश्लेषण के उपयोग और sarcomere के प्रोटीन, cardiomyocyte कारोबार और नवीकरण 2,4,23,24 की मात्रा का ठहराव के लिए सहित cytoplasmic प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से cardiomyocytes की पहचान पर भरोसा किया है। इन तरीकों के उपयोग के प्रसार मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए, या के रूप में यहाँ का प्रदर्शन किया, thymidine analogues के समावेश आसानी से cardiomyocytes के रूप में अन्य प्रकार के हृदय सेल की गलत पहचान हो सकती है। 3 डी confocal इमेजिंग के उपयोग से इन समस्याओं वें कम करने में मदद कर सकते हैंese तरीकों महंगा है और समय लेने वाली हैं। दिलचस्प है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता नव-cardiomyocyte नाभिक पीढ़ी प्रति सप्ताह 0.17% की दर पर होता है। इस आधार पर अध्ययन करने के लिए 0.13% 5 की साप्ताहिक कारोबार दरों का प्रदर्शन cytometry अन्य प्रवाह के अनुरूप है। हालांकि यह इस डेटा के आधार पर वार्षिक कारोबार दरों एक्सट्रपलेशन, पिछले अध्ययनों 2,5,25,26 में के रूप में आकर्षक है, यह अनुचित है के रूप में कारोबार की दरों में एक जानवर की 13 जीवन समय के दौरान गतिशील हैं।

इस विधि cardiomyocyte उत्थान को बढ़ाने के लिए संभावित चिकित्सा विज्ञान का आकलन करने या cardiomyocyte कारोबार पर हृदय रोग के प्रभाव और cardiomyocyte polyploidization की दरों की जांच सहित संभावित अनुप्रयोगों के एक नंबर है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.32 M sucrose Sigma 84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8) Sigma T3253
5 mM CaCl2 Sigma c5086
5 mM magnesium acetate sigma M-5661
2.0 mM EDTA Sigma E5134
0.5 mM EGTA Sigma 63779
1 mM DTT Sigma D0632
70 mM KCl Sigma P9541
10 mM MgCl2 Sigma M8266
1.5 mM spermine Sigma 85590
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade abcam abc7415
Rabbit anti-PCM-1 antibody Sigma HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody  Life technologies A-11070
cell strainers  70 μm and 100 μm  Fisher scientific 11597522, 11517532
Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance Sigma D9188-1SET
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Life technologies A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit Life technologies C10634 This kit inlcudes  reagents required for section, EdU reaction buffer,  EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.
CyStain DNA 2 step kit, Sysmex Partec 05 5005 This kit inlcudes  reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)
Probe homogeniser, e.g., TissueRuptor Qiagen 9001273
TissueRuptor Disposable Probes Qiagen 990890
ultracentrifuge Sorvall 
Facscanto II BD Biosciences
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Bovine serum albumin  Sigma A2153

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 111 cardiomyocyte उत्थान कारोबार ploidy प्रवाह cytometry दिल
Cardiomyocyte डीएनए संश्लेषण और Ploidy का एक साथ आकलन: एक तरीका है cardiomyocyte उत्थान और कारोबार की मात्रा असिस्ट करने के लिए
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Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. J. Vis. Exp. (111), e53979, doi:10.3791/53979 (2016).

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