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Artigo de método

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

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DOI:

10.3791/53990

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20 de outubro de 2016

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1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Resumo

glioblastoma multiforme (IV glioma grade) é um câncer humano muito agressivo com uma sobrevida média de diagnóstico pós 1 ano. Apesar do aumento da compreensão dos eventos moleculares que dão origem a glioblastomas, este cancro continua a ser altamente refractário ao tratamento convencional. A ressecção cirúrgica de tumores cerebrais de alto grau raramente é completa devido à natureza altamente infiltrativa de células de glioblastoma. abordagens terapêuticas que atenuam a invasão de células de glioblastoma, portanto, é uma opção atraente. O nosso laboratório e outros mostraram que o tumor macrófagos e microglia (macrófagos residentes de cérebro) estimulam fortemente a invasão glioblastoma associados. O protocolo descrito neste documento é usado para modelar glioblastoma e macrófagos / microglia interação utilizando ensaios in vitro de cultura. Esta abordagem pode facilitar grandemente o desenvolvimento e / ou descoberta de drogas que interrompem a comunicação com os macrófagos que permite que este behav malignoeu ou. Nós estabelecemos dois ensaios de co-cultura de invasão robustos, onde microglia / macrófagos estimulam a invasão de células de glioma por 5-10 vezes. células de glioblastoma marcadas com um marcador fluorescente ou constitutivamente expressando uma proteína fluorescente foram semeadas com e sem macrófagos / microglia em insertos de câmara de policarbonato revestidos de matriz ou embebida numa matriz tridimensional. invasão celular é avaliada por microscopia de fluorescência usando a imagem e contam apenas as células invasivas sobre o lado de baixo do filtro. Usando estes ensaios, vários inibidores farmacológicos (JNJ-28312141, PLX3397, gefitinib, e Semapimod), foram identificados que bloqueiam macrófagos / microglia estimulou invasão glioblastoma.

Introdução

Glioblastoma multiforme é um câncer de cérebro humano agressivo com uma sobrevida média de aproximadamente 12 meses a partir do momento do diagnóstico 1,2. Glioblastoma é um dos cancros mais mortais e clinicamente desafiadoras como é refratário à quimioterapia padrão e ressecção cirúrgica. A natureza difusa do glioblastoma permite que as células tumorais se espalhar por todo o cérebro normal, fazendo com que o tumor avançado praticamente impossível para ressecar cirurgicamente completamente. Este aspecto altamente invasivo é uma característica marca de glioblastoma e outros astrocitomas avançados. Portanto, o foco de muita pesquisa tem sido sobre o mecanismo molecular de invasão de células de glioblastoma. O microambiente do tumor glioblastoma desempenha um papel vital no estabelecimento de malignidade 3-6. Associados a tumores macrófagos / microglia foram mostrados para ser responsável pela promoção do glioblastoma invasão 7,8. A maioria destes estudos no entanto medido o efeito de macrófagos / microglia usandoensaios que fisicamente separá-los a partir de células de glioblastoma. Nosso laboratório tem a intenção de gerar ensaios melhorados que nos permitem estudar como glioblastoma invasão é dependente de macrófagos / microglia em co-culturas e permitir-nos de imagem a interação física entre eles durante a invasão.

ensaios clássicos para medir a invasão de células incluem as quimiotaxia câmara de Boyden "padrão" e formatos quimioinvasão. Aqui, as células a serem estudadas são colocadas numa câmara de plástico que contém um filtro de policarbonato sobre o fundo, que tem poros de um tamanho especificado (geralmente entre 0,4 e 8 um de diâmetro). O processo de invasão celular envolve uma barreira física, normalmente composta de proteínas da matriz extracelular. No ensaio de quimioinvasão, a matriz preferida é utilizado Matrigel (daqui em diante referido como "matriz"), uma mistura de proteínas de matriz extracelular segregada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato e consiste em grande parte de colTipo de lagen IV e laminina. As câmaras são então colocadas num poço de cultura de tecido que contém o meio de cultura de células com ou sem factores de crescimento que são suspeitos de estimular a invasão. As células que têm uma maior capacidade invasiva irão invadir através do filtro revestido matriz extracelular com uma frequência mais elevada e aderir ao lado de baixo do filtro. Nós modificamos este ensaio, a fim de avaliar o papel da microglia e tumorais macrófagos associados na invasão de células de glioblastoma.

Temos sido capazes de determinar usando ensaios de co-cultura descritos neste artigo que microglia pode estimular a invasão de duas linhas de células de glioblastoma por 5 - 10 vezes 9,10. Isso reflete o que é observado em modelos animais de glioblastoma. Além disso, foi desenvolvido um ensaio de três invasão dimensional, onde as interações entre células de glioblastoma e macrófagos / microglia pode ser examinado mais diretamente. A extensão de invasão de células de glioblastoma estimulada por macrophaGES / microglia no ensaio 3D é comparável ao que é visto através da abordagem câmara de matriz revestido. Ensaios semelhantes foram anteriormente desenvolvidas para estudar interacções de carcinoma da mama com macrófagos durante a invasão 11-13. Ambos os métodos descritos neste artigo deve ajudar na capacidade de dissecar o mecanismo molecular (s) de macrófagos invasão / estimulada pela microglia de células de glioblastoma.

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Protocolo

1. etiquetagem fluorescente de células

Linhas de células de glioblastoma rótulo e microglia com corantes fluorescentes 9: Nota. Em alternativa, geração de linhas celulares que expressam constitutivamente proteínas fluorescentes, tais como GFP / RFP como descrito em 14.

  1. células da placa em uma placa de 6 poços de modo a que eles vão ser de 70 - 80% confluentes no dia da coloração. Para a linha de murino de células de glioblastoma GL261 e linha U87 celular de glioblastoma humano, placa 1 x 10 6 e 1,5 x 10 6 células, respectivamente em um disco de 6 cm 24 horas antes da coloração.
  2. Preparar a solução de corante fluorescente da mancha de células em DMSO e adicionar corante de 5 uM a meios de comunicação, qualquer meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ou meio isento de soro Macrófago Médio (MSFM), bem vórtice.
  3. Incubar as células com corante durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
  4. Remova a mídia contendo corantes e adicionar meio fresco (RPMI ou MSFM) para as células.
  5. Incubar as células durante 30 min. Nota: As células são agoramanchado e pronto para ser utilizado na experiência.

2. Pré-revestidos Ensaio Matrix Câmara Coculture Invasion

  1. Diferenciar células THP-1 usando acetato de miristato de forbol (PMA) 15.
    1. Placa 2 - 3 x 10 5 células THP-1 em 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS numa placa de cultura de 6 poços. Imediatamente após o plaqueamento adicionar PMA 100 nM e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
      NOTA: Após 48 horas, as células THP-1 que foram submetidos com êxito a diferenciação será aderente e se espalhar para o fundo da cavidade assumindo uma morfologia redonda.
    2. Remover PMA por lavagem uma vez com PBS 1x e substituir com frescos RPMI / FBS 10%. Esperar mais 48 horas até que as células estão prontos para usar no ensaio.
  2. Equilibrar câmaras de matriz pré-revestidos colocando-os num poço contendo 500 ul de meio por si só (sem soro) e adição de 500 ul de meios sozinho para o topo. Incubar as câmaras durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
    NOTA: Câmaras de Pré-revestidos foram comprados do fabricante; veja a tabela dos materiais / equipamentos.
  3. Para células (linhas de células de glioblastoma fluorescente etiquetado e as microgliais / macrófagos) retire delicadamente, ao remover a mídia a partir de células por aspiração. Lave as células no prato com 2 mM EDTA / PBS. Adicionar 500 ul de 2 mM de EDTA / PBS e incubar durante 5 - 10 min numa incubadora celular a 37 ° C e 5% de CO 2.
  4. Ressuspender as células em 5 ml de meio contendo 0,3% de Albumina de Soro Bovino (BSA).
  5. Centrifugar durante 5 minutos a 120 x g.
  6. Aspirar o sobrenadante e sedimento de ressuspender em meio BSA MSFM / 0,3% (para células GL261 e microglia) ou RPMI /% BSA a 0,3 (para U87 e as células THP-1) de tal modo que a concentração de células é igual a 1 x 10 6 células / ml . Use um hemocitômetro para contar as células.
  7. Adicionar 500 ul de meio / 0,3% de BSA por poço da placa de 24 poços.
  8. Remover o meio de câmaras, que têm sido equilibrada durante pelo menos 2 h (Passo 2.2). lugar chambeRS em poços contendo 500 ul de meio / BSA a 0,3% (passo 2.7).
  9. Se inibidores estão a ser utilizados para estudar o seu efeito sobre macrófagos / microglia estimuladas invasão glioma, adicionar a concentração apropriada para o fundo e as porções superiores da câmara.
    NOTA: As concentrações de CSF-1R inibidor utilizado para inibir totalmente a microglia estimuladas GL261 invasão glioblastoma pode ser encontrado na referência 9.
  10. Dependendo das linhas celulares utilizadas, adicionar células à câmara de topo como descrito nos seguintes dois passos: glioblastoma rato (2.10.1) e de glioblastoma humano (2.10.2).
    1. Misture 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 ul) e 5 x 10 4 microglia rato (50 ul) (veja o passo 2.6 para detalhes de mídia). Levar o volume a 500 mL por adição de 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Adicionar mistura de células na câmara de topo e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
      NOTA: microglia de murino são isoladas a partir de ratinhos neonatais como descrito iN 1 6.

Misture 7,5 x 10 4 U87 (glioblastomas) células (75 uL) e células de 2,5 x 10 4 THP1 (macrófagos) (25 ul). Levar o volume a 500 mL por adição de 400 ul de RPMI / BSA a 0,3%. Adicionar a mistura de células à câmara superior. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas.

  1. Após a incubação, remover as células da parte superior da câmara através de ligeira aspiração e corrigir câmaras, colocando em 3,7% de formaldeído em PBS. Permitir câmaras de permanecer em fixador durante 15 min à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C). Remover fixador por aspiração suave e substituir com 500 mL de 1x PBS. Avance para a secção 4 para análise de imagem.
    NOTA: Experiência pode ser pausado, neste momento, e salvo para geração de imagens em 1x PBS. sinais de corante fluorescente pode ser detectado por até 2 semanas após a sua fixação.

3. Invasão de Ensaio "3D" Embedding glioma e macrófagos / Microglia em Matrix

  1. Descongelar matriz mistura a 4 ° C durante a noite. Executar todas as outras manipulações usando matriz no gelo no capô.
  2. Prepare a 10 mg / ml de concentração da matriz em meio (RPMI ou MSFM) com 0,3% de BSA em gelo.
    NOTA: da concentração de matriz é tipicamente cerca de 15 mg / ml.
  3. Para preparar células (marcadas no passo 1) de suspensão, em matriz, remover a mídia a partir de células por aspiração. Lave as células no prato com 2 mM EDTA / PBS. Adicionar 500 ul de 2 mM de EDTA / PBS às células e incuba-se durante 5 - 10 min no incubador a 37 ° C e 5% de CO 2.
  4. Ressuspender as células em 5 ml de meio contendo 0,3% de BSA.
  5. Centrifugar durante 5 minutos a 120 x g.
  6. Aspirar o sobrenadante da pelete. Ressuspender o sedimento em meios / 0,3% de BSA de tal modo que a concentração de células é igual a 1 X 10 6 células / ml. Use um hemocitômetro para contar as células.
  7. Adicionar 1,5 x 10 5 células GL261 (em 150 uL) + 5 x 10 4 células microgliais (no 50 ul) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.Adicionar 2 x 10 5 células GL261 (200 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado.
    NOTA: As células GL261 sozinho sem microglia serve como um controlo.
  8. células de spin em microcentrífuga durante 5 min a 120 x g.
  9. Ressuspender as células em 200 ul matriz de frio no gelo.
  10. Placa 50 uL (50.000 células) para o centro do topo do compartimento de 8 uM inserção câmara de tamanho de poro.
  11. Incubar a 37 ° C durante 30 min para a polimerização ocorra.
  12. Adicionar meio isento de soro de 200 ul para a câmara superior e contendo o meio de crescimento de células de 700 ul de soro para o poço inferior.
  13. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
  14. Após a incubação, remover as células da parte superior da câmara através de ligeira aspiração e corrigir câmaras, colocando em 3,7% de formaldeído em PBS. Permitir câmaras de permanecer em fixador durante 15 min à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C). Remover fixador por aspiração suave e substituir com 500 mL de 1x PBS. Avance para a secção 4 foanálise de imagem r.

4. Ensaios de imagem

  1. Remover câmaras de 3,7% de formaldeído e lave em poços contendo fresco 500 mL 1x PBS.
    NOTA: Não permita que as câmaras para secar.
  2. Usando um aplicador de algodão com ponta, suavemente limpar as células não invasivas a partir da porção superior do filtro (lado voltado para o interior da câmara) por raspagem da superfície do filtro. Comece devagar e aumentar a pressão gradualmente. Faça isso pelo menos 3 vezes por câmara.
  3. Coloque câmaras em qualquer um prato de vidro de fundo ou deixar em uma placa de 24 poços.
  4. Coloque amostra no palco de um epifluorescência ou confocal a laser microscópio de fluorescência equipado com câmera e captura de imagem de software 9,10.
  5. Levar vários 10X ou 20X imagens de campos representativos.
  6. Utilizando um software de análise de imagem, tal como ImageJ, contar o número de células de glioblastoma que tenham atravessado o filtro para o lado de baixo 9,10.
  7. Se imagiologia do "3D. "Ensaio de invasão (descrito no ponto 3), gerar uma série Z pilha usando um laser fluorescente microscópio confocal 5-6 para a imagem da população de células invasivas sobre o lado de baixo do filtro, seguir o protocolo passos 4,2-4,6 descrito acima.

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Resultados

Usando os métodos descritos aqui, temos mostrado que microglia e macrófagos podem estimular substancialmente a invasão de células de glioblastoma. Dois ensaios de invasão diferentes são empregues e estão representados na Figura 1. Na Figura 2, as células que expressam constitutivamente GL261 a proteína fluorescente mCherry foram semeadas em câmaras de pré-revestidas, com e sem a microglia durante 48 h. células GL261 foram minimamente invasiva por conta p...

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Discussão

A natureza altamente invasiva de astrocitoma de alto grau e glioblastoma fazer estes cancros cerebrais muito mortal. Por isso, é de suma importância para compreender os mecanismos moleculares e celulares da invasão glioblastoma. Muito se aprendeu sobre o processo de glioblastoma invasão já 17. Usando os formatos de ensaio detalhados neste papel, nosso laboratório tem demonstrado em ambos mouse e modelos humanos que associados a tumores macrófagos pode estimular a invasão de células de glioma por 5-10 vezes. E...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Konstantin Dobrenis por fornecer microglia murina para esses estudos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmara de Invasão de Matrigel BioCoat Corning: Com Matriz Matrigel BDCorning/Fisher ScientificCat: 354481
Mídia Livre de Soro de Macrófagos (MSFM) (500 ml)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Molecular ProbesC34552
CellTracker Green CMFDA DyeLife Technologies/Molecular ProbesC2925
Linha celular GL261National Cancer Institute (NCI)
Linha celular U87Coleção americana de cultura de tipo de tecidoHTB-14
Linha celular THP-1Coleção americana de cultura de tipo de tecidoATCC TIB-202
RPMI 1640 Médio (500 ml)Life Technologies / Gibco11875-093
Solução de formaldeídoSigma AldrichF1635
Corning Transwell inserções de cultura de células de membrana de policarbonato (8 µ M poro) 48 por pacote.CorningCLS3422
Cultrex 3-D Matriz de Cultura Fator de Crescimento Reduzido Extrato de Membrana Basal, PathClearTrevigen3445-005-01
Soro Fetal de Bezerro (FBS)Life TechnologiesCat: 10500064
Soro Bovino Albumina, Fração V, Tratado com Choque TérmicoFisherscientificBP1600-100
0.5 M EDTAThermoFisher Scientific15575-020
forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma AldrichP8139-1MG

Referências

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