Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Resumo

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Resumo

glioblastoma multiforme (IV glioma grade) é um câncer humano muito agressivo com uma sobrevida média de diagnóstico pós 1 ano. Apesar do aumento da compreensão dos eventos moleculares que dão origem a glioblastomas, este cancro continua a ser altamente refractário ao tratamento convencional. A ressecção cirúrgica de tumores cerebrais de alto grau raramente é completa devido à natureza altamente infiltrativa de células de glioblastoma. abordagens terapêuticas que atenuam a invasão de células de glioblastoma, portanto, é uma opção atraente. O nosso laboratório e outros mostraram que o tumor macrófagos e microglia (macrófagos residentes de cérebro) estimulam fortemente a invasão glioblastoma associados. O protocolo descrito neste documento é usado para modelar glioblastoma e macrófagos / microglia interação utilizando ensaios in vitro de cultura. Esta abordagem pode facilitar grandemente o desenvolvimento e / ou descoberta de drogas que interrompem a comunicação com os macrófagos que permite que este behav malignoeu ou. Nós estabelecemos dois ensaios de co-cultura de invasão robustos, onde microglia / macrófagos estimulam a invasão de células de glioma por 5-10 vezes. células de glioblastoma marcadas com um marcador fluorescente ou constitutivamente expressando uma proteína fluorescente foram semeadas com e sem macrófagos / microglia em insertos de câmara de policarbonato revestidos de matriz ou embebida numa matriz tridimensional. invasão celular é avaliada por microscopia de fluorescência usando a imagem e contam apenas as células invasivas sobre o lado de baixo do filtro. Usando estes ensaios, vários inibidores farmacológicos (JNJ-28312141, PLX3397, gefitinib, e Semapimod), foram identificados que bloqueiam macrófagos / microglia estimulou invasão glioblastoma.

Introdução

Glioblastoma multiforme é um câncer de cérebro humano agressivo com uma sobrevida média de aproximadamente 12 meses a partir do momento do diagnóstico ^1,2. Glioblastoma é um dos cancros mais mortais e clinicamente desafiadoras como é refratário à quimioterapia padrão e ressecção cirúrgica. A natureza difusa do glioblastoma permite que as células tumorais se espalhar por todo o cérebro normal, fazendo com que o tumor avançado praticamente impossível para ressecar cirurgicamente completamente. Este aspecto altamente invasivo é uma característica marca de glioblastoma e outros astrocitomas avançados. Portanto, o foco de muita pesquisa tem sido sobre o mecanis....

Protocolo

1. etiquetagem fluorescente de células

Linhas de células de glioblastoma rótulo e microglia com corantes fluorescentes ^9: Nota. Em alternativa, geração de linhas celulares que expressam constitutivamente proteínas fluorescentes, tais como GFP / RFP como descrito em ^14.

1. células da placa em uma placa de 6 poços de modo a que eles vão ser de 70 - 80% confluentes no dia da coloração. Para a linha de murino de células de glioblastoma GL261 e linha U87 celular de glioblastoma humano, placa 1 x 10 ⁶ e 1,5 x 10 ⁶ células, respectivamente em um disco de 6 cm 24 horas antes da coloração.
2. Preparar a soluçã....

Resultados

Usando os métodos descritos aqui, temos mostrado que microglia e macrófagos podem estimular substancialmente a invasão de células de glioblastoma. Dois ensaios de invasão diferentes são empregues e estão representados na Figura 1. Na Figura 2, as células que expressam constitutivamente GL261 a proteína fluorescente mCherry foram semeadas em câmaras de pré-revestidas, com e sem a microglia durante 48 h. células GL261 foram minimamente invasiva por conta p.......

Discussão

A natureza altamente invasiva de astrocitoma de alto grau e glioblastoma fazer estes cancros cerebrais muito mortal. Por isso, é de suma importância para compreender os mecanismos moleculares e celulares da invasão glioblastoma. Muito se aprendeu sobre o processo de glioblastoma invasão já ^17. Usando os formatos de ensaio detalhados neste papel, nosso laboratório tem demonstrado em ambos mouse e modelos humanos que associados a tumores macrófagos pode estimular a invasão de células de glioma por 5-10 vezes. E.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de Invasão de Matrigel BioCoat Corning: Com Matriz Matrigel BD	Corning/Fisher Scientific	Cat: 354481
Mídia Livre de Soro de Macrófagos (MSFM) (500 ml)	Life Technologies	12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye	Life Technologies/Molecular Probes	C34552
CellTracker Green CMFDA Dye	Life Technologies/Molecular Probes	C2925
Linha celular GL261	National Cancer Institute (NCI)
Linha celular U87	Coleção americana de cultura de tipo de tecido	HTB-14
Linha celular THP-1	Coleção americana de cultura de tipo de tecido	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Médio (500 ml)	Life Technologies / Gibco	11875-093
Solução de formaldeído	Sigma Aldrich	F1635
Corning Transwell inserções de cultura de células de membrana de policarbonato (8 µ M poro) 48 por pacote.	Corning	CLS3422
Cultrex 3-D Matriz de Cultura Fator de Crescimento Reduzido Extrato de Membrana Basal, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Soro Fetal de Bezerro (FBS)	Life Technologies	Cat: 10500064
Soro Bovino Albumina, Fração V, Tratado com Choque Térmico	Fisherscientific	BP1600-100
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020
forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma Aldrich	P8139-1MG