Artigo de método

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

DOI:

10.3791/53994

⸱

14 de maio de 2016

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos um método de microscopia de lapso de tempo de longo prazo para rastrear longitudinalmente células individuais em resposta à terapêutica anticâncer.

Resumo

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A resposta de células únicas para fármacos anti-cancro contribui significativamente para a determinação da resposta da população, e, portanto, é um factor importante que contribui para o resultado global. Immunoblotting, citometria de fluxo e experimentos com células fixas são frequentemente usados ​​para estudar como as células respondem a drogas anti-câncer. Estes métodos são importantes, mas eles têm várias deficiências. A variabilidade nas respostas ao fármaco entre o cancro e as células normais, e entre células de cancro de origem diferente, e transiente e respostas raras são difíceis de entender utilizando ensaios de média da população e sem ser capaz de controlar directamente e analisá-las longitudinalmente. O microscópio é particularmente bem adequado para células vivas imagem. Os avanços na tecnologia permitem-nos rotineiramente células de imagens em uma resolução que permite não só o acompanhamento de células, mas também a observação de uma variedade de respostas celulares. Nós descrevemos uma abordagem pormenorizada que permita a imagem contínua de lapso de tempo decélulas durante a resposta da droga para, essencialmente, desde que desejado, tipicamente até 96 horas. Utilizando variantes da abordagem, as células podem ser monitorados durante semanas. Com o emprego de codificados geneticamente biossensores fluorescentes numerosos processos, caminhos e respostas pode ser seguido. Mostramos exemplos que incluem acompanhamento e quantificação do crescimento celular e na progressão do ciclo celular, a dinâmica de cromossomas, danos no ADN e morte celular. Discutimos, também, variações da técnica e sua flexibilidade, e destacar algumas armadilhas comuns.

Introdução

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microscopia de células vivas e acompanhamento longitudinal de células individuais não é uma técnica nova. Desde os primeiros microscópios, os entusiastas e cientistas têm observado e estudado células individuais e organismos, seus comportamentos e desenvolvimento 1-3. Um exemplo famoso do falecido David Rogers na Universidade de Vanderbilt na década de 1950 mostra um neutrófilo humano em um esfregaço de sangue perseguindo uma bactéria Staphylococcus aureus e, eventualmente, o processo de fagocitose 4. Este filme-célula viva é um excelente exemplo de como os processos múltiplos podem ser observados e correlacionados em um único experimento: detecção de um gradiente químico, mecânica e velocidade da motilidade celular, celular formas dinâmicas, adesão e fagocitose de um patógeno.

O advento de microscópios totalmente automatizados e câmeras digitais altamente sensíveis resultou em um aumento do número de investigadores por meio de microscopia de fazer perguntas fundamentais em biologia celular variando from como as células mover 5,6 e dividir 7,8 a organela dinâmica e tráfico de membrana 9-11. Não fluorescente, microscopia de campo claro, inclusive de contraste de fase (PC), que recebeu o Prêmio Nobel de Frits Zernike em 1953, e contraste de interferência diferencial (DIC) permitem a observação de células e núcleos, mas também estruturas sub-celulares, incluindo feixes de microtúbulos , cromossomas, nucléolo, dinâmica de organelos, e fibras de actina grossas 12. Geneticamente codificado proteínas fluorescentes e no desenvolvimento de corantes fluorescentes contra organelas têm impactado drasticamente a microscopia de lapso de tempo 13-15. Embora não seja o foco deste artigo, a imagem latente em esferóides celulares e in situ (microscopia intravital) usando confocal e microscopia multiphoton representam uma nova expansão da abordagem, e há artigos pendentes que usam e discutir estas abordagens 16-19.

As respostas de células a anti-Cancer drogas ou produtos naturais são determinados na escala molecular e celular. Compreender as respostas das células e destinos após o tratamento muitas vezes envolve a população ensaios de média (por exemplo., Immunoblotting, medidas bem inteiras), ou pontos de tempo fixos com a detecção de imunofluorescência e citometria de fluxo, que medem células individuais. A heterogeneidade das respostas de células únicas para fármacos dentro de uma população, em especial em tumores, pode explicar alguns dos a variabilidade na resposta observada através de linhas de células e tumores que são tratados com o mesmo fármaco em saturação. A longo prazo abordagens longitudinais seguir uma dada célula individual ou uma população de células é uma abordagem menos comum mas muito poderosa que permite o estudo directo de vias de resposta moleculares, diferentes fenótipos (por ex., Morte celular ou a divisão celular), a observação de variabilidade célula-a-célula dentro de uma população, e como estes factores contribuem para a dinâmica de resposta população 20-22. Optimista, podendopara observar e quantificar respostas de célula única vai ajudar a melhorar a nossa compreensão de como os medicamentos funcionam, por que eles às vezes não, e como melhor utilizá-los.

A técnica de microscopia de longo prazo de lapso de tempo, o acompanhamento longitudinal e análise das respostas de drogas está disponível para muitos investigadores e pode ser simples, usando a luz transmitidas apenas para observar respostas fenótipo 20,21. Os principais componentes da abordagem incluem: preparação adequada das células de interesse, um microscópio automatizado com câmara ambiental, uma câmera integrada com um computador para adquirir e armazenar as imagens e software para analisar o lapso de tempo e medir e analisar as células e quaisquer biossensores fluorescentes. Nós fornecemos um protocolo detalhado com muitas dicas para a realização de microscopia de lapso de tempo de células cultivadas, enquanto vários dias usando claro e / ou microscopia de epifluorescência widefield. Este protocolo pode ser utilizado para qualquer linha de células que podem ser cultivadas em culturapara estudar as suas respostas às terapias anti-câncer. Nós fornecemos exemplos de dados adquiridos e analisados ​​utilizando vários biossensores fluorescentes geneticamente codificados diferentes e um exemplo de microscopia de contraste de fase, discutir brevemente os diferentes tipos de sondas, as vantagens e desvantagens de longo prazo de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal, o que pode ser aprendidas para esta abordagem que é difícil de compreender a partir de abordagens não-directos, e algumas variações que esperamos que venha a ser de interesse e valor para pesquisadores inexperientes que não ter considerado usando a abordagem, e para investigadores experientes.

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Protocolo

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O protocolo seguinte utiliza parâmetros definidos pelas experiências nas Figuras 4 e 6 com respeito às definições de aquisição e condições experimentais. Muitos destes parâmetros pode ser modificado para caber outras experiências (isto é, os tempos de exposição, binning, canais fluorescentes, etc.). Todos os procedimentos devem aderir às diretrizes e regulamentos institucionais e ser aprovado pela comissão de biossegurança institucional. Web site do fabricante de microscópio contém excelentes informações para imagens de células vivas.

1. Microscópios e Software Imaging

  1. Execute imagens de células vivas em uma ampla variedade de microscópios invertidos. Os microscópios mais comuns são widefield epifluorescência e confocal girando-disco. Aqui, usar um microscópio automatizado e motorizado widefield epifluorescência, com fonte de luz de iodetos metálicos de 200 watt.
  2. Obter um estágio-top ou um microscópio câmara ambiental. Aqui, usar uma etapa-tcâmara ambiental op.
  3. Use um software comercial para operar microscópios com utilitários para executar a microscopia de lapso de tempo.
  4. Use software disponível comercialmente ou ImageJ para análise de imagem. Muitas outras ferramentas de análise estão disponíveis comercialmente, e há programas feitos sob medida, muitos dos quais foram publicados 8,18.

2. A visualização de processos celulares e respostas fenotípicas

  1. Visualize as células com microscopia de campo claro. Diferencial de contraste de interferência e de contraste de fase por si só pode ser muito informativo para estudar as respostas para as respostas de drogas anti-cancro. Estes processos podem incluir a mitose, a motilidade celular e a apoptose.
  2. Visualizar estruturas celulares, organelas e processos com biossensores fluorescentes. As sondas fluorescentes são informativos no rastreamento de processos subcelulares específicos. Estes podem incluir dinâmica dos microtúbulos, mitocondrial e da dinâmica do retículo endoplasmático, o acúmulo de proteína e localização, esinalização molecular (por ex., fosforilação, cálcio).

3. Preparação de Amostras

  1. Cultivar células em pratos de cultura de células certificados num padrão, incubadora humidificada de cultura de células (por exemplo, 37 ° C, 5% de CO2, 80% de humidade relativa).
    1. Cultivar células HT1080 em MEM com EBSS. Suplementar o meio com 10% v / v de FBS, 1% v / v de Pen / Strep a 1% v / v de piruvato de sódio e 1% v / v de aminoácidos não-essenciais.
  2. Dois dias antes da imagem, as células placa 50.000 HT1080 Fucci em 3 poços de uma de 12 poços prato fundo # 1.5 de vidro em uma capa de fluxo laminar estéril certificada. Ajustar o número de células plaqueadas para alcançar ~ 60% de confluência para o início da experiência. Dependendo da linha celular e a natureza da experiência a densidade celular pode ser menos.
    Nota: A densidade celular pode ter grande influência sobre o crescimento da linha celular e os resultados experimentais. Contagem de células para minimizar experimento-a-experimento variability devido à densidade.
    1. Dependendo da câmara ambiental e as condições necessárias para a experiência, as células em pratos de placas único poço (tipicamente 35- ou 60-mm), 4 bem placas de 35 mm, 6-, placas de cultura de células de 12 ou 24 cavidades, ou lamela slides em vários formatos. Utilize placas com fundo de vidro com vidro # 1.5 como a maioria das lentes objetivas são otimizados para esta espessura do vidro, e imagens através de plástico de cultura de células é muito pobre.
      Nota: Algumas linhas celulares não crescer e sobreviver em vidro. Nestes casos, o vidro pode ser revestido, a fim de melhorar a aderência das células (por ex., Poli-lisina ou colagénio). Algumas empresas fabricam plástico de cultura de células ópticas, é necessário determinar empiricamente se esta é uma opção viável.

4. Câmara Ambiental Set-up

  1. Antes de qualquer experimentação, definir-se a câmara com ambiente de modo a que opera em ~ 80% de humidade e assim a temperatura à posição da amostra é de 37 ° C. A maioria das células cultivadas crescem em 5% de atmosfera de ar, CO 2 / equilíbrio devido ao tampão de bicarbonato de sódio no meio. Dependendo da configuração, defina o controlador ambiental a 5% de CO 2 e vai misturar 100% CO 2 com o ar, ou use pré-misturado, certificada 5% de CO 2 / balanço de gás de ar. Siga as instruções do fabricante para o gás de caudais.
    Nota: Alguns linhas de células crescer em meio de CO 2 -independente, caso em que pode ser mantido sem CO 2. meios de imagem concebidas especificamente está também disponível que limita a adição de compostos autofluorescentes. Crescimento em meios de teses para o tipo de célula desejado deve ser previamente determinada empiricamente.
  2. Antes da imagem, certifique-se o reservatório de água está cheio (seguindo as instruções do fabricante) com água destilada estéril. Ligue a câmara ambiental para o ajuste de temperatura desejada e coloque-o na inserção palco microscópio. Para poupar gás, não ligue o fluxo neste momento.
    Nota: Se houver algum espaço livre entre a câmara de estágio-top e inserir estágio e / ou qualquer tensão em cabos de ligação para a câmara pode introduzir artefatos de movimento para o experimento.
    1. Coloque pedaços de filme de parafina sobre as bordas da abertura de inserção estágio antes de inserir a câmara para ela, para acoplar a câmara para o palco, e se certificar de que não há conexões estão puxando na câmara.
  3. Permitir que a câmara de equilibrar a 37 o C. Manter uma temperatura estável para evitar flutuações de temperatura durante o exame que pode afetar a fisiologia celular e introduzir deriva. Alcançar equilíbrio de temperatura geralmente requer de 30 min a 1 hora, dependendo do ambiente.
    1. Insira um prato 'fictício' com água nos poços para a câmara durante o aquecimento. Um prato de imagem cheio com água imita a amostra, ajudando a garantir que a câmara seja suficientemente aquecido e estabilizada. Enchendo a câmara com água estéril pré-aquecidoreduz o tempo necessário à estabilização da temperatura e minimiza a queda de temperatura após a adição da amostra experimental.

5. Microscópio Set-up

  1. Ligue o microscópio, computador associado, e todos os periféricos necessários.
    1. Dependendo da fonte de luz, espere para ligá-lo até que seja necessário (por exemplo., LED).
  2. Com o objectivo de torre numa posição baixa, seleccionar a 20X 0,7 NA objectivo de ser utilizada.
  3. Coloque a amostra sobre o objetivo - o que irá torná-lo mais fácil de encontrar as células quando a amostra está na câmara.
  4. Definir parâmetros de imagem neste momento, se eles são conhecidos a partir de experiências anteriores.

6. Transportando Células de microscópio e para a câmara

  1. Transportar as células a ser trabalhada a partir da incubadora para a câmara ambiental. Garantir que isso seja feito rapidamente para limitar os efeitos de um comparativamente baixo CO 2 atmosfera e diminuição da temperatura sobre as células. Siga todas as normas de biossegurança institucionais para transporte de amostras e clean-up em caso de um derramamento.
    1. Coloque as células em um recipiente de isopor selada ou saco isolados para evitar grandes mudanças ambientais.
  2. Insira o prato imaging amostras para a câmara seguindo as instruções do fabricante.
  3. Depois que as células foram garantidos dentro da câmara ambiental, selar a câmara para manter um ambiente estável e desligue imediatamente a fonte (s) de gás atmosférico.
    1. Como algumas câmaras ambientais não utilizam uma tampa apertada, selado, para retardar a evaporação, a camada estéril, óleo mineral certificada-embrião no topo do meio de crescimento. Envolver a película de parafina gás permeante em torno do perímetro-bordas do prato de amostras tomando cuidado para não obstruir a área de imagem de vidro. , os métodos de humidificação secundárias localizadas podem ser empregues. A condensação na tampa do prato de amostras pode diminuir desemmance de microscopia de campo claro.
  4. A fim de minimizar os efeitos da deriva térmica mais cedo durante o experimento, espere 30 minutos antes de iniciar o lapso de tempo. O tempo necessário varia com base no tamanho do prato de imagens e de outros factores. Determinar empiricamente.

7. Configurando Imaging

  1. condições de imagem Seleccione que melhor representam os dados. Tomar precauções para evitar fototoxicidade, limitando o tempo de exposição, utilizando menor intensidade de luz e selecionando sondas que são excitados por longos comprimentos de onda da luz.
  2. Definir X, Y e Z-plano e desejado comprimento de onda (s) para cada posição a ser trabalhada. A resolução de tempo é limitado pelo número de posições e comprimentos de onda. Para longo prazo de lapso de tempo da maioria dos processos celulares, adquire uma imagem a cada 10-20 min; maior resolução de tempo (intervalos curtos, por exemplo., 1 min) fornece mais pontos de dados de seguimento e de células, por conseguinte, mais robusta, mas também resulta em mais integradaexposição à luz e conjuntos de dados maiores.
    1. Como HT1080 FUCCI têm proteínas fluorescentes verde e vermelho dinâmicas (ver resultados representativos), use os seguintes tempos de exposição: FITC / GFP - 50 ms, Texas Red / TRITC - 40 ms, campo claro - 20 ms. Use uma lata de 2 x 2.
  3. Ativar a focagem automática controlada software usando os parâmetros padrão em Configurações avançadas. Definir um intervalo de focagem automática de 10 mm com o tamanho recomendado etapa. Certifique-se de fazer isso antes de iniciar o lapso de tempo. Autofoco com imagens de campo claro e nunca com fluorescência para reduzir fototoxicidade e fotodegradação.
    1. Utilizar sistemas de focagem automática de software controlado em qualquer microscópio com um palco motorizado, e concentrar-se directamente sobre a amostra. No entanto, eles podem limitar a velocidade de aquisição do experimento. Hardware controlado sistemas com foco contínuo funcionar bem para a microscopia de lapso de tempo e melhorar a velocidade, permitindo mais posições a ser trabalhada ou uma maior taxa de aquisição. No entanto, elesconfiar na detecção da interface ar-vidro e pode perder o foco da amostra com variações na espessura do vidro através do poço.
  4. Substituir metade da mídia com a mídia contendo a concentração da droga desejado que tenha sido aquecido a 37 o C. substituição da mídia parcial ajuda a reduzir a dispersão térmica. As condições deste experimento são Veículo (DMSO), 1 mM selinexor e 10 mM PD0332991.
    Nota: Esta etapa também pode ser feito depois de iniciar a aquisição, fazendo uma pausa e reiniciar o experimento. Isto permite o acompanhamento das respostas longitudinal pré e pós-droga de células individuais. Se a estabilidade da droga ou o metabolismo é uma preocupação, parando e substituindo os meios podem ser feitos com o mesmo método. Para testar a degradação ou metabolismo de drogas, meios de células tratadas podem também ser colocadas em células naive para testar a acção do fármaco.
  5. Comece o lapso de tempo.
  6. À medida que o lapso de tempo é executado, garantir que os campos fotografada permanecem no foco eo chamber mantém uma úmido 37 o C.
    1. Ajustar o foco, conforme necessário, fazendo uma pausa a aquisição durante o intervalo de tempo entre pontos de tempo.
  7. Se necessário, adicione água para a câmara durante as experiências mais longas. Evitar o arrefecimento da câmara através da adição de pré-aquecido, a água destilada estéril a 37 o C.

8. Acabar com a Time-lapse

  1. Quando o experimento foi executado para conclusão, parar a aquisição se não foi definido para parar automaticamente.
  2. Certifique-se de que o lapso de tempo foi salva corretamente para o disco rígido, embora a maioria dos pacotes de software de salvar automaticamente durante a aquisição se não for concluído de forma adequada os dados podem ser perdidos.
  3. Retire a câmara do microscópio e eliminar as células para resíduos com risco biológico seguindo procedimentos de biossegurança institucional aprovados.

9. Acompanhamento Longitudinal e Análise de Time-lapse de dados

  1. Escolha a metodologia de análise que éapropriado para o processo biológico de interesse. Muitos plugins para ImageJ, programas Matlab e plataformas personalizadas foram produzidas para aplicações específicas. A seguinte metodologia abrange acompanhamento dos núcleos e análise de sondas fluorescentes nucleares como demonstrado nas Figuras 4 e 5.
  2. Abra as pilhas de imagens .tif para os canais utilizados em ImageJ. Alternativamente, arquivos nativos abertas a partir do programa de aquisição diretamente no ImageJ usando o plugin Bioformats.
  3. Desenhe uma região de interesse (ROI) dentro do núcleo de uma célula usando a imagem de campo claro ou o canal rótulo nuclear (se utilizado) e adicioná-lo ao gerente do ROI. Nota: Se as células fotografadas tem uma etiqueta nuclear (por exemplo, a histona H2B-EGFP.), Seguida de seguimento automático de células pode ser utilizado para criar as regiões de interesse (ROI) que representa núcleos individuais ao longo do tempo.
  4. Avance para o próximo ponto de tempo e posicione o ROI dentro do mesmo nucleus. Adicione o ROI com o gerente de ROI.
  5. Continuar a controlar e fazer ROIs para a célula individual até que haja um evento celular (mitose, apoptose, etc.) Ou a célula já não podem ser rastreados (isto é., Move-se para fora da armação ou a experiência termina).
  6. Quando ROIs foram estabelecidas para as células através do tempo eles estão no campo, sobrepô-las para os canais fluorescentes de interesse. Medir a intensidade média da fluorescência em cada canal para cada ponto de tempo. Salvar a lista de ROI para uso posterior.
    1. Várias medidas podem ser feitas dentro do ROI para aplicações em diferentes experimentos. Clique Análise → Definir Medidas ... para abrir um menu para escolher o método analítico (por exemplo., A intensidade dentro do ROI, intensidade integrada, etc dizer.).
  7. Nota destinos celulares de células individuais (eg., Apoptose, divisão, de sobrevivência), enquanto rastreamento. Isto permite a criação de curvas de sobrevivência e furtheanálise da população r.
  8. Com a intensidade média para os dois canais, criar um gráfico de dispersão para exibir dinâmica do ciclo celular em resposta a agentes terapêuticos (Figura 5B, C).
    Nota: A parcela pode ser criado para células individuais ao longo do tempo ou, calculados sobre uma população de células controladas. imagiologia quantitativa pode ser crucial para o estabelecimento de respostas complexas e relações de células em resposta à terapêutica do cancro. Microscopia de lapso de tempo de longo prazo, o acompanhamento longitudinal e análise de dados é um processo multi-passo, com muitas opções para o tipo de ferramentas de microscopia e análise, e segue o contorno geral previsto na Figura 1.

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Resultados

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Longo prazo microscopia de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal direta permite o estudo de muitos efeitos anti-câncer durante a resposta à droga. Seguindo o esquema geral na Figura 1, vários exemplos de células são mostradas expressar repórteres fluorescentes validados que tratada com drogas anti-cancro, rastreados e analisados ​​utilizando diferentes abordagens.

Microscopia de contraste de fase por si...

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Discussão

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Vantagens de Microscopia Time-lapse e Acompanhamento Longitudinal

O microscópio é um instrumento ideal para os estudos longitudinais de resposta à droga, uma vez que permite aos investigadores para rastrear as células individuais e os seus destinos, bem como a totalidade da população. A variabilidade na resposta à droga dentro de uma população de células é uma questão importante para anti-câncer projeto terapêutico. acompanhamento longitudinal de células individuais permite ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Joshua Marcus pelo suporte técnico e a Jolien Tyler, Ph.D., Diretor do Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, pelo aconselhamento técnico. Este trabalho foi apoiado por fundos da University of Colorado Boulder e da University of Colorado Boulder Graduate School para J.D.O. R.T.B. é parcialmente apoiado por uma bolsa de treinamento de pré-doutorado do NIH (T32 GM008759). Agradecemos à Karyopharm Therapeutics, Inc. pelo selinexor e à Merck Serono pelo inibidor de Kinesin-5. Os plasmídeos FUCCI são de Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japão) via MTA. mCherry-BP1-2 era de Addgene. HeLa expressando H2b-mCherry e β-tubulina-EGFP são de Daniel Gerlich (IMBA, Academia Austríaca de Ciências, Áustria).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Taxol (paclitaxel)SigmaT7191medicamento estabilizador de microtúbulos
EtoposídeoSelleckchemS1225inibidor da topoisomerase II
SelinexorKaryopharm Therapeuticseinibidor XPO1/CRM1, presente
Inibidor de Kinesina-5Merck Seronoepresente, também disponível na American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
Meio de crescimento celularHyClone (Fisher) ou Mediatechmuitas empresas disponíveis
5% CO2 / ar de equilíbrio, certificadoAirgasZ03NI7222004379
35 mm Prato, fundo de vidro de 20 mmCellvisD35-20-1.5-Nmuitas empresas disponíveis
35 mm Prato de 4 poços, fundo de vidro de 20 mmCellvisD35C4-20-1.5-Nmuitas empresas disponíveis
Prato de 35 mm, fundo de vidro quadriculadoMatTekP35G-2-14-CGRDmuitas empresas disponíveis
Multi-poços, fundo de vidroCellvisP12-1.5H-Nmuitas empresas disponíveis
Microscópio de epifluorescência invertida Olympus IX81Controlador Olympus
Olympus IX2-UCB Olympus
PRIOR LumenPro200Prior ScientificLumen200PRO
PRIOR Proscan III estágio motorizadoPrio ScientificH117
STEV câmaraInVivo ScientificSTEV. ECU. Unidade de Controlador Ambiental HC5 STAGE TOP
InVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD com controladorHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon
Nikon lançamento a laserNikon
SOLA motor de luzlumencor
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
TOKAI HIT câmara de inclubationTOKAI HITTIZSH

Referências

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