Introduction
Trotz der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit von Hepatozyten 1, die die Haupt Parenchymzelle Typ der Leber sind, beeinträchtigt chronischem Leberversagen diese Fähigkeit, die zu Lebervorläuferzellen (HPC) -abhängigen Regeneration 2.
Chronische Leberschäden wird hauptsächlich durch Alkoholmissbrauch, chronische Hepatitis - C - Virus (HCV) -Infektion 3 und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) 4 abgeleitet. Es führt zu einer nachhaltigen Leberfibrose, die mit der Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen assoziiert ist. Persistierende ECM Akkumulation verzerrt intakte Leber Architektur durch ein faseriges Narbengewebe 5 bilden, anschließend in Zirrhose mit hoher Morbidität und Mortalität führt. Viele Versuche sind unternommen worden , um die fibrotische Reaktion zu mildern , die hauptsächlich durch die Konzentration auf die Hemmung profibrogenen Zytokine und aktiviert Myofibroblasten 6. Letztere wird in erster Linie, abgeleitet von hepatischen Sternzellen (HSCs) das Prinzip der Leber nicht parenchymalen Zellen verantwortlich für die Leber Narbenbildung 4. Dennoch regenerative Therapien, die endogenen zellulären Quellen, einschließlich HPCs stimulieren Hepatozyten in Gegenwart von anhaltender fibrogen Beleidigungen erwarten eine weitere Untersuchung zu regenerieren.
Viele experimentelle Modelle der Leberfibrose wurde in Säugetieren beschrieben. Repetitive Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) wurde in großem Umfang verwendet , um Leberfibrose in Maus- und Rattenmodelle 7 induzieren. Wenn sie mit einem hohen Fett (HF) Diät kombiniert, führte Alkohol zu einer wesentlichen Heraufregulierung von profibrogenen Genexpression und Leberfibrose 8. Während Steatose (Fettansammlung) von einer akuten Alkoholexposition führt, macht es die Leber anfällig für mehr schwere Leberschädigung 9.
Der Zebrabärbling, Danio rerio, hat sich als eine unschätzbare wirbelModellSystem entstand Regeneration für das Studium. Obwohlanderen niederen Wirbeltiere wie Molche und Axolotl haben eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration, die Zebrabärbling hat Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in Bezug auf die Genmanipulation und Visualisierungsstrategien benötigt Potenzial regenerativer 10 Faktoren zu manipulieren. Der Zebrafisch stellt auch ein attraktives Vertebraten Modell für die Untersuchung alkoholische Lebererkrankung (ALD) durch einfaches Hinzufügen von Ethanol (EtOH), um ihr Wasser. Akute EtOH Exposition gegenüber Larven und erwachsenen Zebrafisch verursacht Hepatosteatose 13.11. Bei Erwachsenen Zebrabärbling erweiterten EtOH Belichtung erhalten, Kollagenablagerung wurde mit upregulation der Fibrose im Zusammenhang mit Genen 14 beobachtet. Es besteht jedoch ein Bedarf für die Entwicklung Modelle Leberregeneration in Reaktion auf EtOH als fibrogene Stimulus zu studieren.
Vor kurzem haben wir eine EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling 15. Wir kombiniert, um eine Hepatozyten-spezifischen genetischen Ablationssystem mit EtOH Behandlung in Larven- und adult Zebrabärbling. Wir erzeugten zwei transgenen Linien, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 und Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in denen E.coli Nitroreduktase (NTR) zu dem cyan fusioniert sind und mCherry fluoreszierendes Protein jeweils unter der Kontrolle der Hepatozyten-spezifischen Fettsäure - bindendes Protein 10a, Leber einfach (fabp10a) Promotor. In diesem System wandelt NTR eine nicht - toxische Prodrug Metronidazol (MTZ) in eine DNA Interstrang-Vernetzungsmittel 16, expliziter Tod von Hepatozyten zu induzieren. Mit diesem Modell haben wir gezeigt, dass eine Population von Leberzellen, die Signalisierungs Notch ansprechen, umgewandelt in Hepatozyten in naher Abwesenheit von Hepatozyten und im Überschuß von ECM. Wir bezeichneten diese Zellen als HPCs. Darüber hinaus wird durch chemische Bildschirme identifizierten wir kleine Molekül Aktivatoren der Wnt-Signal und Inhibitoren der Notch-Signalweg, die Hepatozyten-Regeneration in der fibrotischen Leber vermehren. Therefore, unser fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling stellt ein hervorragendes System chemisches Screening im Vergleich zu Zellkultur- oder Säugetier-basierte Screening-System. Es ist ein in vivo - System mit erheblichen Kosten- und zeitsparende Vorteile. Hier beschreiben wir die Einzelheiten der Verfahren zur Herstellung einer EtOH-induzierten Modell fibrotischen Leber und zur Durchführung chemischer Bildschirme unter Verwendung dieses Modells in Zebrabärbling. Darüber hinaus wurden der zeitliche Verlauf Analysen wie Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber auftritt, zu untersuchen durchgeführt. Dieses Protokoll wird ein unschätzbares Werkzeug zur Verfügung stellen, die Mechanismen und Strategien zur Verbesserung Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber zu studieren.
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Protocol
Zebrabärblinge wurden angehoben und unter Verwendung eines Standardprotokolls gezüchtet, die die Kriterien der National Institutes of Health erfüllt und vom Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Herstellung der Lösungen
- Es werden 20 L Ei Wasser (austauschbar mit "Embryo Medium" verwendet) embryonale / Larven Zebrabärbling zu halten. Man löst 1,5 g CaSO 4 und 6 g Instant Ocean Meersalz in 250 ml destilliertem Wasser. Gießen Sie in einen Kanister mit 20 l destilliertem Wasser gefüllt und agitieren.
- Bereiten Sie 1 L 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Stammlösung (20x). Man löst 0,6 g PTU Pulver in 1 l destilliertem Wasser. 1 ml der Stammlösung pro 20 ml Embryo Medium bis zu einer Endkonzentration von 0,003% als Arbeitslösung.
ACHTUNG: PTU systemische Toxizität nach Inhalation oder dermale Exposition führen kann. Vorbereiten und in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang mit verwenden. - Bereiten Sie 1 L Ethyl-3-aminobenzoate methansulfonat (Tricaine) Stammlösung (20x). Man löst 4 g Tricaine Pulver in destilliertem Wasser. PH-Wert auf 7 durch Zugabe von 1 M Tris-Puffer (pH 9) und bringe das Endvolumen auf 1 l mit destilliertem Wasser. Aliquot in 50 ml und bei -20 ° C. Tauen Sie vor dem Gebrauch.
ACHTUNG: Tricaine kann einen Verlust der Empfindung hervorrufen. Vorbereiten und in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang mit verwenden. - Bereiten Sie 100 ml Larven Metronidazol (MTZ) Arbeitslösung. Machen frischen 15 mM MTZ-Lösung durch Auflösen von 0,25 g MTZ-Pulver in 0,1% Dimethylsulfoxid (DMSO) in 100 ml embryo Medium. Man löst MTZ Pulver vollständig durch kräftiges Schütteln. Machen Sie frische MTZ-Lösung und Verwendung von Alufolie photokatalytischen Abbau von MTZ zu verhindern.
ACHTUNG: MTZ kann zu Reizungen führen. Vorbereiten und in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang mit verwenden. - Bereiten Sie 100 ml Larven Ethanol / Metronidazol (EtOH / MTZ) Arbeitslösung. Machen Sie frische MTZ-Lösung und nutzen Alufolie photokatalytischer de zu verhindernAbstufung der MTZ. 1,5 ml 100% Ethanol in 100 ml MTZ-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1,5% unmittelbar vor der Verwendung.
- Bereiten Sie 500 ml Erwachsenen MTZ Arbeitslösung. Machen Sie frische 10 mM MTZ-Lösung durch Auflösen von 0,83 g MTZ Pulver in 0,1% DMSO in 500 ml Wasser-System. Man löst MTZ Pulver vollständig durch kräftiges Schütteln. Machen Sie frische MTZ-Lösung und Verwendung von Alufolie photokatalytischen Abbau von MTZ zu verhindern.
- Bereiten Sie 1 L PEM-Puffer. Man löst 30,2 g PIPES, 0,74 g EGTA und 0,12 g MgSO 4 in destilliertem Wasser. PH-Einstellung auf 7 mit NaOH. Bringen endgültige Volumen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser.
2. Herstellung von Larval Zebrabärbling
- Richten Sie Paarung von [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 erwachsenen Zebrafisch mit Tg (hand2: EGFP) PD24 in Paarungs Tanks 13 erwachsenen Zebrafisch. Verwenden Teiler timed Paarung durchführen.
- Entfernen Sie die divider folgenden Morgen und lassen Sie Fisch ohne Unterbrechung zu paaren. Ernte Embryonen 2 Stunden später durch das System Wasser belasten und die Übertragung der Embryonen in 100 mm Petrischalen mit Embryo Medium.
- Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie unbefruchteten Eiern mit einer Glaspipette. Wachsen Embryonen bei 28 ° C und fügen Phenylthioharnstoff (PTU) bis zu einer Endkonzentration von 0,003% nach 10 Stunden post-Befruchtung (hpf) Pigment Entwicklung zu hemmen.
3. Ethanol, Metronidazol Behandlung und Leberregeneration in Larval Zebrabärbling
- Bereiten frische EtOH-Lösung von Ethanol in Embryomedium bis zu einer Endkonzentration von 1,5% hinzugefügt wird. Fügen Sie keine PTU.
- Behandeln Embryonen mit 20 ml Ethanollösung pro Petrischale 56-80 HPF. Decken Sie Petrischalen mit Plastikfolie zu Ethanol Verdunstung verhindern.
- Aussortieren [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] Larven mit ähnlichen Lebergröße, wie bei 80 HPF von GFP - Expression, bestimmt. Nicht Tricaine verwenden, wenn die EtOH-behandelten Larven Sortierung, da diese hohe Sterblichkeit mit anschließender EtOH / MTZ Behandlung verursacht. Halten sortierter Larven in einer Dichte von 30 Embryonen pro Petrischale.
- Bereiten Sie frische 15 mM MTZ in Embryo-Medium in 0,1% DMSO. Fügen geeignete Menge EtOH in MTZ-Lösung mit einer Endkonzentration von 1,5% zu bringen. Inkubieren Larven in 20 ml EtOH / MTZ Lösung pro Petrischale 24 h lang bei 28 ° C. Decken Sie Petrischalen mit Plastikfolie EtOH-Konzentration und mit Aluminiumfolie zu halten vor Licht zu schützen.
- Am Ende der Behandlung zu entfernen EtOH / MTZ Lösung von Larven auf neue Petrischalen mit frischem embryo Medium zu übertragen. Waschen Sie Larven 3-mal mit Embryo Medium und halten sie in 20 ml Embryo Medium ohne PTU.
- Um die Larven sortieren, mit nahezu vollständigen Ablation von Hepatozyten, beobachten Fluoreszenzunter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit dem GFP-Filter bei einer Vergrößerung von 80X. Erfolgreiche Ablation führt zu einer minimalen CFP Fluoreszenz in der Leber und deutlich reduzierten Lebervolumen.
- Um zu vermeiden, den Tod des EtOH / MTZ-behandelten Larven, verwenden Tricaine nicht für die Sortierung. Fixieren Sie die Larven für Immunfärbung (siehe Abschnitt 5) oder halten sortierten Larven in Petrischalen bei 28 ° C für weitere Analysen.
4. Chemische Screens in EtOH / MTZ-behandelten Larval Zebrabärbling
- Bringen Sie die 96-Well-Platten, die 10 mM chemische Bestände in DMSO (beziehen sich auf die Materialliste für Angaben zu den kommerziellen chemischen Bibliotheken) von -80 ° C-Gefrierschrank. Mit Alufolie abdecken zu photokatalytischen Abbau von Chemikalien zu verhindern. Tauen Sie die Stammlösungen bei RT unter leichtem Schütteln.
- Bereiten chemische Lösungen durch Verdünnen von 10 mM Stammlösungen mit Embryo Medium bis zu einer Endkonzentration von 50 & mgr; M (in 96-Well-Platten: initial screen; in 1,5-ml-Röhrchen: Wiederholung der Prüfungen). Kontroll Larven wurden mit gleichen Konzentrationen von DMSO in Embryo Medium behandelt.
- Transfer Larven mit nahezu vollständigen Hepatozyten-Ablation, die mit 1,5% EtOH / 15 mM MTZ und sortiert, wie oben erwähnt behandelt wurden, zu beiden 96-Well (Einstiegsbild) oder 24-Well (Wiederholung der Prüfungen) Platten mit einer Dichte mit Embryo Medium vorbefüllt von 5 Larven pro Vertiefung. Verwenden Sie doppelte Vertiefungen für jede Chemikalie.
- Entfernen Embryo Medium und fügen Sie entweder 250 & mgr; l (96-Well-Platten) oder 500 & mgr; l (24-Well-Platten) chemischen Lösungen in jede Vertiefung. Abdeckplatten mit Aluminiumfolie und behandeln Larven für 50 Stunden bei 28 ° C. Untersuchen Sie chemisch-Einweichen Larven täglich und entfernen Sie alle toten Larven aus den einzelnen Vertiefungen.
- Am Ende der chemischen Behandlung, beachten Sie die Anzahl und / oder die Intensität der GFP-exprimierenden Hepatozyten unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit dem GFP-Filter bei einer Vergrößerung von 80X. Fotografie lebenden Larven zeigt verstärkt oder reduzierend Zahl und / oder Intensität der GFP-exprimierenden Hepatozyten mit einer Digitalkamera für Datensätze.
- Preserve Larven von Formaldehyd Fixierung für die konfokale Abbildung, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
- Um die Chemikalien erneut zu testen, die Hepatozyten-Regeneration im Einstiegsbild zu erleichtern, prüfen ihre Wirksamkeit bei höheren und niedrigeren Konzentrationen die wirksamste Konzentration mit den Verfahren in 4,1-4,5 ( "die Wiederholung der Prüfung ') beschrieben zu finden.
5. Larval Zebrabärbling Fixation, Immunostaining und konfokale Bildgebung
- Anästhesieren Larven von Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 0,02% hinzugefügt wird. Übertragen 10-15 Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen und wasche einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen PBS und 1 ml frisch zubereitet 2% Formaldehyd in PEM-Puffer O / N bei 4 ° C zu beheben.
VORSICHT: Formaldehyd führt zu Reizungen und ist bekannt als ein menschliches Karzinogen zu sein. Griff in einer chemischen Abzugshaube. - Entsorgen Lösung Fixierung richtig und dann wash 3 mal mit PBS bei RT. Feste Larven können in PBS bei 4 ° C aufbewahrt werden bis zu mehreren Tagen. Geht zum nächsten Schritt gibt prompt bessere Immunfärbung Ergebnisse.
- Entfernen Sie vorsichtig Dotter und die Haut für den Bereich der Leber ein # 55 Pinzette unter einem Stereomikroskop verwendet wird.
- Permeabilisierung und Block Larven in Blockpuffer (4% Rinderserumalbumin und 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N bei 4 ° C.
- Inkubieren mit Kaninchen-Anti-Collagen I-Antikörper in einer Verdünnung von 1: 100 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen 5 mal für jeweils 15 Minuten mit Waschpuffer (0,3% Triton X-100 in PBS).
- Inkubieren mit AlexaFluor 647 konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 200 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen 5 mal für jeweils 15 min mit Waschpuffer. Dann waschen Sie einmal mit PBS.
- übertragen vorsichtig Larven auf Glasplättchen mit einer Glaspipette, und orientieren festen Larven mit der linken seitlichen Seite nach oben verwendet wird. Überschüssigen PBS Kimwipes. Fügen Sie einen Tropfen EindeckmittelUnd Dichtung Deckglas mit Nagellack. Die Durchführung konfokaler Bildgebung sofort stark empfohlen.
- Verwenden Sie ein konfokales System, ausgestattet mit einem 40X / 1.3 Öllinse zum Erfassen von Bildern. Verwenden Sie Laserstärke bei 20-50%. Erfassen Z Stapel Bilder bei 1 & mgr; m-Intervallen.
6. Herstellung von Adult Zebrafisch
- Richten Sie Paarung von [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 erwachsenen Zebrafisch in Paarungstanks. Ernte-Embryonen am nächsten Morgen durch das System Wasser belasten und die Embryonen in 100 mm Petrischalen mit Embryo Medium zu übertragen.
- Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie unbefruchteten Eiern mit einer Glaspipette. Wachsen Embryonen bei 28 ° C und fügen PTU auf eine Endkonzentration von 0,003% nach 10 hpf Pigment Entwicklung zu hemmen.
- Bei 4 dpf, verwenden Tricaine Larven zu betäuben und sortieren [Tg (fabp10a: GFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] Larven. Waschen Sie Tricaine durch frisches Embryo Medium mehrmals verändert. Lassen Sie Larven bei 28 ° C zu erholen , bis sie pro Minute 18 normale Herzfrequenz von 120-180 Schlägen erreichen.
- Heben Sie sortierte Larven 6-12 Monate alt basierend auf dem Standardverfahren 19.
7. Ethanol, Metronidazol Behandlung und Leberregeneration in Adult Zebrafisch
- Übertragen 6-12 Monate alt [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] erwachsenen Zebrafisch zu Paarungs Tanks mit einem Netz verwendet wird . Halten Sie Fisch mit einer Dichte von nicht mehr als 10 Fische pro Tank.
- Bereiten frische EtOH-Lösung von EtOH im System Wasser auf eine Endkonzentration von 1% hinzugefügt wird. Behandeln Sie wachsene Fische mit 500 ml EtOH-Lösung in jedem Tank und halten sie in einem 28 ° C Inkubator.
- Transfer wachsene Fische an die frische EtOH-Lösung täglich, Discard tote Fische propErly als Biohazard. Kontinuierlich behandeln Tiere für 72 Stunden vor der MTZ-Behandlung.
- Bereiten Sie frische 10 mM MTZ Lösung in System Wasser in 0,1% DMSO. Pre-warm die MTZ-Lösung in einem 28 ° C Inkubator. Behandeln Sie Fisch mit 500 ml MTZ Lösung in 1 L Kreuzung Tank für 8 Stunden bei 28 ° C, vor Licht schützen Aluminiumfolie.
- Beachten Sie stündlich während der Behandlung und entfernen Sie sofort tote Fische. Entsorgen toter Fisch richtig als Biohazard. Am Ende der Behandlung MTZ, auswaschen MTZ von Tieren frisches System Wasser zweimal übertragen.
- Lassen Sie Tiere erholen und pflegen sie in einem Inkubator bei 28 ° C. Futtermittel und übertragen Fisch frisches System Wasser täglich bis zu dem Zeitpunkt für Analysen.
8. Adult Zebrafisch Leber Fixierung, Immunostaining und konfokale Imaging
- in Eiswasser für 15 min Anesthetize wachsene Fische mit 0,02% Tricaine und einschläfern. Pat der Fisch trocken auf einem Papiertuch und legen Sie es auf einer Sezieren Matte.
- Expose Magen - Darm - Organe durch das Entfernen der Haut und Muskeln , wie zuvor beschrieben 20. Mit einer Schere die Haut und darunter liegende Muskulatur entlang der Bauch von der Afterflosse zum operculum zu schneiden, und dann nach hinten entlang der Seite des Fisches zurück in die Afterflosse.
- Setzen Sie den Fisch in einem 15 ml konischen Röhrchen und waschen Sie einmal mit PBS. Entfernen PBS und 4 ml frisch zubereitet 2% Formaldehyd in PEM-Puffer O / N bei 4 ° C zu beheben.
- Entsorgen Lösung Fixierung richtig, und waschen Sie 3-mal mit PBS bei RT. Festen Proben kann in PBS bei 4 ° C mehrere Tage lang aufbewahrt werden. Geht zum nächsten Schritt gibt sofort eine bessere Immunfärbung Ergebnisse.
- Sezieren die ganze gut mit Leber aus der Körperhöhle des Fisches durch die Speiseröhre zu schneiden. Einbetten der Magen-Darm-Organe mit 4% niedrig schmelzenden Agarose in einer Schnittform.
- Verwenden Sie ein Vibratom geschnitten Proben in Querschnitten bei 50 & mgr; m Intervallen in eiskaltem PBS, vom vorderen Ende beginnt. Übertragen secten bis 6-Well-Platte mit PBS ein # 1 Pinsel verwenden.
- Permeabilisierung und Blockabschnitte in Blockpuffer O / N bei 4 ° C.
- Inkubieren mit Kaninchen-Anti-Collagen I-Antikörper in einer Verdünnung von 1: 100 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen Sie 5-mal, jeweils 15 min mit Waschpuffer.
- Inkubieren mit AlexaFluor 647 konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 200 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen 5 mal, jeweils 15 min mit Waschpuffer und einmal mit PBS.
- Sanft übertragen Schnitte an den Glasobjektträger ein # 1 Pinsel verwenden. Überschüssigen PBS Kimwipes, einen Tropfen Eindeckmittel und Dichtungsdeckel Glas mit Nagellack. Die Durchführung konfokaler Bildgebung sofort wird dringend empfohlen.
- Verwenden Sie ein konfokales System, ausgestattet mit einem 40X / 1.3 Öllinse zum Erfassen von Bildern. Verwenden Sie Laserstärke bei 20-50%. Erfassen Z Stapel Bilder bei 1 & mgr; m-Intervallen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Entwicklung einer EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling. Um ein Protokoll zur Belichtung Zebrabärbling Larven EtOH optimieren wir zunächst EtOH Toxizität beurteilt. 2,5 Tage post-Fertilisation (dpf) Larven wurden auf 1% EtOH-Konzentration ausgesetzt, 1,5% bzw. 2% für 24 Stunden durch eine gleichzeitige 24 hr EtOH / MTZ Behandlung. Exposition gegenüber 2% EtOH verursacht hohe Mortalität, während fast alle Larven auf 1% EtOH ausgesetzt oder weniger zeigten minimale fibrogene Veränderungen mit seltenen Ablagerung von extrazellulären Matrixproteine wie Kollagen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die Larven 24 Stunden lang mit 1,5% EtOH vorbehandelt (2,5-3,5 dpf) und dann mit MTZ gleichzeitig behandelt für 24 Stunden (3,5-4,5 dpf) (1A). Die EtOH / MTZ-behandelten Larven zeigten morphologische Anomalien einschließlich Aufwärtskrümmung des Rumpfes und der Schwanz, pericardial Ödeme und Versagen Schwimmblase aufzublasen. (1B). Wir1) Tg (fabp10a: drei transgenen Linien fibrogen Veränderungen in den EtOH / MTZ-behandelten Larven Lebern zu analysieren GFP-NTR) GT1 Linie drückt die NTR - Gen fusioniert mit cyan fluoreszierendes Protein unter der Hepatozyten-spezifischen fabp10a Promotor 15; 2) Tg (Tp1: mCherry) jh11 Linie markiert Zellen mit aktivem Notch - Signalweg (Notch-responsive Zellen, NRCs) oder biliäre Epithelzellen (BECs) mit Kern mCherry 17, die Expression unter der Kontrolle des TP1 - Modul ist mit mehreren RBP- jk-Bindungsstellen; und 3) Tg (hand2: EGFP) PD24 - Linie, die hepatischen Sternzellen (HSZ) 13 Etiketten. DMSO-behandelten Kontroll [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) PD24] Lebern zeigten keine fibrilläre Kollagen Typ I Abscheidungs 4,6,9 (1C, C '), während EtOH / MTZ-behandelten Lebern angezeigt erhöhten Typ I Kollagenakkumulation bei 25 und 50 h-post-Ablation (hpa) (1D, D ', E, E'). Zusätzlich, im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontroll Lebern (1C ''), erhöhte HSCs in Reihe mit der veränderten Morphologie von einer sternförmigen Konfiguration zu einer Myofibroblasten ähnliche Form mit verlorenen zytoplasmatische Prozesse in den EtOH / MTZ-behandelten regenerierenden Lebern ( 1D '', E ''). Wir beobachteten zwei diskrete Populationen von mCherry-exprimierenden NRCs bei 25 hpa in den EtOH / MTZ-behandelten regenerierenden Lebern: dim rot NRCs (1D '' ', einfügung, weiße Pfeile) und leuchtend rote NRCs (1D' '', Einfügung , gelb Pfeilspitzen). Bei 50 hpa begann Hepatozyten-spezifische GFP coexprimierender in NRCs mit dim mCherry Ausdruck in den regenerierenden Lebern (Abbildung 1E '' ', einfügung, weiße Pfeile). Diese GFP und dim mCherry-coexpressing NRCs sind offenbar unterscheidbar von hellen NRCs rot , die für GFP (Abbildung 1E '' ', einfügung, gelbe Pfeile) negativ sind. Frühere Studien zeigten , dass bei Hepatozytenproliferation nach teilweiser Hepatektomie (PHX) unterdrückt wurde, HPCs bei gleichzeitiger Vermehrung von HSCs 21 erweitert. Darüber hinaus teilten die HPCs und BECs histochemische Marker 22. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass die GFP und dim mCherry Coexpression NRCs einen Zebrabärbling-Pendant von HPCs schildern, die von der Begegnung Herabregulation Notch in Hepatozyten differenzieren. Die NRCs höheren Ebenen der Notch - Signalweg beibehalten kann als Cholangiozyten bleiben, die differenziert sind BECs 23.
Abbildung 2 zeigt die Entwicklung einer EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell bei erwachsenen Zebrafisch. Erstens haben wir ausgesetzt erwachsenen Zebrafisch bis 1%, 1,5% bzw. 2% EtOH Lebensfähigkeit zu beurteilen. Die meisten erwachsenen Zebrafisch tat not überleben mehr als 72 h der Exposition gegenüber EtOH Konzentrationen von mehr als 1% (nicht veröffentlichte Daten). Daher ist für erwachsene Zebrafisch, vorbehandelte wir die Fische mit 1% EtOH für 72 h und anschließend mit MTZ Behandlung (2A). Durch Durchführen Zeitverlaufsanalysen zeigten wir deutlich erhöhten Typ I Kollagenablagerung in den EtOH / MTZ-behandelten Regenerieren Lebern bei 2, 3 und 4 Tage post-Ablation (dpa) (2C ', D', E ') im Vergleich zu DMSO-behandelten Lebern (2B). In den Larven , die ähnlich zu beobachten, wurden die GFP und dim mCherry co-exprimierenden Zellen in den EtOH / MTZ-behandelten regenerierenden Lebern von 12 Monate alten [Tg (fabp10a: GFP-NTR) nachgewiesen GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] wachsene Fische auf 3 und 4 dpa (2D, E, Einfügungen, weiße Pfeile). Diese Daten zeigen, dass die HPC, reaktions Signalisierung Notch, behalten ihre Funktion als Hepatozyten zu regenerieren indas Vorhandensein von fibrogen Beleidigung bei erwachsenen Zebrafisch.
Abbildung 3 zeigt die repräsentative chemische Screening - Ergebnisse unserer Ethanol-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling verwenden. Um bioaktiven Verbindungen identifizieren, die Hepatozyten-Regeneration in der fibrotischen Leber beschleunigen, führten wir chemische genetischen Screens. Wir gesiebt , um eine Bibliothek von 75 kleinen Molekülen mit gut charakterisierten biologischen und pharmazeutischen Aktivitäten (Stem Cell Compound Bibliothek Signalisierung, Selleckchem) und einer Bibliothek von 1000 weniger charakterisierte kleine Moleküle (Actiprobe-1K - Bibliothek, Timtec) mit [Tg (fabp10a: CFP -NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] Larven. Wir ablatiert die Hepatozyten in Gegenwart von 1,5% EtOH / 15 mM MTZ und belichtet dann die Larven bis 50 & mgr; M der Verbindungen für 50 h (3A). Eine Anzahl von Wnt-Agonisten wie SB 415286 und CHIR-99021, Inhibitoren der Glykogen Synthase Kinase-3, gefördert Hepatozyten Regeneration (3C, D) im Vergleich zu DMSO (3B). Weiterhin [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazol-3-ylamin], abgekürzt als HTOA, ein neuartiges Wnt-Signalweg Aktivator, verbesserte Regeneration Hepatozyten in die fibrotische Leber , wie durch größere regenerierter Leber (3E) angegeben. Diese Daten legen nahe, dass unser nachhaltiges fibrotische Modell ein unschätzbares Werkzeug bietet kleine Moleküle zu entdecken, die Hepatozyten-Regeneration zu verbessern.
Abbildung 1. Entwicklung eines Ethanol-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling. (A) Schema , welches die Perioden von EtOH und EtOH / MTZ - Behandlung für einen fibrotischen Lebermodell in Larven zu etablieren. (B) bei 50 Stunden-post-Ablation (hpa), EtOH / MTZ-behandelten larval Zebrabärbling entwickelt morphologische Anomalien einschließlich Aufwärtskrümmung des Rumpfes und der Schwanz, pericardial Ödeme und Versagen der Schwimmblase aufzublasen. (CC '' ') in der Leber [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) PD24] Larven mit DMSO behandelt war ECM - Protein Kollagen 1a fast nicht nachweisbar (C, C ') und Ruhe HSCs zeigte eine sternförmige Konfiguration (C' '), wohingegen NRCs unter Hepatozyten (C, C '' ', Einschub) verteilt. (DE '' ') in den Lebern von EtOH / MTZ-behandelten Larven, Ablagerung erhöhten Kollagen 1a beobachtet wurde (D, D', E, E '). HSZ erhöhte Zahl und verloren komplexe cytoplasmatischen (D '', E ''). Bei 25 hpa werden mCherry-exprimierenden NRCs aus zwei unterschiedlichen Populationen. Gelbe Pfeile bezeichnen leuchtend roten NRCs (D '' ', kleines Bild), während weiße Pfeile dunkel rot NRCs (D zeigen' '', Einschub). Bei 50 hpa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) und Tg (Tp1: mCherry) co-exprimierenden begann Zellen in den regenerierenden Lebern (E '' ', einfügung, weiße Pfeile) entstehen, während die leuchtend roten NRCs keine GFP - Expression hatte (E '' ', einfügung, gelb Pfeilspitzen). Alle konfokale Bilder sind einzelne Ebene Bilder außer C '', D '', E '', die Projektionsbilder sind. Maßstabsbalken: B, 100 & mgr; m; CE '' ', 20 & mgr; m. EtOH, Ethanol; MTZ, Metronidazol; hpa, Stunden-post-Ablation; dpf Tage-post-Düngung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Entwicklung eines Ethanol-induzierten fibrotischen Lebermodell bei erwachsenen Zebrafisch. (A) Schema , welches die Perioden von EtOH und MTZ - Behandlung für einen fibrotischen Lebermodell bei Erwachsenen zu etablieren. (BE) Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (Tp1: mCherry) und Kollagen 1a - Expression in Vibratom Abschnitte von DMSO (B und B ') und EtOH / MTZ-behandelt (CE) für Erwachsene Zebrabärbling Lebern. (BB ') in der DMSO-behandelten Kontrollen war Kollagen 1a fast nicht nachweisbar (B') ohne Tg (fabp10a: CFP-NTR) und Tg (Tp1: mCherry) co-exprimierenden Zellen (B). (CE) (, D ', E' mit einem in den EtOH / MTZ-behandelten regenerierenden Lebern, Kollagen 1a Abscheidung wurde bei 2, 3 und 4 dpa C) deutlich erhöht "Bevölkerung von Tg (fabp10a: GFP-NTR) und Tg (Tp1: mCherry) co-exprimierenden Zellen bei 3 und 4 dpa (D, E, einfügungen, weiße Pfeile). Die leuchtend roten NRCs hatte keine GFP - Expression (D, E, einfügungen, gelbe Pfeile). BE, konfokale Ebene Bilder. B'-E ', konfokale Projektionsbilder. Maßstabsbalken, 20 & mgr; m. EtOH, Ethanol; MTZ, Metronidazol; dpa Tage-post-Ablation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative chemische Screening - Ergebnisse , die Ethanol-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling verwenden. (A) Schema für die Hepatozyten - Regeneration - Bildschirm in der fibrotischen Leber. (BE) bekannt und Roman WntAktivatoren Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber vermehren. Konfokalen Projektionen der EtOH / MTZ behandelten Lebern in der [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] Larven , die mit DMSO verabreicht wurden (B), SB415286 (C) CHIR-99021 ( D) oder ein neuartiges Wnt Aktivator [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazol-3-yl-amin] (abgekürzt als HTOA) (E). SB415286 und CHIR-99021 sind Glykogen-Synthase-Kinase-3-Inhibitoren. Alle Bilder sind konfokale Projektionsbilder. Maßstabsbalken, 20 & mgr; m. EtOH, Ethanol; MTZ, Metronidazol; hpa, Stunden-post-Ablation; dpf Tage-post-Düngung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir beobachteten HPC-vermittelte Hepatozyten Regeneration in den EtOH / MTZ-behandelten Rückgewinnung Lebern, was nahe legt, dass selbst in Gegenwart von erheblichen Menge an ECM-Proteinen, einschließlich fibrillärem Kollagen Typ I, die HPCs ihre Kompetenz behalten als Hepatozyten zu regenerieren. Die MTZ nur Behandlung nicht zu einer Erhöhung der Abscheidung von ECM - Proteine signifikant, während die EtOH nur Behandlung nicht HPC Aktivierung 15 induzieren. Durch die Nutzung der kombinierten EtOH / MTZ Behandlung konnten wir HPC-driven Regeneration in der fibrotischen Leber zu untersuchen. Als nahezu vollständige Eliminierung von Hepatozyten HPC-driven Hepatozyten Regeneration entlockt, ist es entscheidend, MTZ-behandelten Larven nach den Kriterien der Abwesenheit von Hepatozyten-spezifischen Fluoreszenz zu sortieren und durch Clustered NRCs deutlich reduziert Lebervolumen. Bei Fischen, absorbieren die Blutgefäße der Kiemen und die Haut um den Alkohol 24, so dass es keine Notwendigkeit gibt , Tiere zu erlauben , ad libitum zu trinken oder intraga erfordernstric Infusion wie in Säugetiermodelle. Wir untergebracht EtOH- und anschließende MTZ-behandelten erwachsenen Fische in separaten Tanks ohne das Wasser zu zirkulieren. Es ist wichtig, Fisch frisch EtOH-Lösung zu übertragen täglich und halten den Deckel auf die Verdunstung von EtOH zu minimieren. Obwohl 48-72 h EtOH / MTZ Behandlung effizient ECM Proteinsynthese in unseren Protokollen induziert, weder fortgeschrittener Fibrose noch Zirrhose hat in diesen Fischen entwickelt. Daher Kombination von MTZ bei längerer Einwirkung von Ethanol wie 12 Wochen Behandlung 14, speziell bei erwachsenen Fisch kann mehr schwere Leberschäden hervorrufen , um richtig zu simulieren und HPC-driven Regeneration bei chronischen Leberversagen verhören.
Zebrabärbling dient als herausragende Tiermodell für die in - vivo - Verbindung Test aufgrund seiner geringen Größe, große Nachkommenschaft, Transparenz und Durchlässigkeit für kleine Moleküle 25. Mit dem fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling identifizierten wir eine Reihe von bekannten und neuen Wnt aktizüge und Notch - Inhibitoren , die Hepatozyten - Regeneration 15 beschleunigt. Unsere aktuellen Fluoreszenz basierenden chemischen Screening-Protokoll besteht aus mehreren Schritten alle manuell einschließlich der Vorbereitung von Chemikalien durchgeführt, die Übertragung EtOH-behandelten / Hepatozyten-abgetragenen Larven bis 24-Well-Platten, die Behandlung von Chemikalien und die Analyse der Auswirkungen von Chemikalien auf Hepatozyten Regeneration. Es beschäftigt speziell Epifluoreszenz und / oder konfokalen Mikroskop Bilder für einzelne Tier zu erfassen, die raubend mühsam und zeit ist. Hochdurchsatz - Plattformen , die automatisch verarbeiten und zelluläre auflösende Bildgebung von Zebrabärbling in Kombination mit quantitativen Datensammlung erwerben groß angelegte Screening 26,27 .Diese Funktionen erleichtern wird gestärkt werden , wenn mit einer automatisierten Medikamentendosierungssystem kombiniert, das den Bereich der chemischen Konzentrationen bestimmt 28, die zur Verbesserung der Hepatozyten - Regeneration Mindest Toxizität mit maximaler Wirksamkeit geben kann. Trotz dieser limitagen, wie viele kritische Spieler und Hauptzelltypen der Leber zwischen Zebrabärbling und Säugetieren die in - vivo - basierten kleinen Molekül - Screening mit dem Zebrabärbling fibrotischen Lebermodell gültige Entdeckung wird katalysieren neuer Therapiestrategien für chronische Lebererkrankungen unter Verwendung von 29, konserviert.
Zwei weitere Gruppen , die unabhängig haben gezeigt , dass nach der fast vollständigen Verlust der Hepatozyten ohne fibrogen Beleidigungen, BECs transdifferentiated in Hepatozyten durch einen Schritt der Entdifferenzierung 30,31 mit der Annahme , dass Cholangiozyten, ausdifferenzierten BECs, in erster Linie NRCs / BEC in Zebrabärbling umfassen. Obwohl transdifferentiation einer der Mechanismen sein kann Hepatozyten Regeneration des Fahrens, zeigen unsere Ergebnisse , dass die HPCs, die 32 bilden , sind bekannt , um die Mehrheit der BECs in der Zebrabärbling Leber, Notch - Aktivität herunterregulieren in Hepatozyten differenzieren. Inzwischen ist es plausibel, dass zu spekulieren the ausdifferenzierten BECs, Cholangiozyten, höhere Niveaus der Notch-Aktivität beibehalten zu Hepatozyten während der Regeneration ohne Umwandlung. Intriguingly, in Gegenwart von EtOH, wie zuvor berichtet 13, fanden wir , dass HSCs in Reihe mit der veränderten Morphologie von einer sternförmigen Konfiguration zu einer Myofibroblasten ähnliche Form mit verlorenen zytoplasmatische Prozesse erhöht. Die aktivierten HSZ durch Synthese von ECM - Proteine sind die Hauptschuldige für abnorme Wundheilung während der integrierte Prozess der Leber Reparatur 4 gekennzeichnet. Obwohl oft chronische Verletzung der Leber des bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration außer Kraft gesetzt, erfolgreich transplantiert HPCs repopulated die fibrotische / cirrhotic Rattenleber 33. Daher unser Zebrabärbling fibrotischen Leber-Modell wird ein wichtiges Instrument sein, um die molekularen und zellulären Mechanismen aufzuklären, die die Auswirkungen der anhaltenden Fibrose auf HPC-vermittelte Hepatozyten Regeneration vermitteln. Darüber hinaus definieren die mehrzelligen crosstalk , die durch den Einsatz unserer Zebrabärbling fibrotischen Lebermodell Regeneration und Fibrose balanciert wird weiter zu erleichtern für chronische Leberversagen in vivo tragfähige therapeutische Strategien zu entwickeln.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus der GTEC (2731336 und 1411318), der NIH (K01DK081351) und der NSF (1.354.837) zu CHS unterstützt Wir Alem Giorgis für das kritische Lesen des Manuskripts danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
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