Artigo de método

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

DOI:

10.3791/54097

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17 de junho de 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Resumo

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As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas, têm a capacidade intrínseca de se diferenciar em todas as três camadas germinativas. Isso os torna uma fonte celular atraente para medicina regenerativa e modelagem experimental de organogênese normal e doente. No entanto, a diferenciação de hPSCs in vitro é heterogênea e espacialmente desordenada. As tecnologias de micropadronização celular oferecem potencialmente os meios para controlar espacialmente os microambientes de células-tronco e organizar os destinos de diferenciação resultantes. A micropadronização de hPSCs precisa levar em consideração os requisitos rigorosos para sobrevivência e manutenção de hPSC. Aqui, descrevemos a micropadronização de estêncil como um método altamente compatível com hPSCs. Os micropadrões de hPSC são especificados pelas geometrias dos orifícios de passagem do estêncil da célula, que confinam fisicamente os locais onde as hPSCs podem acessar e se ligar ao substrato revestido de matriz extracelular subjacente. Devido a esse modo de operação, há maior flexibilidade para usar substratos que possam suportar adequadamente as hPSCs em comparação com outros métodos de micropadronização celular. Também destacamos etapas críticas para a geração bem-sucedida de micropadrões de hPSC. Como exemplo, demonstramos que a micropadronização de estêncil de hPSCs pode ser usada para modular a polarização espacial das aderências célula-célula e célula-matriz, que por sua vez determina os padrões de diferenciação do mesoendoderma. Este método simples e robusto para micropadronizar hPSCs amplia as perspectivas de estabelecer modelos experimentais para investigar a organização e padronização do tecido durante o desenvolvimento embrionário inicial.

Introdução

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As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células embrionárias estaminais (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs), são amplamente explorados em medicina regenerativa, bem como modelagem experimental da organogénese normais e doentes devido ao seu potencial de diferenciação em linhagens celulares de todos três camadas germinativas 1,2. O destino de diferenciação de hPSCs são altamente sensíveis a factores ambientais locais que podem modular processos mecanotransdução autócrino ou parácrino de sinalização 1, bem como mediadas por sinais físicos 3-5. Micropatterning celular engloba um conjunto d....

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo descreve a fabricação de PDMS stencil com 1.000 mm padrões de corte a laser e micropatterning da linha de células estaminais embrionárias humanas, H9 usando o stencil PDMS.

1. Projeto e Fabricação de PDMS do estêncil para micropatterning

  1. Projetar a folha de stencil com furos de passagem da geometria desejada e tamanho (por exemplo, 1.000 mm círculos) ea junta estêncil usando software de desenho auxiliado por computador 10.
  2. Laser-cortar a folha de stencil e junta em 120-150 mm e 2 mm de espessura polidimetilsiloxano (PDMS) folhas, respectivamente, usando um laser de CO 2-co....

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Resultados

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Neste artigo, descreve a fabricação de um estêncil célula usando um cortador a laser para gerar 1.000 mm características. A matriz foi composta por 2 partes: uma folha de stencil fina (cerca de 100-200 mm de espessura) que contém o micropadrão furos de passagem, e uma junta de PDMS para conter a solução de revestimento de ECM ou de suspensão de células. Aqui, 127 im e 2 mm de espessura folhas de PDMS comercialmente disponíveis foram usadas como a folha de stencil e junta respectivamente........

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Discussão

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Fabricação de stencils micropatterning

micropatterning estêncil fornece um método ideal para gerar micropadrões HPSC para investigar mediada por nicho de padronização diferenciação. A principal vantagem de estêncil sobre outras técnicas de modelação micropatterning, tais como a impressão e microcontact photopatterning, é que ele não necessita de modificação da superfície, e podem ser aplicadas em substratos convencionais TCPS. Portanto, os meios de cultura optimizad.......

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado por NUS Inicie concessão (R-397-000-192-133) e Fundo Gap ETPL (R-397-000-198-592). GS é um estudioso NUS Research. Autores gostariam de agradecer ao Dr. Jiangwa Xing por seu apoio técnico sobre micropatterning celular.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Folha PDMS de 2 mm de espessuraSpecialty Silicone Products Inc., EUASSPM823-.005Usado para formar reservatório para estêncil
120-150 μ m de espessura Folha PDMSSpecialty Silicone Products Inc., EUASSPM823-.040Usado para formar estêncil 
Placa de Petri de 60 mmNunc Nunclon Delta150326Substrato para micropadronização
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingapuraSCR005Enzima para quebrar células H9 em células únicas
Activina   R& D Systems, Singapura338-AC-010Fator de crescimento para diferenciação H9
BMP4 R& D Systems, Singapura338-BP-010 Fator decrescimento para diferenciação H9
Sistema de plasma Femto Science, KoreaCUTE-MPPara oxidação de plasma de estêncil
DispaseStemCell™ Technologies, Singapore7923Enzima usada para enfraquecer a adesão célula-ECM durante a passagem DMEM
/F12GIBCO, EUA11330032Meio basal para células H9
FGF2R& D Systems, Cingapura233– FB– 025Fator de crescimento para diferenciação H9
Linha celular H9WiCell Research Institute, Inc., EUAWA09Células-tronco embrionárias humanas
Matriz de membrana basal qualificada por hESCMatrigel, BD Biosciences, Cingapura354277Revestimento de matriz extracelular para apoiar o crescimento de células H9
Microscópio invertidoLeica Microsystems, CingapuraDMi1Para captura de campo claro imagens
Cortador a laserEpilog Helix 24 Laser SystemUsado para gerar furos passantes na chapa PDMS
mTeSR™ 1 médio Células-tronco™ Technologies, Singapore5850Meio de manutenção para células H9
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004Usado para colar o estêncil PDMS e o reservior
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapore688000Mantém as células H9 como células únicas 
STEMdiff™ APEL™ médio Células-tronco™ Technologies, Singapore5210Meio de diferenciação para células H9
Filme de tereftalato de polietilenoSureMark SingaporeSQ-6633Usado para formar estêncil 
Surfactante não iônico compatível com cultura de célulasÁcido plurônico F-127, Sigma, CingapuraP2443Reagente de passivação para repelir a adesão celular em substratos não micropadronizados

Referências

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  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9....

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