Artigo de método

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

DOI:

10.3791/54097

⸱

17 de junho de 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Resumo

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As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas, têm a capacidade intrínseca de se diferenciar em todas as três camadas germinativas. Isso os torna uma fonte celular atraente para medicina regenerativa e modelagem experimental de organogênese normal e doente. No entanto, a diferenciação de hPSCs in vitro é heterogênea e espacialmente desordenada. As tecnologias de micropadronização celular oferecem potencialmente os meios para controlar espacialmente os microambientes de células-tronco e organizar os destinos de diferenciação resultantes. A micropadronização de hPSCs precisa levar em consideração os requisitos rigorosos para sobrevivência e manutenção de hPSC. Aqui, descrevemos a micropadronização de estêncil como um método altamente compatível com hPSCs. Os micropadrões de hPSC são especificados pelas geometrias dos orifícios de passagem do estêncil da célula, que confinam fisicamente os locais onde as hPSCs podem acessar e se ligar ao substrato revestido de matriz extracelular subjacente. Devido a esse modo de operação, há maior flexibilidade para usar substratos que possam suportar adequadamente as hPSCs em comparação com outros métodos de micropadronização celular. Também destacamos etapas críticas para a geração bem-sucedida de micropadrões de hPSC. Como exemplo, demonstramos que a micropadronização de estêncil de hPSCs pode ser usada para modular a polarização espacial das aderências célula-célula e célula-matriz, que por sua vez determina os padrões de diferenciação do mesoendoderma. Este método simples e robusto para micropadronizar hPSCs amplia as perspectivas de estabelecer modelos experimentais para investigar a organização e padronização do tecido durante o desenvolvimento embrionário inicial.

Introdução

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As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células embrionárias estaminais (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs), são amplamente explorados em medicina regenerativa, bem como modelagem experimental da organogénese normais e doentes devido ao seu potencial de diferenciação em linhagens celulares de todos três camadas germinativas 1,2. O destino de diferenciação de hPSCs são altamente sensíveis a factores ambientais locais que podem modular processos mecanotransdução autócrino ou parácrino de sinalização 1, bem como mediadas por sinais físicos 3-5. Micropatterning celular engloba um conjunto de técnicas que foram desenvolvidas para organizar espacialmente a geometria e a localização de uma população de células como um meio para controlar o micro-ambiente celular local, tais como as interacções célula-célula e 6 interacções célula-matriz 3. No contexto da hPSCs, micropatterning celular tem sido empregado para obter insights importantes sobre como nicho dependeráent sinalização autócrina modula hESC decisões pluripotência-diferenciação 7 e organização em primeiros padrões de diferenciação embrionárias 6. 2D e 3D hPSCs micropatterned têm sido utilizados para controlar o tamanho das colónias de padrões multicelulares, que por sua vez influenciam as decisões de diferenciação para as três camadas germinais 8,9. Temos empregue micropadrões HPSC multicelulares para modular o grau de célula-célula e as interacções célula-matriz dentro de uma colónia HPSC para sondar como integrina-E-caderina diafonia pode dar origem ao destino celular heterogeneidade 10. As manifestações dos relatórios acima abrir novos caminhos para a aplicação de micropadrões multicelulares de hPSCs como modelos experimentais para o rastreio toxicidade dos medicamentos para doenças do desenvolvimento 11, para estudar o efeito de fatores de crescimento e hormônios durante a tecido ou desenvolvimento de órgãos, e para desvendar a formação de padrões de tecido.

Uma miríade de micropatter celularning técnicas têm sido desenvolvidas como revisto por Falconnet et. . al 12, mas apenas um punhado, como micro-contacto imprimir 7,8,13, micropoços cultura 14,15, photopatterning 6 e microstencils 16 foram implementadas com sucesso com hPSCs. O desafio com hPSCs micropatterning reside na sua vulnerabilidade e uma exigência rigorosa de matrizes específicas extracelular (MEC) e as condições de crescimento para a fixação e sobrevivência celular. Para padrões 2D HPSC, impressão micro-contato é um dos métodos mais comuns de gerar micropadrões HPSC em cultura de tecido e vidro substratos 13. O método pode ser usado para padrão de ECM comum utilizado na cultura HPSC, incluindo matrizes de laminina e da membrana basal, tais como Matrigel. No entanto, isso requer tipicamente um processo de revestimento de duas etapas auxiliado por poli-D-lisina, e necessita de condições atmosféricas e humidade inertes específicos para fazer micropadrões ECM estáveis ​​para hPSCs para anexar em 6,13. A principal consideração de cada método micropatterning é se o regime de modificação da superfície pode gerar padrões de ECM HPSC-adesivas na resolução geométrica desejada, minimizando a fixação das células inespecífica para as áreas circundantes.

Aqui, nós relatamos o uso de micropatterning estêncil como um método simples para gerar micropadrões HPSC sem etapas de modificação de superfície suplementar, antes da geração de padrões de ECM adesivas para hPSCs para anexar diante. O estêncil célula é composta por uma fina membrana, folha por exemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), com micron de milímetro de tamanho orifícios lacrados em um substrato de cultura de células para conter fisicamente revestimentos ECM e hPSCs posteriormente semeadas. Como estêncil padronização funciona, restringindo fisicamente do local onde HPSC pode acessar e ligam directamente ao substrato subjacente ECM revestido, este método é compatível com vários substratos que podem suportar culturas HPSC. As únicas requirement é que a escolha do material da matriz pode formar uma vedação reversível com o substrato. Estes substratos incluem poliestireno convencional de cultura de tecidos (TCPS) 17, substratos conjugados de ligando 18, bem como substratos elastoméricos com rigidez ajustável (por exemplo., PDMS) 19. Este método também permite que o revestimento de ECM diferente, tais como vitronectina (ou proteína VTN), laminina e matrizes de membrana basal (por exemplo, Matrigel e Geltrax) para permitir a fixação e diferenciação de hPSCs adequada. configurações de ECM-substrato Portanto, podemos transferir otimizadas para uma linha específica para HPSC estêncil micropatterning para óptima de células-matriz de adesão, sobrevivência e diferenciação. Recentemente, um método semelhante foi também relatada para dirigir a diferenciação hepática por hESCs micropatterning usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) de matrizes de micro-estêncil 16.

stencils celular pode ser fabricado a partir de materiais diferentes, incluindo metals 20,21, poli (p-xilileno) polímeros 22,23, PMMA 16 e mais comumente, PDMS 24-28. Silicone e poli (p-xilileno) polímeros stencils exigem gravura directa dos furos de passagem com equipamento especializado 20-23, o que limita a sua acessibilidade aos utilizadores biológicos. PDMS matrizes podem ser fabricados por diferentes métodos, dependendo do tamanho funcionalidade requerida, que tipicamente varia de 3 uM a 2.000 uM 11,26-29. Se pequenas características são desejadas, folhas de stencil finos pode ser produzida por moldagem por prensa de pré-polímero de PDMS em um modelo de silício microfabricado contendo relevos dos micropadrões 28. Para recursos> 1.000 mm, um cortador de laser de CO 2 proporciona um método de custo fácil e baixo para cortar diretamente os padrões sobre uma folha de PDMS pré-fundido durante a fabricação stencil. A reciclagem dos stencils PDMS também os torna rentável para realizar uma série de experimentos com consistência suficiente.

Aqui, apresentamos a metodologia detalhada para a fabricação de um estêncil PDMS com 1.000 mm características de corte a laser e à geração de micropadrões hESC. Estas células estaminais embrionárias humanas micropadrões foram usadas para modular o grau de integrina e E-caderina mediada aderências dentro de uma colónia coesa células estaminais embrionárias humanas, de modo a investigar a forma como a polarização espacial de adesão celular resultou na célula destino heterogeneidade 10.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo descreve a fabricação de PDMS stencil com 1.000 mm padrões de corte a laser e micropatterning da linha de células estaminais embrionárias humanas, H9 usando o stencil PDMS.

1. Projeto e Fabricação de PDMS do estêncil para micropatterning

  1. Projetar a folha de stencil com furos de passagem da geometria desejada e tamanho (por exemplo, 1.000 mm círculos) ea junta estêncil usando software de desenho auxiliado por computador 10.
  2. Laser-cortar a folha de stencil e junta em 120-150 mm e 2 mm de espessura polidimetilsiloxano (PDMS) folhas, respectivamente, usando um laser de CO 2-cortador 10.
  3. Unir a junta PDMS com a folha de stencil PDMS usando PDMS não curado líquidos e leve ao forno a 60 ° C durante 3-4 horas para obter o stencil PDMS para micropatterning.
  4. Esteriliza-se o estêncil PDMS em autoclave a 120 ° C durante 30 min e secagem num forno antes da sua utilização.

2. hESCs Principalmanutenção

  1. Cultura as linhas de células estaminais embrionárias humanas em um meio de manutenção isento de alimentador em 1 × placas de cultura celular de matriz revestida da membrana basal hESC qualificado a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. A passagem hESCs quando eles são aproximadamente 70% confluentes por 3 minutos de incubação a 37 ° C com dispase tratamento e mecanicamente dissociar as colónias em células estaminais embrionárias humanas 100-200 uM aglomerados. Placa os aglomerados hESCs a uma densidade de 30-50 aglomerados por 9,6 centímetros 2 de área de crescimento sobre-revestidos de matriz de membrana basal do tecido em polistireno para cultura de relação de 1: 6 a divisão.

3. Stencil micropatterning de células estaminais embrionárias humanas

  1. Preparação prévia para a célula padronização
    1. Selar um stencil PDMS em um 60 milímetros placa de Petri dispensando 700 mL de 70% de etanol grau analítico em água ultrapura para a placa de Petri e colocar o estêncil no topo.
    2. Coloque a placa de Petri dentro de gabinete de biossegurança durante a noite para deixar tele etanol seco.
    3. Verificar existe nenhuma bolha por baixo da matriz para assegurar que a matriz forma uma boa vedação com a placa de Petri. Isto impede as fugas de solução de revestimento de ECM. Selar a placa de Petri e armazenar em condições estéreis até que esteja pronto para a semeadura de células.
    4. Preparar alíquotas de matriz de membrana basal hESC-qualificados de acordo com o Certificado de Análise. Assegurar que cada alíquota rendimentos 1 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificada quando diluída em 25 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F12) de acordo com a folha de produto do fabricante.
    5. Preparar a solução de revestimento ECM através da adição de uma alíquota de matriz de membrana basal hESC-qualificada em 16,7 ml de DMEM / F12 para fazer 1,5 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificado. Manter toda a solução de revestimento de ECM no gelo para evitar a gelificação.
    6. Suplemento meio de manutenção hESC com 10 mM inibidor ROCHA (Y27632).
  2. revestimento de ECM no substrato estampado
    1. Trate a placa de Petri com 100 WO 2 plasma durante 90 segundos. Para garantir a esterilidade, a apenas abrir a tampa placa de Petri dentro da câmara de plasma antes do tratamento por plasma, e rapidamente a tampa traseira do prato de Petri, após a conclusão do tratamento. Isto facilita a molhagem da superfície e impede a formação de bolhas de ar no micropadrão orifícios de passagem durante a adição da solução de revestimento de ECM.
    2. Adicionar 450 mL de 1,5 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificados para cobrir todo o stencil. Selar a placa de Petri com uma película auto-selável, tais como Parafilm para evitar que a solução de secar e incubar durante 5 horas a 37 ° C antes da utilização.
  3. HESCs de semeadura sobre o substrato estampado
    1. Examinar colónias em células estaminais embrionárias humanas de 6 poços da placa para identificar as áreas de células diferenciadas mostrando a perda de morfologia típica de células estaminais embrionárias humanas (por exemplo, perda de arredondada, firmemente packed morfologia epitelial, razão / citoplasma alta núcleo com nucléolo proeminente). Remover regiões diferenciadas usando um aspirador a vácuo.
    2. Lavar duas vezes com 2 ml de DMEM / F12 por poço.
    3. Adicionar 1 ml de enzimas digestivas, tais como Accutase, por poço da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante 8 min. Toque a placa suavemente para retirar todas as colônias de substrato.
    4. Lavar cada poço com, pelo menos, 4 ml de DMEM / F12 por 1 ml de enzimas digestivas e recolher a suspensão de células no tubo de 15 ml.
    5. Centrifugar a suspensão de células a 200 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente.
    6. Aspirar para eliminar o sobrenadante e adicionar 400 ul de meio de manutenção de células estaminais embrionárias humanas suplementado com inibidor ROCHA (Rocki) para re-suspender as células. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo 3 vezes suavemente para quebrar aglomerados em células individuais.
    7. Misture bem a única suspensão de células e dilui-se 10 ul de amostras de células em 190 ul de DMEM / F12 (diluição de 1:20). Use um hemocytomeTer para determinar a densidade de células na suspensão de células de reserva.
    8. Calcula-se a densidade de sementeira de células necessário para uma determinada matriz.
      NOTA: Por exemplo, temos experimentalmente determinada a densidade de sementeira de células para se obter uma monocamada confluente de células isoladas é de cerca de 4.444 células / mm 2. Assim, uma matriz com uma área de 450 mm2 e volume de sementeira de 400 uL irá necessitar de uma suspensão de células a ser a uma densidade de 2 milhões de células / 400 ul.
    9. Dilui-se a suspensão de células de ações para a densidade de semeadura necessária (veja o passo 3.3.8 NOTA) com meio de cultura suplementado com hESC Rocki.
    10. Adicionar um volume designado de suspensão de células contendo o número necessário de células em cada matriz e deixar a placa de Petri na capa sem ser perturbado durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que as células assentar.
    11. Transferir a placa de Petri em incubadora e incubar durante 1 h para permitir a ligação de células. Tome cuidado para manter o nível de placa de Petri durante oprocesso de transferência de modo que as células permanecem como uma monocamada na matriz.
  4. Remoção de estêncil e passivação do substrato unpatterned
    1. Examinar a placa de Petri sob um microscópio para verificar se as células forem correctamente ligado ao substrato subjacente.
    2. Aspirar afastado suspensão de células a partir do stencil.
    3. Adicione 2 ml / prato de cultura de células de 0,5% compatível surfactante não-iônico em DMEM / F12 para a área em torno do estêncil.
    4. Use um par de fórceps autoclavados para descascar delicadamente fora do estêncil. Agitar a solução de agente tensioactivo não iónico como em torno do estêncil é retirado para evitar que as células de secar. Observar visualmente as células micropatterned na placa de Petri.
    5. Incubar as células em solução de tensioactivo micropatterned-DMEM / F12 não iónico 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
    6. Aspirar a solução de distância / F12 de DMEM-surfactante não-iónico. Lavar 3 vezes com 2 mL / prato de DMEM / F12.
    7. Adicione 2 ml / prato de hESCmeio de manutenção suplementado com Rocki e incubar a 37 ° C durante a noite.
    8. Após incubação durante a noite, o meio de manutenção aspirado de células estaminais embrionárias humanas suplementado com Rocki, lavar uma vez com meio DMEM / F12 e induzir a diferenciação mesoendoderm por adição de 2 ml / placa de meio de diferenciação suplementado com 100 ng / ml de Activina, 25 ng / ml BMP4 e 10 ng / FGF2 ml .
    9. Avaliar os micropadrões utilizando imagiologia de contraste de fase e calcular os perfis de intensidade média Brachyury (t) para cada padrão, tal como descrito anteriormente 8.

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Resultados

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Neste artigo, descreve a fabricação de um estêncil célula usando um cortador a laser para gerar 1.000 mm características. A matriz foi composta por 2 partes: uma folha de stencil fina (cerca de 100-200 mm de espessura) que contém o micropadrão furos de passagem, e uma junta de PDMS para conter a solução de revestimento de ECM ou de suspensão de células. Aqui, 127 im e 2 mm de espessura folhas de PDMS comercialmente disponíveis foram usadas como a folha de stencil e junta respectivamente....

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Discussão

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Fabricação de stencils micropatterning

micropatterning estêncil fornece um método ideal para gerar micropadrões HPSC para investigar mediada por nicho de padronização diferenciação. A principal vantagem de estêncil sobre outras técnicas de modelação micropatterning, tais como a impressão e microcontact photopatterning, é que ele não necessita de modificação da superfície, e podem ser aplicadas em substratos convencionais TCPS. Portanto, os meios de cultura optimizad...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado por NUS Inicie concessão (R-397-000-192-133) e Fundo Gap ETPL (R-397-000-198-592). GS é um estudioso NUS Research. Autores gostariam de agradecer ao Dr. Jiangwa Xing por seu apoio técnico sobre micropatterning celular.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Folha PDMS de 2 mm de espessuraSpecialty Silicone Products Inc., EUASSPM823-.005Usado para formar reservatório para estêncil
120-150 μ m de espessura Folha PDMSSpecialty Silicone Products Inc., EUASSPM823-.040Usado para formar estêncil 
Placa de Petri de 60 mmNunc Nunclon Delta150326Substrato para micropadronização
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingapuraSCR005Enzima para quebrar células H9 em células únicas
Activina   R& D Systems, Singapura338-AC-010Fator de crescimento para diferenciação H9
BMP4 R& D Systems, Singapura338-BP-010 Fator decrescimento para diferenciação H9
Sistema de plasma Femto Science, KoreaCUTE-MPPara oxidação de plasma de estêncil
DispaseStemCell™ Technologies, Singapore7923Enzima usada para enfraquecer a adesão célula-ECM durante a passagem DMEM
/F12GIBCO, EUA11330032Meio basal para células H9
FGF2R& D Systems, Cingapura233– FB– 025Fator de crescimento para diferenciação H9
Linha celular H9WiCell Research Institute, Inc., EUAWA09Células-tronco embrionárias humanas
Matriz de membrana basal qualificada por hESCMatrigel, BD Biosciences, Cingapura354277Revestimento de matriz extracelular para apoiar o crescimento de células H9
Microscópio invertidoLeica Microsystems, CingapuraDMi1Para captura de campo claro imagens
Cortador a laserEpilog Helix 24 Laser SystemUsado para gerar furos passantes na chapa PDMS
mTeSR™ 1 médio Células-tronco™ Technologies, Singapore5850Meio de manutenção para células H9
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004Usado para colar o estêncil PDMS e o reservior
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapore688000Mantém as células H9 como células únicas 
STEMdiff™ APEL™ médio Células-tronco™ Technologies, Singapore5210Meio de diferenciação para células H9
Filme de tereftalato de polietilenoSureMark SingaporeSQ-6633Usado para formar estêncil 
Surfactante não iônico compatível com cultura de célulasÁcido plurônico F-127, Sigma, CingapuraP2443Reagente de passivação para repelir a adesão celular em substratos não micropadronizados

Referências

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