Este protocolo demonstra como atingir a sensibilidade de detecção femto molar de proteínas em 10 μL de sangue total em 30 min. Isso pode ser alcançado usando esteiras nanofibrosas eletrofiadas integradas em um lab-on-a-disc, que oferece alta área de superfície, bem como mistura e lavagem eficazes para melhorar a relação sinal-ruído.
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Artigo de método
Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) é um método promissor para detectar pequenas quantidades de proteínas em amostras biológicas. Os dispositivos que fornecem uma plataforma para reduzir o volume de amostra e o tempo de ensaio, bem como a automação completa, são necessários para uso potencial em diagnósticos no local de atendimento. Recentemente, demonstramos a detecção ultrassensível de proteínas séricas, proteína C reativa (PCR) e troponina cardíaca I (cTnI), utilizando um lab-on-a-disc composto por tapetes nanofibrosos (NF) de TiO2. Ele mostrou uma grande faixa dinâmica com sensibilidade de detecção femto molar (fM), a partir de um pequeno volume de sangue total em 30 min. O dispositivo consiste em vários componentes para separação de sangue, medição, mistura e lavagem que são automatizados para melhorar a sensibilidade de baixos volumes de amostra. Aqui, na demonstração em vídeo, mostramos os protocolos experimentais e know-how para a fabricação de NFs, bem como o disco, sua integração e o funcionamento na seguinte ordem: processos de preparação da esteira de TiO2 NF; impressão por transferência da esteira de TiO2 NF no disco; modificação de superfície para reações imunológicas, montagem e operação de discos; detecção no disco e resultados representativos para imunoensaio. O uso deste dispositivo permite a análise multiplexada com consumo mínimo de amostras e reagentes. Dadas as vantagens, o dispositivo deve ser usado em uma ampla variedade de aplicações e ser benéfico para facilitar a análise de proteínas pouco abundantes.
Introdução
Várias plataformas para o diagnóstico da doença foram desenvolvidos com base em materiais em nanoescala 1,2 tais como nanofios, 3 nanopartículas, nanotubos de 4, 5 e nanofibras (NFS) 6-8. Estes nanomateriais oferecem excelentes perspectivas na concepção de novas tecnologias para bioensaios altamente sensíveis devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Por exemplo, nanofibras de óxido de zinco mesoporosa têm sido utilizados para a detecção sensível de femto-molar de biomarcadores de cancro da mama. 9 Recentemente, os nanomateriais à base de dióxido de titânio (TiO 2) têm sido explora....
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Protocolo
NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis e foi recolhido em um tubo de coleta de sangue. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os voluntários.
1. Fabricação de TiO 2 NF Mat
- Preparação da solução precursora de 22
- Dissolve-se 1,5 g de tetra-isopropóxido de titânio (TTIP) numa mistura de etanol (99,9%, 3 ml) e ácido acético glacial (3 ml) e misturar a solução à TA (25 ° C) durante 30 minutos num agitador magnético.
- Dissolve-se 11% em peso de polivinil-pirrolidona (PVP) em 3,64 g de etanol (99,9%) e agita-se a solução a 65 ° C....
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Resultados
Usando este protocolo, um dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para a detecção de proteína a partir de sangue inteiro com elevada sensibilidade foi preparado. As esteiras de TiO 2 NF foram preparados por processos de electrospinning e calcinação. A fim de fabricar o diâmetro desejado de FN, morfologia, e sua espessura, electrospinning condições tais como a taxa de fluxo, tensão, e o tempo de fiação foram optimizados. Quando as condições não foram opti.......
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Discussão
O ensaio em TiO 2 NF disco integrada é uma técnica rápida, barata e conveniente para a detecção ultra-sensível de baixas proteínas abundantes presentes em muito baixo volume de sangue. Esta técnica tem a vantagem da utilização de pequenos volumes de amostra (10 ul) e é receptivo para a análise de múltiplas amostras em simultâneo. Isto proporciona um grande potencial como um dispositivo de multiplexação de imunoensaio. O dispositivo tem a vantagem adicional de que ele não requer passos de pré-tratamento da amo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) subvenções (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), uma bolsa da Korean Saúde Tecnologia R & D Project, Ministério da Saúde e Bem-Estar (A121994) e IBS-R020-D1 financiado pelo Governo coreano.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bolacha de si | LG SILTRON | Polished Wafer, grau de teste | Diâmetro (mm) = 150, orientação = < 100>, dopante = boro, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, espessura (μ m) = 650 - 700 |
| Policarbonato (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Espessura (mm) = 1 e 5 |
| Tetraisopropóxido de titânio, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polivinilpirrolidona, Mw = 1.300.000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Ácido acético | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Etanol anidro | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)-1-triclorosilano | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS e agente de cura | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Etanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| Espectroscopia de fotoelétrons de raios-X | ThermoFisher | K-alpha | |
| Máquina de modelagem 3D | M & I CNC Lab, Coreia | Fresadora CNC | |
| Máquina de distribuição de cera | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Coreia | ||
| Fita adesiva dupla face | FLEXcon, EUA | DFM 200 transparente 150 POLY H-9 V-95 | |
| Plotter de corte | Graphtec Corporation, Japão | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Revestidor giratório | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Forno (calcinação) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Reômetro (Teste de aderência) | Thermo Scientific | Haake MARS III - Pacote | |
| Sistema de plasma de oxigênio | FEMTO | CUTE | |
| Camundongo monoclonal anti-humano hsCRP | Hytest Ltd., Finlândia | 4C28 | clone # C5) |
| Rato monoclonal anti-cTnI | Hytest Ltd., Finlândia | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP cabra conjugada policlonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP camundongo conjugado monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Albumina bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Tubos de coleta de sangue | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7,2 mg mais tubos de coleta de sangue |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Leitor modular de placas multietiquetas | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Máquina de operação de disco | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Coréia | ||
| Tubo fotomultiplicador personalizado (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Versão 2012 | Software de design |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Versão 2013 | Software de design 3D, |
| Edgecam | Vero | versão 2009.01.06928 | Software de geração de código |
| DeskCNC | Carken Co. | versão 2.0.2.18 | Software da fresadora CNC |
Referências
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-....
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Reimpressões e permissões
