É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

IV infusão contínua é a Rota escolha no tratamento da arginina-vasopressina Receptor Blocker conivaptan em camundongos para Estudar evocadas por acidente vascular cerebral Edema

8.5K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/54170

⸱

1 de setembro de 2016

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

Neste artigo

Resumo

Nossos estudos revelaram que os efeitos benéficos do conivaptan dependem do método de entrega após o AVC experimental em camundongos. Desenvolvemos um protocolo de pesquisa para a entrega do bloqueador do receptor via cateter IV na formação de edema cerebral evocado por AVC em camundongos.

Resumo

AVC é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. AVC é complicada por edema cerebral e outros eventos fisiopatológicos. Entre os jogadores mais importantes no desenvolvimento e evolução do edema cerebral evocada-acidente vascular cerebral é a hormona arginina-vasopressina e seus receptores, V1a e V2. Recentemente, o V1a e V2 bloqueador do receptor conivaptan tem atraído a atenção como um potencial medicamento para reduzir o edema cerebral após acidente vascular cerebral. No entanto, os modelos animais que envolvem aplicações conivaptan em pesquisa AVC precisa ser modificada com base em rotas viáveis ​​de administração. Aqui os resultados de 48 h intravenosa contínua (IV) são comparados com os tratamentos por via intraperitoneal (IP) conivaptan após acidente vascular cerebral experimental em ratinhos. Foi desenvolvido um protocolo em que a oclusão da artéria cerebral média foi combinado com a passagem do cateter na veia jugular para o tratamento de IV conivaptan (0,2 mg) ou veículo. Diferentes grupos de animais foram tratados com 0,2mg bolus de conivaptan ou veículo IP diariamente. edema cerebral evocada tempos experimental foi avaliada em ratinhos após IV contínua e tratamentos IP. A comparação dos resultados revelou que a administração IV contínua de conivaptan alivia edema cerebral pós-isquêmica em ratos, ao contrário da administração IP de conivaptan. Conclui-se que o nosso modelo pode ser utilizado para estudos futuros de aplicações conivaptan no contexto de acidente vascular cerebral e edema cerebral.

Introdução

O AVC continua a ser um fardo enorme para pacientes e médicos. Modelos de AVC animal têm sido usados em laboratório há quase duas décadas. 1 No entanto, os tratamentos experimentais que funcionam em animais geralmente falham em humanos. 2 Essa discrepância nos resultados do tratamento pode ser devido a vários fatores, como vias de administração de medicamentos usados em pesquisas com animais, metabolismo e taxa de eliminação de medicamentos e muitos outros aspectos. Uma das principais complicações do acidente vascular cerebral, o edema cerebral, é um foco de pesquisa atual em neurociência. Os mecanismos de formação de edema cerebral envolvem distúrbios no equilíbrio hídrico e eletrolítico desencadeados pela resposta arginina-vasopressina (AVP) à lesão cerebral isquêmica. 3 Portanto, o AVP e seus receptores (V1a e V2) são o foco principal dos estudos de pesquisa sobre a formação de edema cerebral pós-isquêmico. 3

Desenvolvemos uma metodologia para estudar os efeitos do bloqueador do receptor misto arginina-vasopressina (V1a e V2) conivaptan no edema cerebral pós-isquêmico em camundongos. 4 Alvos moleculares do conivaptan5 tornam a droga um candidato adequado para a exploração de suas propriedades no alívio do edema cerebral. Além disso, o conivaptan precisa ser estudado no contexto de eventos fisiopatológicos do AVC. 6 Ao projetar este estudo, consideramos comparar os resultados do tratamento usando duas vias diferentes de administração de conivaptano: intravenosa (IV)4 e intraperitoneal (IP). 7 Foram avaliados os efeitos dos tratamentos no edema cerebral induzido por AVC. Aqui são descritos protocolos detalhados para indução cirúrgica de AVC experimental por oclusão da artéria cerebral média (MCAO) e seguidos de tratamento contínuo com conivaptan usando a instalação de um cateter intravenoso jugular. Após a indução do acidente vascular cerebral, os animais foram alocados aleatoriamente nos seguintes grupos: veículo ou conivaptan (0,2 mg/dia) tratados IV ou IP.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os experimentos foram realizados de acordo com as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisa e foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Swedish Medical Center. Todos os procedimentos foram realizados com técnicas assépticas apropriadas. Os animais experimentais utilizados para o estudo eram do sexo masculino, 3 meses de idade, tipo selvagem C57 com o peso corporal de 25 a 27 g.

1. Indução In Vivo do traçado

  1. Pré-revestir o filamento com resina dentária antes da cirurgia.
    1. Corte um pedaço longo 12 mm de filamento de uma sutura 7-0 nylon. Misturar 2 partes da resina com 1 parte de endurecedor, e em seguida, mergulhar imediatamente a ponta do filamento na mistura para cobrir cerca de 1/3 do comprimento total. Removê-lo de forma rápida e verificar se ele está coberto com um revestimento de superfície lisa de resina dental.
    2. Ar secar o filamento durante 2 horas antes da utilização.
  2. Posicione o mouse em umN câmara de indução de anestesia (2 L de volume), e estabelece o caudal de 1,5% de isoflurano em ar ambiente enriquecido em oxigénio a 25% em 2 L / min indo para dentro da câmara.
  3. Permitir que o rato permanecer na câmara de indução até ser completamente anestesiado, 8 como determinado por falta de resposta a beliscão cauda.
  4. Posicione o mouse sobre a mesa de operação com uma almofada aquecida, e definir a concentração de isoflurano em 1% para a manutenção da anestesia entregues espontaneamente através do cone do nariz.
  5. Grampo de cabelo na parte da frente ea parte de trás do pescoço, e pulverizar o pescoço com álcool. Aplicar pomada oftálmica veterinária em ambos os olhos.
  6. Para monitorar continuamente a temperatura do corpo, use uma sonda de temperatura rectal ligado ao display digital durante a cirurgia.
  7. Posicione o mouse na posição supina, aplicar a solução matagal iodopovidona 10% para desinfecção, cobrir com uma cortina estéril, e depois fazer uma incisão na linha média ao longo do pescoço com uma lâmina de bisturi tamanho 10 cirúrgica.
  8. Temporariamente ligar a artéria carótida comum esquerda (CCA) com sutura 6,0 seda.
  9. Coloque outro empate na artéria carótida externa esquerda (ECA).
  10. Coloque um clipe microvascular na artéria carótida interna (ACI).
  11. Corte um pequeno buraco na artéria carótida externa com uma tesoura microvasculares. Insira um filamento feita a partir de 7-0 sutura nylon revestido com resina odontológica na abertura da ECA, e fazê-la avançar cefalicamente, ao remover o clipe, até sentir resistência (cerca de 5-7 mm de distância do ponto de bifurcação da CCA).
  12. Coloque um laço temporária para a artéria carótida interna para proteger o filamento em posição. Consulte o diagrama, a figura 1A. Fechar a pele com uma sutura de seda, e infiltrar-se na ferida na parte da frente do pescoço com 0,2 ml de 0,5% de bupivacaina, como no passo 2.6.
  13. Permitir que o mouse para despertar da anestesia e recuperar a consciência em uma câmara de recuperação para 60 min. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperadoconsciência suficiente para manter decúbito esternal.
  14. Teste o mouse para déficit neurológico pontuação (NDS) como segue: 0 = Função normal de motor, 1 = flexão do tronco e dos membros anteriores contralateral no elevador cauda, ​​2 = circulando para o lado contralateral, mas a postura normal em repouso, 3 = inclinar-se para contralateral lado em repouso, 4 = nenhuma atividade motora espontânea. 4,9
    1. Para o teste NDS, levante rato pela cauda e coloque sobre uma superfície plana para observação (2-3 min). Alternativamente, os ratinhos observar na câmara de recuperação. Excluir ratos que exibem NDS menor do que 2 a partir da experiência, devido à oclusão da MCA insuficiente.
      Nota: técnica de fluxometria de Doppler a laser pode ser utilizado para confirmar a oclusão MCA 9-11.
  15. Re-anestesiar o animal depois de 60 minutos de recuperação na câmara de indução como descrito acima, a re-esterilizar a incisão na pele com a anterior solução de iodo-povidona esfoliação de 10%, e reabrir a ferida cirúrgica nafrente do pescoço, cortando e removendo o fio de seda.
  16. Para remover o filamento a partir do TCE executar os seguintes passos:
    1. Coloque um clipe microvascular no ICA. Desatar a sutura na ICA e puxe o fio para fora, mantendo clipe aberto.
    2. Feche o clipe e coloque um laço para a ECA proximal ao corte.
    3. Remover o grampo e remover a ligadura do CCA para restaurar o fluxo sanguíneo para o cérebro. Consulte o diagrama, figura 1B.

2. Instalação de IV cateter na veia jugular para Contínuo Tratamento 48 hr

Nota: Proceder à instalação do cateter imediatamente após o passo 1.16.3 sem despertar do mouse.

  1. Usar dois tamanhos diferentes de tubo flexível: inserir o tubo interior (0,94 mm de diâmetro externo, para conter a droga a ser infundido) para dentro do tubo exterior (3,18 mm de diâmetro externo; para a protecção do tubo interior).
  2. Pate o rato na posição de pronação, aplicar a solução de iodo-povidona esfoliação de 10% para a desinfecção, e fazer uma incisão de 1 cm na parte de trás do pescoço com uma lâmina de bisturi cirúrgico tamanho 10. Ligue o rato na posição supina, re-esterilizar a frente do pescoço com uma solução de iodo-povidona esfoliação de 10%, e reabrir a ferida cirúrgica na parte da frente do pescoço. Túnel o tubo sob a pele da incisão feita na parte de trás para a frente do pescoço, e exterioriza-lo a partir da ferida aberta 1 cm.
  3. Remover o tecido adiposo subcutâneo a partir do lado esquerdo da parte frontal do pescoço cerca de 1 cm lateralmente a partir da linha média. Localizar a veia jugular esquerda, colocar dois laços ao longo da veia 5 mm entre si, e ligeiramente alongar a veia. Faça um pequeno furo na veia jugular entre os dois laços com tesouras microvasculares; insira a ponta do interior mm caudal profunda tubo 5 (para o coração).
  4. Fixe o tubo com ambas as ligações com a veia jugular. Fechar a pele na parte da frente do pescoço comuma sutura de seda 3-0. Consulte o diagrama, Figura 1C.
  5. Fixar o tubo à pele na parte posterior do pescoço com uma sutura, e ligar a tubagem a uma bomba microinfusion IV através de um suporte giratório. O giro permite a livre circulação de ratos dentro da gaiola com total acesso ao alimento e água.
  6. Infiltrar nas incisões na pele na parte da frente ea parte de trás do pescoço com 0,2 ml de bupivacaína a 0,5% para evitar a dor pós-operatória.
    Nota: Dependendo de protocolos específicos de origem animal institucionais, os animais podem ser tratados com opióides, antiinflamatórios ou antibióticos pré e pós-operatório. No entanto, os tratamentos mencionados podem alterar os resultados do acidente vascular cerebral isquêmico resultado (ver secção Discussão). 11-14
  7. Permitir que o animal para despertar na câmara de recuperação, e em seguida, abrigar o animal numa gaiola separada até que o ponto final da experiência. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter esternaldecúbito.
  8. Ajuste a velocidade de infusão para o tratamento contínuo de 48 horas de conivaptan IV (0,14 mg / ml em 5% de dextrose) ou veículo a 1,5 ml / kg / h, 4 e iniciar a infusão.
    Nota: A quantidade total de IV conivaptan infundido deve ser aproximadamente 0,2 mg / rato / dia, num volume total de 1,44 ml.
    Nota: Executar injecção intraperitoneal (IP) de conivaptan duas vezes por dia com uma quantidade total de 0,2 mg em 1,44 ml de dextrose a 5%. Implementar injecção IP foi como anteriormente descrito. 15 Restrain ratinhos agarrando a pele da superfície posterior do corpo e a cauda. Injectar conivaptan ou veículo para o quadrante inferior esquerdo do abdômen utilizando a / 1 agulha polegadas 26 G / 2. 15
  9. Observar os animais duas vezes por dia para toda a duração da experiência (48 horas). Que os animais possam ter pleno acesso a comida e água. Se o animal apresenta sinais de sofrimento ou dispneia consultar um veterinário. Se a eutanásia é necessária para o animal em dist graveRess referem-se ao passo 3.1 abaixo, e excluir o animal do estudo.

3. Avaliação da evocadas por acidente vascular cerebral Edema no ponto final

  1. Sacrificar o mouse por excesso de anestesiar com 5% de isoflurano.
  2. Use um bisturi para fazer uma incisão na pele sobre o osso do crânio ao longo da linha média, e retrair a pele para expor todo o crânio sobre o cérebro. Começando no forame magno, cortar o osso do crânio lateralmente ao longo do perímetro do cérebro de cada lado, e levante-o com cuidado, sem tocar o cérebro por baixo. Cortar o cérebro a partir da espinha e os nervos ligados à base do crânio.
  3. Remover o cérebro, separá-lo do bolbo olfactivo e no cerebelo, e dissecar o cérebro ao longo da fissura inter nos hemisférios cerebrais isquémicos e não isquémicos, como anteriormente descrito. 9
  4. Avaliar edema cerebral, comparando wet-a-seco proporções (WDR), como descrito anteriormente 4,9. pesar tecidosantes e depois de secar durante 3 dias a 100 ° C num forno. Calcular o teor em água no cérebro (BWC) como% de H 2 O = (peso 1-seca. / Peso molhado.) X 100%.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A temperatura corporal dos animais foi dentro do intervalo fisiológico e estável ao longo do procedimento cirúrgico de indução de acidente vascular cerebral. Dois ratos que exibiram NDS menor do que 2, imediatamente após a MCAO foram excluídos do estudo.

MCAO em ratos produz o volume de enfarte no hemisfério ipsilateral às 48 h. Avaliação das fatias manchadas de TTC mostra que cerca de 50% do hemisfério é afectada por enfarte ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este estudo tem um valor importante para a investigação pré-clínica acidente vascular cerebral. Este estudo revela que a infusão IV contínua de conivaptan (0,2 mg / dia) depois de acidente vascular cerebral experimental em ratinhos reduz eficazmente o edema cerebral após 48 horas de tratamento. O efeito da injecção IP do mesmo na dose de conivaptan edema cerebral também foi investigada. tratamento conivaptan por ambas as vias IP e IV produz aquarese em ratos, tal como indicado por: 1) aumento da osmolalidade do plasma u...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Swedish Medical Center for fornecer o financiamento e instalações. Agradecemos também Craig Hospital para o uso generoso de espaço de laboratório.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Almofada aquecidaK& H Manufacturing Inc1060
Monitor de Temperatura com Sonda RetalPhysitemp7029
Carretel de Sutura de Seda, 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
Sutura de Seda em uma Agulha, 3-0Sutura de Nylon Ethicon1684G
, 7-0Resina Dental Ethicon1696G
Polissiloxano com EndurecedorHeraeus Bomba IV deKulzer 65817930
Kent ScietificGT0897
Giratória 22GAInstech375/22PS
Tubulação de Laboratório, 0,94 mm x 0,51 mmDow Corning508-002
, 3,18 mm x 1,98 mmDow Corning508-009
Microinfusão Tubulação de Laboratório

Referências

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Administração de ConivaptanTratamento IntraperitonealOclusão da Artéria Cerebral MédiaCateterização da Veia JugularAvaliação do Edema CerebralModelo de AVC em CamundongoVia de Administração de FármacosBloqueador dos Receptores V1a e V2Edema Cerebral Pós-isquêmico
IV infusão contínua é a Rota escolha no tratamento da arginina-vasopressina Receptor Blocker conivaptan em camundongos para Estudar evocadas por acidente vascular cerebral Edema
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.