Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

Resumo

Modificamos as condições para a geração de células DFAT e fornecemos aqui informações sobre o uso de um meio de crescimento aprimorado para a produção dessas células.

Resumo

engenharia de tecidos e terapia celular são uma grande promessa clinicamente. A este respeito, as células multipotentes, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs), pode ser utilizado terapeuticamente, no futuro próximo, para restaurar a função de órgãos danificados. No entanto, várias questões técnicas, incluindo o procedimento altamente invasivo de isolar MSCs e da ineficiência que cerca sua amplificação, atualmente dificultam o potencial uso clínico dessas modalidades terapêuticas. Aqui, nós apresentamos um método altamente eficiente para a geração de células indiferenciadas de gordura (DFAT), células MSC-like. Curiosamente, as células DFAT podem ser diferenciados em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogênico, e células condrogênicas. Embora outros grupos apresentaram anteriormente vários métodos para gerar células DFAT a partir de tecido adiposo maduro, nosso método nos permite produzir células DFAT de forma mais eficiente. A este respeito, foi demonstrado que o meio de cultura DFAT (DCM), suplementado com FBS a 20%,é mais eficaz na geração de células DFAT que DMEM, suplementado com 20% FBS. Além disso, as células DFAT produzidos pelo nosso método de cultura de células pode ser redifferentiated em vários tipos de tecidos. Como tal, é apresentado um modelo muito interessante e útil para o estudo de desdiferenciação tecido.

Introdução

A terapia celular e engenharia de tecidos são tópicos quentes no campo da medicina regenerativa ^1-5. Embora essas modalidades terapêuticas são uma grande promessa, várias questões técnicas actualmente dificultam a sua utilização clínica. A este respeito, como na geração de células iPS, todas as terapias de engenharia de tecidos devem produzir células livres de transduções de genes externos, a fim de manter a segurança do paciente. Dessa forma, foram o primeiro grupo a produzir com sucesso células DFAT humanos ^6. Vários outros grupos de pesquisa têm uma vez adoptada nosso método para gerar células de origem em mamíferos DFAT ^7-9, destacando ainda mais a utilidade do nosso modelo.

Ao longo de vários estudos, verificou-se que a qualidade do ambiente de cultura de células podem ser modificadas por ajustamento do teor do meio celular. Esta descoberta conduziu a um aumento na taxa de sucesso da produção de células DFAT e melhoria da qualidade de células; ambos os fatores críticos paraeficiente geração de células para futuros ensaios clínicos. A este respeito, um melhor meio de cultura DFAT (DCM, um produto semelhante a CTM a forma de células, que contém a insulina recombinante humana, albumina de soro, ácido L-glutâmico, vários ácidos gordos, e colesterol) e um método para a geração de células DFAT e proliferação foi desenvolvido (mais informações sobre o conteúdo do DCM está disponível mediante solicitação). Usando este método de elevada qualidade DFAT células foram gerados com a capacidade de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogénica, e as células condrogénicas. Ao todo, este protocolo de cultura celular validado melhora a qualidade das células DFAT e pode ser bastante útil para melhorar aplicações clínicas de terapia celular e engenharia de tecidos.

Protocolo

As amostras de gordura subcutânea humana foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia nos Departamentos de Cirurgia Plástica, Urologia, Cirurgia Pediátrica e Cirurgia Ortopédica da Universidade Nihon Itabashi Hospital (Tóquio, Japão). Os pacientes deram consentimento informado por escrito, e do Comité de Nihon University School of Medicine de Ética aprovou o estudo.

1. Preparação do Tecido

1. Traga a amostra de tecido da sala de operações para o laboratório.
2. Lavar 1-2 g de tecido adiposo com 5 ml de PBS (-) à temperatura ambiente (TA), uma vez, em um tubo de 50 ml e, em seguida, colocar a amostra num prato de plástico de 10 cm.

2. A colagenase digestão

1. Retirar a amostra do PBS (-), em seguida, adicionar 10 ml de solução estéril de 0,1% (w / v) de solução de colagenase (colagenase de tipo II) para o prato que contém a amostra de tecido.
2. Picar o tecido com tesouras cirúrgicas durante aproximadamente 15 minutos, até que se atinja um puré consistemrência.
3. Subsequentemente, digerir o tecido picada no 0,1% (w / v) de solução de colagenase a 37 ° C durante 30 minutos (60 rpm) num tubo de 50 ml com agitação suave num agitador.
4. Filtrar a amostra digerida através de um filtro de 100 um para um tubo de 50 ml. Em seguida, passar 10 ml de DCM (ver Tabela de Materiais) suplementado com FBS a 2% através do filtro.

Isolamento 3. celular

1. Centrifugar as células filtradas em 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
2. Neste ponto, preparar 5 ml de DCM suplementado com FBS a 2% em um tubo de 50 ml.
3. Em seguida, elaborar as células de gordura flutuantes utilizando uma pipeta ul 1.000 e adicionar as células a um meio contendo 50 ml tubo.
4. Posteriormente, agite o tubo de 50 ml suavemente para misturar o meio DCM com as células.
5. Em seguida, o tubo de centrifugação a 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
6. Descartar a forma na parte inferior do tubo, usando uma agulha 18 G e seringa de 20 ml.
7. Em seguida, adicione 10 ml de DCM supplemented com FBS a 2% para as células colhidas.
8. Misturar o DCM com as células por agitação no tubo de 50 ml suavemente.
9. Centrifuga-se o tubo a 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente.

4. Células chapeamento

1. Adicionar 41 ml de DCM ou DMEM suplementado com FBS a 20% a um frasco de 12,5 centímetros.
2. Em seguida, utilizando uma pipeta de 200 uL adicionar 40 ul de células de gordura para o balão.
3. Em seguida, encher o frasco com DCM ou DMEM suplementado com 20% FBS. Passo crítico: Neste momento, assegurar que as células estão espalhados por todo o meio. Verificar visualmente as células destacadas e depois manter o frasco sobre a tampa de uma placa de Petri rodada para mantê-lo liso.
4. Finalmente, colocar o balão no interior da incubadora e deixá-la sem ser perturbado em uma incubadora de CO ₂ a 5% a 37 ° C durante 7 dias.
5. Na sequência de uma semana de incubação, inverter o frasco e verificar se as células DFAT. Em seguida, avaliar DFAT geração de células de proficiência, como descrito ¹⁰ desde a este ponto fibroblcélulas AST-like (células DFAT) estão localizados em regiões distintas a partir de células de gordura.
6. Adicionar 5 ml de DCM ou DMEM suplementado com FBS a 20% para o balão a seguir à remoção do meio de cultura de células anterior. Permitir que as células DFAT a crescer por mais uma semana depois de mudar o meio.
7. Utilizando um contador de células, contar o número de células DFAT gerados sob várias condições de cultura de células (DCM vs DMEM).

Resultados

Neste estudo, o método e o kit de ferramentas para a geração de célula DFAT foi melhorada (Figura 1). O nosso método permite gerar células DFAT usando tanto DCM e meio DMEM contendo 20% de FBS (Figura 2A). Como tal, comparou-se a eficiência de DCM e DMEM na geração de células DFAT. A este respeito, o DCM promoveu a proliferação de células DFAT por três vezes quando comparado com DMEM, independentemente do número de adipócitos (Figura 2A ...

Discussão

Adipócitos maduros que passam na desdiferenciação vitro, um processo conhecido como cultura de teto, pode reverter para um fenótipo mais primitivo e ganhar habilidades proliferativa. Estas células são referidas como células de gordura (desdiferenciado DFAT). foi avaliado o potencial de diferenciação das células multilinhagens DFAT. A análise de citometria de fluxo e análise da expressão de genes revelaram que as células DFAT eram altamente homogénea em comparação com ⁶ ASC. Na verdade, o per...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CSTI303-MSC médio	CSTI	87-671	Este meio é definido como DCM no texto
PBS(-)	Wako	166-23555	Não contém Mg2+ e Ca2+
DMEM meio	Gibco	11965-092
Soro Bovino Fetal	Sigma	172012
Colagenase tipo II	Sigma	C-6885
Tesoura	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Agitador	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Filtro de Células Falcon 100 μ m Amarelo	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5 cm² Cantil de Cultura de Células de Pescoço Retangular com Tampa de Rosca Azul Ventilada	CORNING LIFE SCIENCES
agulha de 18 G	NIPRO	02-002
Seringa de 20 ml	NIPRO	08-753
Contador de relhas série Z	BECKMAN RELHA	383550