Detecção de proteínas de ligação a ARN pela<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down em Cultura adipócito

Qianfan Bai; Zhiqiang Bai; Shaohai Xu; Lei Sun

doi:10.3791/54207

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Artigo de método

Detecção de proteínas de ligação a ARN pela

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DOI:

10.3791/54207

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22 de julho de 2016

Qianfan Bai^*¹ , Zhiqiang Bai^*¹ , Shaohai Xu³ , Lei Sun¹^,²

¹Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, ²Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, ³Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

^* These authors contributed equally

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Resumo

Um protocolo de pull-down ARN é optimizado aqui para a detecção de interacções entre proteínas de ligação a ARN (RBPs) e não-codificante, bem como ARN de codificação. Um fragmento de ARN a partir do receptor de androgénio (AR) foi usado como um exemplo para demonstrar como recuperar a sua RBP de lystate de adipócitos primários castanhos.

Resumo

proteínas de ligação a ARN (RBPs) estão a emergir como uma camada reguladora no desenvolvimento e função do tecido adiposo. RBPs desempenhar um papel-chave na regulação da expressão de genes aos níveis pós-transcricional por afectar a estabilidade e eficiência de translação de ARNm alvo. técnica pull-down ARN tem sido amplamente utilizado para estudar a interacção RNA-proteína, que é necessário para elucidar o mecanismo subjacente a função ', bem como RNAs não-codificantes longos' RBPs (lncRNAs). No entanto, a abundância de lípidos alta nos adipócitos representa um desafio técnico na realização deste experimento. Aqui, um protocolo de pull-down RNA detalhada é otimizado para a cultura de adipócitos primário. Um fragmento de RNA a partir de (AR) «Região do receptor de andrógeno 3 não traduzida (3'UTR) contendo um elementwas rica adenilato-uridilato usados como exemplo para demonstrar como recuperar seu parceiro RBP, proteína Hur, de lystate adipócitos. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar as interacções entreRBPs e RNAs não codificadoras, bem como entre RBPs e RNAs de codificação.

Introdução

RBPs são proteínas que se ligam ao ARN de cadeia dupla ou simples em células e participam na formação de complexos de ARN-proteína. RBPs pode ligar-se uma variedade de espécies de ARN, incluindo ARNm e ARN não codificantes longos (lncRNAs), e exercem a sua influência aos níveis pós-transcricional. Ambos os RBPs e lncRNAs estão emergindo como novos reguladores no desenvolvimento adiposo e funcionar ^1,2,3. Para compreender o mecanismo de RBP- e regulação mediada por lncRNA de vias celulares, é muitas vezes necessário para detectar a interacção entre uma molécula de ARN específica e um ou vários RBPs, e, por vezes, para identificar o espectro completo de parc....