Dois ensaios para triagem de alto rendimento baseada em microscopia de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella são descritos. O ensaio de entrada detecta os fatores do hospedeiro necessários para a entrada de Brucella e o ensaio de endpoint aqueles necessários para a replicação intracelular. Embora aplicável para abordagens alternativas, a triagem de siRNA em células HeLa é usada para ilustrar os protocolos.
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Artigo de método
Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espécies de Brucella são facultativos patógenos intracelulares que infectam os animais como seus hospedeiros naturais. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados e pode levar a infecções crónicas graves.
Brucella podem invadir células fagocíticas profissionais e não profissionais e replica dentro do retículo endoplasmático (ER) vacúolos -derived. Os fatores do hospedeiro necessárias para a entrada Brucella em células hospedeiras, evitar a degradação lisossomal, e replicação no compartimento de ER-like permanecem largamente desconhecidos. Aqui nós descrevemos dois ensaios para identificar fatores do hospedeiro envolvidos na entrada de Brucella e replicação em células HeLa. Os protocolos descrevem a utilização de interferência de ARN, enquanto que os métodos de rastreio alternativos podia ser aplicado. Os ensaios baseiam-se na detecção de bactérias marcadas com fluorescência em células hospedeiras marcados fluorescentemente utilizando automatizadomicroscopia de campo amplo. As imagens fluorescentes são analisados por meio de uma tubagem de análise de imagem normalizado em CellProfiler único que permite marcar a infecção com base em células.
No ensaio de ponto final, a replicação intracelular é medido dois dias após a infecção. Isso permite que as bactérias tráfego para o seu nicho de replicação, onde a proliferação é iniciada cerca de 12 horas após a entrada bacteriana. Brucella que estabeleceram com sucesso um nicho intracelular terá assim fortemente proliferaram dentro das células hospedeiras. Uma vez que as bactérias intracelulares irão em muito ultrapassam as bactérias não-replicativos intracelulares ou extracelulares individuais, uma estirpe que expressa constitutivamente a GFP pode ser utilizado. O sinal de GFP forte é então utilizado para identificar as células infectadas.
Em contraste, para o ensaio de entrada é essencial para diferenciar entre intracelular e bactérias extracelulares. Aqui, uma estirpe que codifica para uma GFP tetraciclina indutível é utilizado. Induçãode GFP com inactivação simultânea de bactérias extracelulares por gentamicina permite a diferenciação entre as bactérias extracelulares e intracelulares com base no sinal de GFP, com apenas bactérias intracelulares ser capaz de expressar GFP. Isto permite a detecção de bactérias intracelulares robusta simples antes proliferação intracelular é iniciada.
Introdução
Espécies de Brucella são gram-negativas, agentes patogénicos intracelulares facultativos que pertencem à classe de α-Proteobacteria. Eles causar abortos e infertilidade em seus hospedeiros naturais, tais como gado, cabras, ou ovelhas, resultando em graves perdas económicas em áreas endêmicas. A brucelose é uma das doenças zoonóticas mais importantes do mundo, causando mais de meio milhão de novas infecções humanas por ano 1. A transmissão para humanos é mais comumente causada por contato direto com animais infectados ou pela ingestão de alimentos contaminados, como leite não pasteurizado. Os sintomas da doença são febril inespecífica, o que provoc....
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Protocolo
Nota: Todo o trabalho com cepas Brucella abortus vivos deve ser realizada dentro de um laboratório de nível de biossegurança 3 (BSL3), considerando todos os regulamentos necessários e precauções de segurança.
1. Preparação das placas de triagem e Cultivo de bactérias e células
- Preparação de culturas de arranque Brucella abortus
- Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) do estoque de leite C -80 ° em uma placa Tryptic Soy Agar (TSA) contendo 50 ug / ml de canamicina (TSA / Km). Incubar a placa durante 3-4 dias a 37 ° C. Use estirpe Brucella abortus 2308 pJC43 (aphT :: GFP....
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Resultados
A Figura 1A mostra um exemplo de análise de imagem usado para identificar automaticamente as células infectadas no ensaio de ponto final. Núcleos de células HeLa coradas com DAPI foram identificados, um peri-núcleo de largura 8 pixels em torno do núcleo, e um corpo da célula de Voronoi por extensão do núcleo por 25 pixels foram calculados. Uma vez que as bactérias proliferam principalmente no espaço peri-nuclear, a intensidade de GFP nesta área da célula é a medida mais .......
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Discussão
Os patógenos bacterianos desenvolveram inúmeras estratégias para manipular as células hospedeiras eucarióticas em seu benefício. Os patógenos que causam infecções agudas geralmente apresentam rápida proliferação, acompanhada por alarmismo significativo do sistema imunológico e perda de viabilidade das células infectadas. Em contraste, Brucella e outros patógenos que causam infecções crônicas conseguem estabelecer interações duradouras dentro das células hospedeiras. Portanto, as bactérias precisam ajustar as fun.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas 51RT 0_126008 e 51RTP0_151029 para o projeto de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico (RTD) InfectX e TargetInfectX, respectivamente, no âmbito da SystemsX.ch, a Iniciativa Suíça para Biologia de Sistemas. Reconhecemos o 310030B_149886 de concessão da Swiss National Science Foundation (SNSF). O trabalho de S.H.L. e A.C. foi apoiado pelo Programa Internacional de Doutorado "Fellowships for Excellence" da Biozentrum. Simone Muntwiler é reconhecida pela assistência técnica. Gostaríamos de agradecer a Dirk Bumann por fornecer o pNF106 e Jean Celli pelo pJC43 e pJC44.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar Soja Tríptica (TSA) | BD | 236950 | |
| Caldo de Soja Tríptico (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Sulfato de canamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Leite | |||
| 250 ml garrafa com tampa de rosca | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Soro de bezerro (FCS) | Gibco | 10270 | inativada por calor |
| (0,5%) | Gibco | 15400-054 | 10x solução estoque, diluir 1:10 em PBS |
| Cete 2.0 Contador de células | Merck Milipore | PHCC20060 | Dispositivos alternativos de contagem de células podem ser usados |
| Placa Greiner CELLSTAR de 384 poços | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Folha de alumínio destacável | Costar | 6570 | |
| : "Dispensador de reagente Multidrop 384" | Thermo Scientific | 5840150 | Dispensador de reagente alternativo pode ser usado. |
| Reagente de transfecção: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Lavadora de placas automatizada: "Lavadora de placas ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | Esta lavadora de placas contém um coletor de 16 canais adequado para placas de 384 poços. Ele se encaixa em um gabinete de biossegurança e possui uma tampa cobrindo a placa durante a lavagem, o que reduz o risco de produção de aerossóis. Arruelas de placas alternativas com características semelhantes podem ser usadas. |
| Gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Cloridrato de anidrotetraciclina | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μ g/ml de etanol a 100% é mantida a -20 &graus; C protegido da luz em folha de alumínio |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolver em tampão HEPES 0,2 M, pH 7,4. Armazene a -20 > C e descongele fresco no dia anterior à utilização. Cuidado, o PFA é tóxico por inalação, em contato com a pele e se ingerido. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| siRNA embaralhado | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP) | Construção: pJC44 4 foi digerido com EcoRI seguido pela geração de extremidades rombas com enzima Klenov e subsequente digestão com SalI. TetR-GFP foi amplificado a partir de pNF106 usando o primer prAC090 e prAC092. Após a digestão com SalI, o produto TetR-GFP foi ligado ao vetor pJC44 digerido. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT | |
| TC HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Microscópio de imagem celular automatizado equipado com um estágio Z motorizado de precisão. Sistemas alternativos para microscopia automatizada e componentes alternativos para hardware e software especificados abaixo podem ser empregados. |
| Foco Automático a Laser de Alta Velocidade | 1-2300-1037 | ||
| CFI Super Fluor 10X objetiva | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Mola Fotométrica |
| CoolSNAP HQ Câmera CCD Monocromática | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1.392 x 1.040 pixels de imagem, 6,45 x 6,45 µ m pixels, digitalização de 12 bits |
| Software MetaXpress | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Motor de luz. As seguintes fontes de luz são usadas: violeta (DAPI), ciano (GFP), verde/amarelo (RFP) |
| Excitador de banda única para DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Emissor de banda única para DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Banda única dicróica para DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| Excitador de banda única para GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Emissor de banda única para GFP | Semrock | FF01-520 / 35-25 | |
| Banda única dicróica para GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Excitador de banda única para RFP | Semrock | FF01-562 / 40-25 | |
| Emissor de banda única para RFP | Semrock | FF01-624 / 40-25 | |
| Banda única dicróica para RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
Referências
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their ....
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Reimpressões e permissões
