Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54278
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Delft University of Technology

Introduction

במהלך מיטוזה, הכרומוזומים של הגנום משוכפל מאורגנים בקו המשווה התא כדי להבטיח חלוקה שווה של כרומטידה אחות מעל לתאי הבת שהוקמה זה עתה. מיצוב ובידול כרומוזום מתווכים על ידי זיקתם microtubules ציר שמקורם שני centrosomes המנוגד. בנוסף להבטיח הפצת כרומוזום נאמנת, את הכיוון של ציר mitotic מכתיב גם את חלוקת תא המטוס 1. אורינטציה מתואמת של חלוקת תא חיונית בשלבים רבים של פיתוח עבור הומאוסטזיס רקמות 2. באופן ספציפי, מיקום ציר mitotic מוסדר יכול לגרום החלוקה הסימטרית של תוכן סלולארי או אפילו לייצר תאי בת בגדלים שונים 2. הרכבת וכיוון ציר mitotic מתחילים ב prophase והוא בניצוחו גומלין מורכב בין פעולה וקוממו כוח-גנרטורים 3,4. הכוחות שנוצרו מורכבים בכוחות משיכה ודחיפה oth. כוחות אלה נובעים הם מאנשי קשר ציר עם קליפת התא, כמו גם מתוך הכישור, והוא יכול להיוצר על ידי דינמיקת microtubule כמו גם על ידי מנועים מולקולריים-linkers צלב (איור 1).

כוחות דוחפים יכול להיווצר כאשר microtubules לגדול נגד מבנים קשיחים כגון קליפת התא. בהתאם הכח להתנגד הכולל שנוצר במערכת, זה יכול לגרום מחדש של ציר mitotic (כוחות נמוכים) או לעורר קריסת microtubule או אסון (כוחות גבוהים) 5-8. כמות הכח שניתן שנוצרה על ידי דחיפה תלויה באורך microtubule, כיוון שאורך הוא הקובע חזק של microtubule-קריסת 9. בנוסף, microtubules שמקורן centrosome אחד יכול לדחוף כנגד centrosome אחרים, מנגנון אשר הוצע לנהוג הפרדה centrosome ב 3,10 prophase מוקדם.

במודעהdition לדחיקת הכוחות שנוצרו על ידי microtubules גדל, microtubule מסתיים פנייה קליפת התא יכול גם לתווך משיכת כוחות 11. מחקרי ממעבדות מרובות הראו כי הפעילות המבוקרת של גנרטורים כוח קליפת מוח נדרשה עבור המיצוב הסימטרי של צירי mitotic in vivo 1. Essential לכוחות המשייכים אלה הוא dynein ציטופלסמית-מקומי הקורטקס (להלן המכונה "dynein '), חלבון מנוע microtubule מינוס סוף מכוון 8,12,13. לדוגמא, ב ניצני שמרים, אינטראקציות לרוחב של dynein קליפת המוח עם תוצאת סריג microtubule ב microtubule מנוע תלוי הזזה לאורך הקורטקס 14. עם זאת, כוחות משיכה קליפת המוח יכול להיווצר גם על ידי היכולת של dynein ליצור התקשרויות-על קץ depolymerizing microtubules 8. האנרגיה שנוצרה על ידי התכווצות microtubule עלולה להוביל כוחות כי הם בדרך כלל בסדר גודל גבוה (~ 50 PN (אסמכתא 15 16)). מצורף-על סוף dynein קליפת המוח כדי microtubules depolymerizing מקדמת מיצוב ציר בשמרים ניצני 17 ו- C. elegans 13. בין אם הן כוחות משיכה קליפת המוח מונע depolymerization הזזה microtubule תלויי המנוע יכול לשתף פעולה או שייכות לקבוצה אחת בלבד in vivo הוא ידוע כיום.

בנוסף לכוחות דוחפים microtubule וכוחות משייכים קליפת מוח בתיווך dynein, מיצוב centrosome נשלט מתוך ציר mitotic ידי חלבונים רבים אחרים. מנועי Kinesin-5, למשל, קיימים כפי tetramers שיכול קשר צולב microtubules interpolar antiparallel, וכתוצאה מכך ההדורה של כוחות זזים כלפי חוץ 18-20. בני משפחת מנוע kinesin-5 נדרשים להפרדת centrosome והרכבה ציר דו קוטבית בכל אאוקריוטים למד, למעט ג elegans (הנסקרת תוך התייחסות 21).

יתר על כן,-linkers צלב diffusible משפחת Ase1 / PRC1 ידועים גם למקם חופפים אזורים microtubule של microtubules interpolar in vivo ו במבחנה 22-27. הכוחות שנוצרו על ידי הרחבת מונחת Ase1 של האזור-microtubule החופף הם גדולים מספיק כדי לאזן kinesin-14 כוחות הזזה בתיווך במבחנה 28,29. בתאים, Ase1 / PRC1 נדרש ליצירת יציבה של חופפים אזורים microtubule ב ציר midzone 25-27,30, דבר המצביע על כך הכוחות שנוצרו על ידי-linkers צלב diffusible יכול לתרום באופן משמעותי לארגון כישור. לבסוף, כוחות מן הכרומטין קינטוכור mitotic להשפיע הרכבת ציר mitotic ומיצוב דרך מסלולים שונים 3. מאז רכיבים אלה אינם חלקים מבחני הכינון מחדש המתואר כאן, הם לא יידונו בפירוט.

jove_content "> תאוריות שונות קיימים על איך הרכיבים והכוחות המולקולריים השונים המתוארים לעיל פעולת הרכבה ומיצוב ציר, אבל אנחנו עדיין רחוקים מהבנה כמותית. בנוסף ניסויים בתאים חיים, בניסויים במבחנה עם רכיבים מטוהרים לספק עצמה מסלול כדי לעזור להשיג מטרה זו. כאן אנו מציגים מדריך ויזואלי גרסה מותאמת המורחבת של השיטות שפורסמו לאחרונה (Roth et al. 31), שבו צירים בסיסיים מחדש בטיפות אמולסיה מים ב-שמן, מתחיל עם מספר מינימאלי של רכיבים. שימוש בטכניקות microfluidic, טיפות כדור נוצרים עם גדלים כי הם דומים לתאי mitotic. בתוך טיפות אלה, centrosomes ו טובולין מטוהרים ניתן לשלב כדי ללמוד דינמיקת אסטר microtubule, לכפות דור ואינטראקציות-אסטר Aster. By החדרת קליפת המוח (כגון dynein) והבין-קוטבית (כגון kinesin-5 / Ase1) כוח-גנרטורים, אנחנולשקם מבני ציר דמוי ויותר מורכבים שמתחילים להידמות מצב vivo.

Protocol

1. הכנת צ'יפס מיקרופלואידיקה

הערה: לצורך המחקר מלמטה למעלה של הרכבת ציר, כדורי מים ב-שמן טיפות תחליב משמשות. אלה הם microdroplets המימי מופרד שמן פאזיים שמסביב ידי בשכבה של פוספוליפידים פעילים שטח. תחליב-טיפות אלו מיוצרים בתוך polydimethylsiloxane microfluidic שבבי (PDMS). שינויים גיאומטריים ערוץ וספיקות יכולים לשמש גודל טיפת מנגינה. דירות תוכנן microfluidic המתואר כאן, טיפות נוצרות בקוטר של כ -15 מיקרומטר לחקות את הכליאה הגיאומטרית של תא mitotic יונק.

  1. עיצוב Photomask ייצור עובש
    1. עיצוב photomask המכיל שלושה 31 ערוצי כניסה. ערוץ מפרצון 1 מתחבר שלב המים, אשר מכיל את תוכן האגל (ראה סעיף 3 "reconstituting אסתרים microtubule הבסיסיים"). ערוץ מפרצון 2 מתחבר השלב-שמן (ראה סעיף 2.1 "ליפידים / שמן-PHAse כן "). השתמש בערוץ כניסת 3 לדלל-טיפות תחליב עם פאזיים שמן שומנים / נוספים לפני התצפית (אופציונאלי) (איור-b 2a).
      הערה: כל ערוצי כניסת מלוות-מסנן אבק (מבוך של 2 מיקרומטר ערוצים) לאבק מלכודת, חלקיקי PDMS ו (חלבונים) אגרגטים כדי למנוע מהם לחסום את ערוצי microfluidic (איור 2). ערוצים הם 75 מיקרומטר רחב ואת השומנים / שמן פאזיים נפגשים מים פאזיים בצומת 12.5 מיקרומטר רחבה שבו אמולסיה-טיפות תהווינה (איור 2 ג).
    2. להזמין ולקבל photomasks מודפס על מצע סרט, עם קוטביות שלילית (את photomask יחשיך עם מבנים שתוכננו שקופים).
  2. ייצור עובש
    1. לפברק תבניות ידי photoresist ספין ציפוי SU-8 3025 על גבי פרוסות סיליקון 4 אינץ באמצעות coater ספין (500 סל"ד, 10 שניות, ואחריו 1,800 סל"ד, 45 שניות) בסביבה נקייה בחדר.
    2. לחשוף את SU-8 מצופהפרוסות סיליקון דרך photomask. פיתוח ופלים פי הוראות היצרן כדי ליצור ערוצים של עובי ~ 40 מיקרומטר.
  3. ביצוע שבב Microfluidic
    1. מערבבים 10 חלקים PDMS מראש פולימר עם 1 סוכן ריפוי חלק (גר הכולל ~ 40) בתוך כלי הסירה דמוי בעזרת מרית פלסטיק. PDMS מקום המכיל כלי דמוי סירה בתא ואקום עבור ~ 30 דקות. כדי להסיר בועות אוויר. עוטפים בנייר אלומיניום ברחבי עובש להקים כוס עם ~ 1 ס"מ בקצוות תמיר.
    2. יוצקים את PDMS (~ 75% של נפח כולל) לתוך התבנית, להשאיר בתא ואקום עבור ~ 30 דקות אחרות. (כדי להסיר בועות אוויר) ולרפא עבור שעה 1 ב 100 ° C בתנור.
    3. ספין מעיל PDMS הנותרים על גבי שקופיות זכוכית (5 שניות בסל"ד 200 ואחריו 30 שניות ב 4000 סל"ד) ואחריו ריפוי עבור שעה 1 ב 100 ° C. הסירו אבק מן שקופיות הזכוכית באמצעות אוויר דחוס / N 2 -flow, ניקוי-מראש אין צורך.
      הערה: מצופה PDMS שקופיות זכוכית יכול לשמש הן עבור מיקרופוןשבב rofluidic וייצור תזרים תאים (ראה גם 2.2).
    4. בעדינות להפשיט את PDMS הנחה של עובש באמצעות סכין גילוח ו מחוררים (0.5 מ"מ עבור צריכת האוויר, 0.75 מ"מ עבור לשקע) .Corona-לטפל השבב microfluidic ו זכוכית שקופית PDMS מצופה באמצעות treater משטח קורונה במעבדה במשך כמה שניות .
    5. מניח את שבב microfluidic לשקופית הזכוכית (ערוצים פונה כלפי מטה) ואופים השבבים o / n ב 100 מעלות צלזיוס (איור 3 א). אחסן שבבי microfluidic במשך כמה חודשים בסביבה ללא אבק.

2. הגדרת Microfluidic

הערה: מים בתוך שמן טיפות תחליב נוצרות באמצעות התקנה מיקרופלואידיקה ואת שבבי microfluidic שתוארו לעיל. רכב שלב שמן השומנים / יכול להיות מגוון בהתאם לדרישות ניסוי. שומנים שמנים-solubilized יהוו monolayer על ממשק מי שומנים עם קבוצות ראש הקוטב שלהם מול המים בפנים. על מנת למקד את החלבונים(Dynein למשל) עד לגבול אגל, כמויות נמוכות של biotinyl-phosphatidylethanolamine (biotinyl-PE) ניתן להוסיף שומנים. זה מאפשר גיוס של dynein biotinylated (ראה 4.1 בסעיף "dynein מיקוד לקורטקס אגל") באמצעות multimerization בתיווך streptavidin. טיפות מיוצבים על ידי תוספת של פעילי שטח ומאוחסן בתאי תזרים מצופה PDMS.

  1. ליפידים / שמן-שלב ההכנה
    1. מערבבים מומס כלורופורם 1,2-dioleoyl- sn- glycero-3-phospho-L-סרין (DOPS) ושומנים biotinyl-PE בתוך 4: יחס טוחנת 1 בתוך שפופרת זכוכית באמצעות pipets זכוכית (בהרחבה לשטוף pipets עם כלורופורם לפני להשתמש). הכן סך של ~ 250 מיקרוגרם שומנים, וכתוצאה מכך ריכוז השומנים של ~ 0.5 מ"ג / מ"ל.
    2. בזהירות לייבש את תערובת שומנים עם -flow N 2 ובהמשך בתא ואקום עבור ~ 1 hr. ממיסים את השומנים מיובשות בשמן מינרלי 2.5% פעילי שטח כדי מ"ל 0.5 מ"ג / (לעשות ~ 500 μl).
    3. מניח את מדגם שומנים / נפט באזוראמבטיה sonicate קולי למשך 30 דקות. ב 40 קילוהרץ לפזר את השומנים לחלוטין.
  2. הכנת תזרים תאים
    1. PDMS ספין-מעיל (ראה גם סעיף 1.3) על כוסות כיסוי (5 שניות בסל"ד 200 ואחריו 30 שניות ב 4000 סל"ד) ו שקופיות הזכוכית (5 שניות ב -100 סל"ד ואחריו 30 שניות 1,500 סל"ד) על מנת להפקיד את שכבת הומוגנית של PDMS.
      הערה: לקבלת איכות הדמיה אופטימלית, הקפד להשתמש משקפי כיסוי בעובי התואם את המטרה מיקרוסקופ. במקרה זה: 1.5 (~ 0.17 מ"מ).
    2. לרפא את המשקפיים לכסות מצופה PDMS ו שקופיות הזכוכית עבור שעה 1 ב 100 ° C בתנור. Make-תאי זרימה על ידי ריווח מקרוב (~ 2 מ"מ) פרוסות דקות של סרט איטום מעבדה (~ 3 מ"מ רוחב) על משטח הזכוכית-השקופיות מצופות PDMS. כאשר מאוחסן בסביבה ללא אבק, ערוצים שלא היה בשימוש יכולים לשמש בזמנים אחרים.
    3. מכסה את תאי זרימה עם coverslip חותם PDMS מצופה ידי המסת דקות סרט איטום מעבדה ~ 1. ב 100 ° C, קשבעדינות (איור 3c). סגור את -glass-גבולות סרט איטום מעבדה עם Valap (איור 3c). זרימת חנות תאים במשך כמה חודשים בסביבה ללא אבק.
  3. הכנת גביע PDMS
    1. עבור הדמיה לטווח ארוכה, להכין כוס PDMS, על ידי ניקוב חור בקוטר 4 מ"מ פרוס PDMS (~ 3 מ"מ עובי)
    2. קורונה לטפל פרוסה PDMS וכוס כיסוי מצופה PDMS ומניחים אותם על גבי אחד את השני. אופים את כוס PDMS o / n (ב 100 מעלות צלזיוס) (איור 5 א).
  4. גיבוש אמולסיה-אגל
    1. צג אגל היווצרות על מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. חבר את הבקר לחץ לשבב microfluidic באמצעות צינורות צצים (בקטרים: 510 מיקרומטר (חיצוני) ו 125 מיקרומטר (פנימי)) (איור 3 א). מלאו שבבי microfluidic לחלוטין עם השומנים / שמן פאזיים מן מפרצון 2.
    2. הציגו מבוססי MRB80 פאזיים מים (ראה reconstituting סעיף 3 "אסתרים microtubule בסיסיים4;) מ-גודל טיפת שליטת כניסה 1. על ידי לחצי שומנים / שינוי שמן פאזיים ומי שלבים כדי ליצור טיפות של ~ 15 מיקרומטר קוטר (איור 3 ב).
      הערה: שימוש התקנה זו, השתמש ~ 800 mbar עבור השומנים / שמן-פאזה ~ 200 mbar עבור פאזיים מים כדי ליצור טיפות בגודל הרצוי.
    3. לאחר קבלת סכום טיפה בגודל הנדרש הרצויים (~ 10 μl לדגימה), לאסוף טיפות מערוץ לשקע טעינה לתוך תא זרימה (למלא את תא הזרימה לחלוטין).
    4. סגור את הקצוות של תאי הזרימה בזהירות באמצעות Valap (תאי זרימה סגורים באופן חלקי יכולים לגרום תנועה נרחבת של הטיפין, מה שהופך אותו קשה לדמות אותם). בנוסף, למנוע היווצרות של בועות אוויר שתוצאתה התנועה רביב.
    5. שוטף את הצינורות הצצים בהרחבה עם isopropanol לפני ואחרי שימוש כדי למנוע זיהום צולב ו סתימת מדגם.

3. Asters microtubule בסיסי reconstituting

הערה: תוכן אגל יכול להיות מגוונת בהתאם לדרישות ניסוי. כל המאגרים הם MRB80 המבוסס (80 צינורות מ"מ, 1 המ"מ EGTA, 4 מ"מ MgCl 2 (pH 6.8)), וכל הדגימות ערוכות על קרח. באופן כללי, טיפות תמיד מכילים centrosomes, רכיבים הדרושים פילמור microtubule, מערכת נבלות חמצן סוכן חוסם (ראה סעיף 3.1). כוח-גנרטורים microtubule ורכיבי הנדרש ומיקוד-גורמים יכולים להיכלל אם תרצה בכך (ראה סעיפים 4.1 ו -4.2).

  1. התקנה כללית להיווצרות אסטר בטיפות אמולסיה (איור 3d)
    1. הכן גלוקוז אוקסידאז (20 מ"ג / מ"ל ​​גלוקוז אוקסידאז ב 200 מ"מ DTT ו -10 מ"ג / מ"ל ​​catalase) לערבב מראש ולאחסן aliquots קטן ב -80 מעלות צלזיוס.
    2. הכן 'תערובת חסימת' המכילים קזאין κ, אלבומין בסרום שור (BSA), Tween-20 סוגי הפולימרים ניאון (כסמן נייטרלי) (ראה לוח 1) מראש ולאחסן aliquo קטןts ב -80 מעלות צלזיוס. למנוע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים. ודא כי כל הרכיבים מוכנים טרי.
    3. לטהר centrosomes שורות תאי KE37 אדם לימפובלסטית כפי שתוארו על ידי Moudjou et al. 32 ולאחסן ב -150 מעלות צלזיוס aliquots הקטן.
    4. להפשיר centrosomes בטמפרטורת החדר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 20 דקות. לפני השימוש כדי להבטיח התגרענות microtubule נכונה.
      הערה: זה מקדם התגרענות microtubule במהלך הניסוי.
    5. בינתיים, להכין "לערבב assay ', המכיל טובולין (פלורסנט' אפל '), אדנוזין guanosine (GTP), מערכת נבלות חמצן (גלוקוז, גלוקוז-אוקסידאז, catalase ו 1,4-dithiothreitol (DTT)), כוח גנרטורים מולקולרי (מנועי microtubule למשל / צולבות linkers), אדנוזין אדנוזין (ATP) ומערכת ATP-התחדשות (phosphoenolpyruvate (PEP), קינאז פירובט (PK) ו לקטט דהידרוגנאז (LDH)) על קרח (ראה טבלה 2).
    6. טרום לקרר אתairfuge הרוטור על הקרח. ספין למטה מדגם הרוטור airfuge המקורר (30 psi במשך 3 דקות) .Add centrosomes מחומם מראש (לייעל את כמות centrosomes לשאוף טיפות המכילות 1-2 centrosomes).
    7. השתמש תמהיל משולב לייצר טיפות האמולסיה באמצעות השיטות שתוארו בסעיף 2.3.
רְכִיב ריכוז מניות ריכוז סופי (ב assay) כֶּרֶך תגובה
Dextran-647nm 75 מיקרומטר 3.75 אום (0.6 מיקרומטר) 5 μl
κ-קזאין 20 מ"ג / מ"ל 12.5 מ"ג / מ"ל ​​(2 מ"ג / מ"ל) 62.5 μl
Tween-20 5% 0.375% (0.06%) 7.5 μl
BSA 200 מ"ג / מ"ל 12 מ"ג / מ"ל ​​(1.9 מ"ג / מ"ל) 6 μl
MRB80 19 μl
100 μl סופי חנות ב 2 aliquots μl

טבלת 1: מרכיבים של 'מיקס חסימה' מרכיבים של תמהיל חסימה, נדרשו בריאורגניזציה מבני ציר דמוי טיפות מים ב-שמן תחליב.. לתיאור, ראה סעיף 3 הטקסט העיקרי "reconstituting אסתרים microtubule בסיסיים". לפרטים על חומרים, ראה "לוח חומרים.

רְכִיב מאגר concentration ריכוז סופי כֶּרֶך תגובה
חסימת תמהיל 1.6 μl
טובולין 500 מיקרומטר 30 מיקרומטר 0.6 μl
טובולין-488/561 50 מיקרומטר 3 מיקרומטר 0.6 μl
GTP 50 מ"מ 5 מ"מ 1.0 מיקרוליטר
Dynein-TMR 178 ננומטר 30 ננומטר 1.7 μl
streptavidin 5 מ"ג / מ"ל 200 ננומטר 0.4 μl לקבלת dynein קליפת המוח בלבד
Kinesin-5 1.6 מ"מ 80 ננומטר 0.5 μl
ATP 25 מ"מ 1 מ"מ 0.4 μl עבור מנועים בלבד
זְרִיזוּת 0.5 M 25.6 מ"מ 0.5 μl עבור מנועים בלבד
PK / LDH 800 U / 1,100 U 23 U / 32 U 0.3 μl עבור מנועים בלבד
Ase1-GFP 400 ננומטר 80 ננומטר 2.0 μl
גלוקוז 2.5 M 50 מ"מ 0.3 μl צעד אחרון
גלוקוז-אוקסידאז 50x 1.0x 0.3 μl צעד אחרון
MRB80 איקס
9 μl סופי

טבלה 2: מרכיבים של 'Assay מיקס'. לוח חומרים.

4. עצרת-גורמי ציר היכרות

הערה: המבחנים המתוארים כאן, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged גרסה מקוצרת של ס dynein cerevisiae שימש כי הוא dimerized מלאכותי באמצעות אמינו מסוף גלוטתיון S-transferase (GST) -tag 33. חלבון זה מטוהר באמצעות תג זיקה המכיל שני עותקים של חלבון תחום מחייב IgG. הגרסה המובאת כאן שכותרתו עם תווית tetramethylrhodamine (TMR) על carboxy המסוף ואת N-terminal SNAP-התג משמש biotinylate החלבונים המטוהרים. לפרטים לבנות, ראה ואח 'רוט 31.; לפרטים טיהור, לראות Reck-פיטרסון et al. 33. GFP-ביוטין-dynein-TMR יכול להיות ממוקד-קורטקס האגל דרך ההיווצרות של מתחמי streptavidin ביוטין המקשרים dynein שומני biotinyl-PE (3E איור).

  1. Dynein מיקוד אל Cortex אגל
    1. כלול GFP-ביוטין-dynein-TMR לתוך 'תערובת assay' (ראה טבלה 2) בכל אגל-ריכוז סופי של 30 ננומטר. כלול streptavidin לתוך 'תערובת assay' (ראה טבלה 2) בכל אגל-ריכוז סופי של 200 ננומטר.
      הערה: dynein תלוי ATP-הידרוליזה לתנועה צעד חכם על microtubules. לכן, כולל ATP ומערכת התחדשות ATP (המכילה PEP ו PK / LDH) לתוך 'תערובת assay' (ראה טבלה 2).
      הערה: ס באורך מלא רקומביננטי pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) סופק באדיבות על ידי המעבדה דיאז (המרכז לביו-הנדסה מולקולרית, Technische Universitat דרזדן, דרזדן, גרמניה), לראות. מלא l רקומביננטיength מתויג היסטידין ס pombe GFP-Ase1 סופק באדיבות מהמעבדה Jansons (Wageningen אוניברסיטת Wageningen, הולנד) והוסיף את "תערובת assay 'בריכוזים ב 80 ננומטר.

הדמיה 5.

הערה: במהלך הניסוי, צמיחה microtubule יכול להיות נשלט על ידי שינוי הטמפרטורה. בבחירת תנאי ההדמיה, פשרות צריכות להיעשות בין הדמיה באיכות הגבוהה ואת היכולת לנטר הרכבת ציר לתקופות זמן ארוכה. כדי להשוות את קינטיקה של היווצרות ציר בתנאים שונים, טיפות עם תכנים שונים ניתן לערבב צילמו בערוץ הזרימה אותו.

  1. הגדרות הדמיה בסיסיות
    1. תמונה בסביבה מבוקרת טמפרטורה באמצעות חדר סגור. דמיינו microtubules בודדים לאחר ~ 30 דקות ב ° C 26. בעוד הדמיה, לקדם צמיחה microtubule ידי הגדלת הטמפרטורה עד ~ 30 מעלות צלזיוס.
      הערה: settings להלן ספציפי להגדרת מיקרוסקופ שלנו יכול להשתנות עם מערכות שונות ותוכנות הפעלה שונות. כל המבחנים המתוארים כאן הם צלמו על מערכת ממונע הפוכה עם ראש confocal דיסק מסתובב ומופעל באמצעות תוכנת הדמיה כגון תידור iQ 3.1. השג את כל התמונות עם טבילה אובייקטיבית שמן 100X ומצלמת EMCCD.
    2. לייזרי עירור גדר 488, 561 ו 641 ננומטר בערך ~ 10% אינטנסיביים. עבור ללוח 'רכישת', לחץ על עוצמות לייזר הכרטיסייה והחלק 'AOTF' עד 10%. הקישו על 'שיא' כדי לאחסן את ההגדרות.
    3. לקבלת -projections z, לקחת ערימות עם 1 מיקרומטר במרווחים (~ 20 תמונות / אגל). עבור אל "המצלמה הראשית 'פאנל, לחץ על' ערוך z 'ולהגדיר' צעד Z 'ל -1.0. לחץ על' הבא 'כדי לאחסן את ההגדרות.
    4. גדר EM-רווח ליניארי מרבי על ידי הלחיצה על כרטיסיית 'המצלמה' בחלונית 'הרכישה' וחלק בר רווח EM לחשיפת סט 300.פעמים 200 msec באותה כרטיסייה. הקישו על 'שיא' כדי לאחסן את ההגדרות.
  2. הדמית חיה
    1. הדמיה חיה, באמצעות פקדי התוכנה להפוך -projections z כל 2 דקות. למשך 1-2 שעות על ידי הפחתת פעמים חשיפה ~ 100 אלפיות השניה. (כמתואר 5.1.4) ולהגדיל z -intervals עד 2 מיקרומטר (כמתואר 5.1.3). הגדר את סדרת העת בחלונית 'camera' הראשית, לחץ על 'חזור' t ומוגדרת 2 דקות. במרווחים של זמן כולל של 120 דקות.
    2. עבור מבחנים חיים, השתמש כוס PDMS במקום תזרים תאים קבועים על מנת להבטיח כי הטיפין הם נייחות ככל האפשר.
  3. הדמיה משולבת של 2 תנאים
    1. לייצר טיפות באמצעות מיקרופלואידיקה ולאחסן על גבי שקופית זכוכית מצופה PDMS על הקרח. הדבר מונע התגרענות microtubule עד הסט השני של טיפות כבר נוצר. לפני הפקת סט של טיפות השני, יש לשטוף את צינורות הצצה שבב microfluidic עםMRB80 ובאופן מוחלט למלא שבב microfluidic עם השומנים / שמן-שלב.
    2. צור טיפות עם ובלי dextran ניאון (או dextran באמצעות עם fluorophores אורך גל שונה) על מנת להבחין בין טיפות עם צבעים שונים. לאחר שסיפק את המנה השנייה של טיפות, לערבב בעדינות את טיפות ידי pipetting לטעון לתוך תזרים תאים / PDMS-כוס אחת.
  4. ניתוח תמונה.
    1. ניתוח תמונות באמצעות פיג'י (קוד פתוח תוכנות באינטרנט זמין) 34.
    2. עבור מבחנים חיים, להמיר ערימות לתוך hyperstacks באמצעות 'תמונה' - 'hyperstacks' - 'ערימה כדי hyperstack'. הגדר את המספר הנכון של z-פרוסות ו מסגרות זמן.
    3. על מנת להפוך z-תחזיות, לבחור 'תמונה' - 'ערימות' - 'Z-פרויקט'. בחר הקרנה 'מקסימום עוצם'.
    4. לקבלה-3D שחזורים, הראשון ללכת 'תמונה' - 'מאפיינים' ולהגדיר את פיקסלים הטוב עם, פיקסל heigth, עומק voxel ו frבמרווחי ame. לחץ על 'אישור'. בחר "תמונה" - "ערימות" - "פרויקט 3D ', סמנו את התיבה' לשרבב 'ולחצו על' אישור '.

Representative Results

השיטות שהוצגו בסעיפים הקודמים לאפשר הכינון מחדש של מבנים דמויי כישור עם מורכבות גוברות באמצעות הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה מים ב-שמן. סעיף זה מתאר תוצאות נציגים כי איכותי להדגים את היכולת של מבחנים אלה.

במהלך מיטוזה, כאשר הציר דו הקוטבי מורכב, תאים לעגל כלפי מעלה כדי ליצור כדורים בקוטר של כ -15 מיקרומטר, כפי שהיא נמדדת על תאים אנושיים. צורת התא mitotic מאפיין זה מספק גבול גיאומטריות ששני מגביל ומפנה גודל ציר והכיוון 35,36. טכניקות microfluidic, לספק רמה של כליאה גיאומטרית מדויקים דומות המצב נצפה בתאים חיים ולכן מאפשר שחזור מלמטה למעלה צירי mitotic במבחנה.

page = "1"> אסתרים microtubule הם בעצמם כבר מסוגלים התנהגות מורכבת כאשר צמיחת microtubule מוגבלת על ידי גבולות גיאומטריים. כפי microtubules לגדול, כוחות דוחפים שנוצר על ידי שילוב של הדימרים טובולין החדש להסיע את שני centrosomes להתנגדות צידי טיפות האמולסיה. בהתחלה, centrosomes לפזר בחופשיות בתוך הנפח המוגבל (איור 4 א, ​​פנל שמאלי). לאחר כ 20-30 דקות, microtubules הראשון להפוך דיפוזיה גלוי centrosome הופך מוגבל כמו microtubules לגדול נגד הקליפה לכל הכיוונים. אסתרים עם microtubules באורך ביניים (בערך 50% מקוטר האגל) יכולים (sterically) דוחים זה את זה אחר, עם microtubules דוחף אחד נגד שני, את centrosomes האחר ואת קליפת המוח. התוצאה היא סדר 'דו קוטבי' ציר דמוי טיפוסי עם שני centrosomes מנוגדים אחד (איור 4 א, ​​פנל באמצע) אחרים. כאשר microtubules לגדול יותר מ ~ 50% של רביב-diaמטר, centrosomes לקבל דחף נוסף גבולות מנוגדים של רביב, עם microtubules גדל לאורך הקורטקס האגל (איור 4 א, ​​פנל מימין). חשוב לציין כי שיעורי צמיחת microtubule מבחנים אלה רגישים מאוד הוא טמפרטורה-ריכוזי טובולין. פרמטרים אלו ולכן ישפיעו על הזמן מאוד כאשר התגרענות היא נצפתה לראשונה וכאשר עמדות אסטר יציבות הם הגיעו.

בתאים, כוחות משיכת קליפת מוח נוצרים דרך ההיווצרות של קבצים מצורפים נושאת עומס בין microtubule פלוס קצות dynein קשור הקורטקס. בתאים חיים, קשר זה תלוי מורכב Gαi / LGN / נומה, שהוא ממוקד קרום הפלזמה באמצעות N-terminal myristoylation של Gαi 1. מבחני כינון מחדש אלה, הדרישה של מתחם Gαi / LGN / נומה נעקפה על ידי צימוד ישיר dynein שומני biotinylated דרךהיווצרות של מתחמים ביוטין-streptavidin ביוטין. אג"ח אלה הם יציבים יחסית (K D ~ 10 -14 M) 37 ויוצרים במהירות (בדרך כלל בתוך 10 דקות לאחר היווצרות טיפת תחליב, לפני התגרענות microtubule מתברר) (איור 4 ב). בנוכחות dynein קליפת המוח, centrosomes בדרך כלל לשמור על מקום מרכזי יותר, ואילו בהעדר dynein, centrosomes נדחפים לצדדים מנוגדים של קליפת אגל (איור 4C). אנו מסיבה זו היא תוצאה של שתי השפעות, המונעות ולבלום כוחות דוחפים microtubule. (1) dynein ישירות מקדמת אסונות microtubule, ובכך מגבילים אורך microtubule ומניעת קריסה microtubule מופרז, ו- (2) כוחות משיכה קליפת המוח להוביל כוחות המרכוז נטו על אסתרים הפרט 8, אשר מצמצמים את כוחות דחייה אסטר-אסטר.

The-מקשר צלב diffusible Ase1 גורם f orces שנוטה להגדיל באזור החופף של microtubules אנטי-מקביל 29. בקנה אחד עם זו, בנוכחות Ase1 (והיעדר dynein) centrosomes נמצאים קרובים זה לזה עם Ase1 ללוקליזציה כדי ארוזות microtubules interpolar (איור 4D). בני משפחת kinesin-5 לנהוג הפרדה centrosome ידי מתן כוחות דוחפים מתוך כישור (ראה מבוא). בנוכחות Cut7 (להלן ortholog kinesin-5 pombe ס), centrosomes נדחפים לצדדים מנוגדים של טיפות האמולסיה, אפילו בנוכחות של Ase1 (איור 4E). על ידי שילוב של גנרטורים כוח קליפת מוח ובין-קוטביים, רמת מורכבות ניתן להגדיל עוד יותר בניסויים אלה, המוביל בסופו של דבר הבנה מקיפה של הרכבת ציר mitotic דו קוטבית. תיאור כמותי מפורט של תוצאות אלה יהיו זמינים בעתיד (Roth et al., כתב היד בהכנה).

p-together.within-page = "1"> בנוסף התבוננות עמדת centrosomes ברגעים קבועים בזמן, והתייחסות התנהגותם אורכי הנצפה של microtubules, ניתן לקבל מידע רב ערך על ידי ביצוע תהליך המיצוב מעל זְמַן. על ידי הפחתת פעמי חשיפה בעוצמות ליזר, ניתן כיום לבצע מיצוב אסטר ב 2 מרווחי דקות לפחות 1 שעה עם רק ~ 30% לבנים. זה מאפשר ניטור של הרכבה אסטר ומיצוב מ centrosomes לשדר באופן חופשי (0 דקות.) באמצעות מרכזי (12 דק '.) כדי אסתרים מבוזרת (36 דקות נוספות) (5 ג איור). זה מקל על המחקר של שתי התנהגות היציבה קינטיקה הרכבת ציר. על ידי שילוב של טיפות עם תוכן שונה באותה המדגם, שזה לא יהיה, למשל, ניתן להשוות ישירות קינטיקה מיצוב ציר הרכבת centrosome בטיפות עם ובלי גנרטורים כוח קליפת מוח (איור 5 ב ').

: לשמור-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1: הכוחות הפועלים על ציר mitotic מולקולות מספר מניבות כוח לפעול על microtubules של ציר mitotic לקדם היווצרות ציר ומיצוב.. Microtubules הגדלים לתוך קליפת התא לייצר כוח דוחף את centrosome. dynein קורטיקלי (סגול) לוכדת microtubules depolymerizing ומייצר כוח משיכה על centrosomes. בתוך ציר, Kinesin-5 / Cut7 חלבונים מנוע לספק כוח הזזה כלפי חוץ על microtubules אנטי במקביל, בעוד צולבות linkers משפחת PRC1 / Ase1 ליצור מנוגדים הזזה כוח כלפי חוץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

איור 2
איור 2:. Microfluidic שבב עיצוב (א) תכנון photomask 4 אינץ המכיל 4 שבבי microfluidic. (ב) ייצוג מפורט של שבב בודד. צ'יפס מכיל ערוץ לשקע אחד ושלושה ערוצי כניסה ואחריו מסנן אבק. מפרצון ערוץ 1 מכיל את פאזיים מים, ערוץ 2 שומנים / שמן פאזיים והערוץ 3 יכול לשמש כדי לדלל את הטיפין נוצרו עם פאזיים שמן שומנים / נוספים. (ג) ייצוג מפורט של צומת שבו השומנים / שמן פאזיים (מאגף העליון והתחתון) נפגש עם שלב-מים (מאגף שמאל). בצומת, טיפות יהוו וזרימה לכיוון ערוץ לשקע בצד ימין. (ד) ייצוג מפורט של א-מסנן אבק עם 2 מיקרומטר ערוצים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. מתודולוגיה מים ב-שמן אמולסיה אגל גיבוש (א) שבב Microfluidic צינורות מיקרופלואידיקה על מיקרוסקופ שדה בהיר. הם מים וצינורות פאזיים שמן שומנים / מחוברי צריכת האוויר של שבב 1 ו -2 בהתאמה. (ב) סייג שבב מיקרופלואידיקה שבו המים ולפגוש שומנים / שמן-שלבים. על ידי שינוי לחצים, גודל הטיפות יכול להיות נשלט. (ג) תכנון זרימת תאי PDMS מצופה. לאחר טעינת הטיפין לתוך תאי הזרימה, הקצוות הפתוחים סגורים עם Valap נוסף. (ד) סכמטי של היווצרות טיפה. טיפות משמשות כדי לתמצת centrosomes, טובולין ומרכיבים נוספים הנדרשים ליצירת ציר mitotic. (E) סכמטי של מיקוד קליפת המוח-dynein. Biotinylated (ביו) dynein מיועד שומנים biotinylated באמצעות streptavidin (Strp).

איור 4
איור 4:. נציג תוצאות של ציר-Reconstitutions עם המורכבות הגוברת (א) תחזיות בעוצמה מקסימלית של טיפות המכילות שני centrosomes הצגת דוגמאות של קצר, בינוני, ארוך microtubules. Centrosomes ו microtubules הם דמיינו על ידי תוספת של 10% HiLyte-488 שכותרתו טובולין. ברי סולם = 10 מיקרומטר. (ב) לוקליזציה של ה- GFP-ביוטין-dynein-TMR בהעדר (-, שמאל) ונוכחות (+, מימין) של streptavidin (Strp). (C) microtubule מיצוב אסטר בהעדר (-, משמאל) או נוכחות (+, מימין) של ביוטין-dynein-TMR GFP קליפת המוח. (ד) microtubule אסטר (פאנל משמאל, גרeen) מיצוב בנוכחות Ase1 (פאנל באמצע, אדום). (E) אסטר microtubule (פאנל משמאל, ירוק) מיצוב בנוכחות Ase1 ו Cut7 (kinesin-5) (פאנל באמצע, אדום). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: Dynamics מיצוב הדמיה אסטר במבחנה (א) תכנון כוס PDMS המאפשר הדמיה אגל של עד מספר שעות.. (ב) דור, אחסון והדמיה של טיפות (משודר) המכיל תכנים שונים, מאוירים על ידי היעדרות (שמאל) הכללה (מימין) של dextran ניאון (Alexa 647). (ג) תמונות מטוס יחידות של זמן לשגות 60 דק '(2 מרווחי דקות) שנלקח Z- מחסנית (2 מיקרומטר מרחקים) של מודעהroplet המכיל centrosome יחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השיטות שתוארו כאן מאמצים אחרונים נוכחיים כדי לשקם צירי mitotic בסיסיים בטיפות אמולסיה מים ב-שמן. לימוד ציר הרכבה בגבולות גיאומטריים מספק יתרונות רבים. מנגנוני משוב חשובים קיימים בין microtubules של ציר mitotic והאילוצים הגיאומטריים שבו הם התאספו. Microtubules יכול ליצור דחף כוחות כאשר הם גדלים לתוך גבולות גיאומטריים, אשר עלול לגרום תזוזת ציר mitotic. בנוסף, גדל לתוך מכשול פיזי יכול לגרום אסונות microtubule. כמו כן, הרכבת ציר בתוך גיאומטריה מוקפת יכולה להוביל דלדול הדרגתי של רכיבים בודדים, כגון טובולין, אשר בתורו משפיע ישירות על צמיחת microtubule שיעור 36. כל אלה הם הגורמים החיוניים של הרכבת ציר, אשר ניתן ללמוד באמצעות המבחנים המתוארים כאן.

מבחני המתוארים רגישים מאוד differe ריכוז קטןnces של רכיבי רביב. זהו המקרה עבור טובולין, שבו הבדלי ריכוז קטין יכולים לגרום גם איטית מדי או מהירה מדי צמיחת microtubule. במקרה זה, שיעורי צמיחת microtubule לעתים קרובות יכולים עדיין להיות מתוקנים על ידי התאמת הטמפרטורה במהלך הדקות הראשונות ~ 30 של הניסוי. הרכבה ציר mitotic ומיצוב הוא גם מאוד רגיש לשינויים בריכוז (קליפת המוח) גנרטורים כוח. זה עשוי להיות תלוי ריכוז, טוהר פעילות הרכיבים המטוהרים צריך להיות טיטרציה בזהירות לכל חלבון מטוהרים חדש.

בנוסף, פשרות מסוימות צריכות להיעשות במסגרות הדמיה, בהתאם לאופי של assay. בתחילה, רמות גבוהות של הדימרים טובולין פלורסנט מסיסים להקשות microtubules פרט תמונה. כפי microtubules מתארך טובולין מסיס ייגמר לאט, יחס אות לרעש הופך בהדרגה גבוהה ומאפשר ההדמיה של individumicrotubules al. בניגוד setups עם מערכות פתוחות, כליאת הגיאומטריות מונעת חליפין של מולקולות ניאון ורכיבי מערכת נבלות חמצן בתוך מאגר בתפזורת, וכתוצאה מכך ההלבנה משמעותית. במיוחד לניטור ציר הרכבה ומיצוב לאורך זמן, היא נדרשת תמונה עם לעוצמות אור נמוכות, אפילו בנוכחות של מערכת נבלות חמצן חזקה.

שיטות אלה מאפשרות הכינון מחדש מלמטה למעלה מבני ציר דמויים פשוטים במבחנה. בנוסף למרכיבים הציגו כאן, גורמים רבים אחרים תוארו להשפיע היווצרות ציר דו קוטבית, מיצוב, נטייה, עיצוב, וכו '3. מערכת זו ניתן להרחיב עוד יותר כדי לחקור את השפעות הפרט בשילוב של גנרטורים כוח נוספים. תורמים חשובים היווצרות ציר שנעדרים כיום ממערכת זו הם הכרומוזומים mitotic. הכרומטין mitotic הוכחהיווצרות ציר ישיר על ידי (1) chromokinesins כי ניתן להפיק מה שמכונה 'כוחות-פליטה קוטב' 3, (2) היווצרות של שיפוע RanGTP ידי RCC1 RanGEF הנכנס הכרומטין 38, (3) קינטוכור כי יכול לקיים אינטראקציה עם (depolymerizing microtubules) 39 ו (4) הכרומטין עצמו, שיכול לתפקד כמו קפיץ מכני-בין microtubules מנוגדים 40.

לבסוף, המערכת המתוארת כיום מספקת שליטה של ​​זמן ומרחב מוגבלת על הפעילות ולוקליזציה של כוח-גנרטורים הציג. בתאים, גורמי הרכבת ציר רבים למקם את התאים ספציפיים או פעילים תוך זמן-חלון מוגבל. דוגמה בולטת היא הפעילות של dynein, אשר מועשר במיוחד בצד האחורי של ג elegans העובר בשלב אחד התא לקדם מיצוב ציר אסימטרי חלוקת התא. במערכת זו, אנו בוחנים בימים אלה אפשרות מחקה t כזהבאמצעות שיטות של פעילות emporal אסימטרי שהושאל טכניקות אופטו-גנטית. בנוסף, כפי שקורה עבור ג elegans לעובר ותאים עם דופן תא נוקשה, תאים רבים אינם לעגל כלפי מעלה ב מיטוזה. צורת הכליאה הגיאומטרית תהיה השפעה מהותית על הכוחות הפועלים על הציר 41. לכן יהיה חשוב כדי לשקם ציר הרכבה ומיצוב טיפות הלא כדורית כמו גם, באופן פוטנציאלי באמצעות מערכות microfluidic מורכבים יותר, המאפשרים בעיצוב ואחסון של אמולסיה טיפות 42,43. לבסוף, ברקמות, תאים תאים ותא-המצע איתות מצורף לספק רמזים חיצוניים כי ניתן לתרגם אוריינטציה ציר מכוונת, כפי שנצפה לעתים קרובות בתאי אפיתל ותאי גזע. כל היבטים מצומצמים אלה לא נלקחו בחשבון במחקר הנוכחי זה עשוי לספק האתגרים בעתיד לבנות כלפי יותר in vivo-כמו reconstitutions של שנאספו בנוסף ציר mitoticly ומיצוב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Preparation of microfluidic chips
Photomask (Photomask on film substrate) Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025 MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) WRS Materials 4P0SSP-005
Spin coater  Polos SPIN150I
PDMS pre-polymer RVT615 A+B Lubribond 9481
Corona treater Electro-technic products BD-20ACV
2. Microfluidic setup
Name Company Catalog Number Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) Avanti Polar Lipids 840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) Avanti Polar Lipids 870285
Chloroform Sigma-Aldrich 650498
Glass pipets
Glass tubes
Vacuum pump Laboport KNF
Vacuum chamber Kartell Polypropylene Vacuum Desiccator
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Surfactant (Span80) Sigma-Aldrich 85548
Sonicator Branson M2800H
Coverslips 24 mm x 60 mm, thickness 1.5
Glass-slides 26 mm x 76 mm
Puncher Harris Uni-Core 135840/135841/135843
Laboratory sealing film Parafilm
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) Home made
Brightfield Microscope Leica PMIRB  Any inverted brightfield would suffice
Pressure controler Fluigent MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing Cluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) VWR, The Netherlands
3. Reconstituting spindle formation and positioning
Name Company Catalog Number Comments
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) Life Technologies
Tween-20 Sigma-Aldrich
BSA - Bovine serum albumin Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) Sigma-Aldrich G6125
DTT (DL-dithioltheitol) Sigma-Aldrich 646563
Catalase (Catalase form bovine liver) Sigma-Aldrich C9322
Tubulin (Tubulin from bovine brain) Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) Sigma-Aldrich 51120
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) Sigma-Aldrich C0406
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) Beckman-Coulter CLS
4. Introducing spindle-assembly factors
Name Company Catalog Number Comments
Neutravidin Sigma-Aldrich A2666
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A9187
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) Sigma-Aldrich P0564
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) Sigma-Aldrich P0294

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
  2. Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
  3. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
  4. Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
  5. Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
  6. Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  7. Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
  8. Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  9. Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
  10. Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
  11. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  12. Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
  13. Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
  14. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
  16. Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
  17. Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
  18. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  19. van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
  20. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
  21. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
  22. Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
  23. Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
  24. Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
  25. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  26. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  27. Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
  28. Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
  29. Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
  30. Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
  31. Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
  32. Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
  33. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
  36. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  37. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  38. Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
  39. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  40. Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
  41. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
  42. Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
  43. Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 114 היווצרות ציר mitotic מיצוב כישור מיקרופלואידיקה centrosomes microtubules dynein kinesin-5 Ase1
כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk,… More

Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets. J. Vis. Exp. (114), e54278, doi:10.3791/54278 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter