Introduction
В процессе митоза хромосомы реплицированному генома организованы на экваторе клетки, чтобы обеспечить равномерное распределение сестринских хроматид над вновь образованных дочерних клеток. позиционирование Хромосома и сегрегация опосредуется их прикрепления к веретена микротрубочек, происходящих из двух противоположных центросом. В дополнение к обеспечению верного распределения хромосом, ориентация митотического веретена также диктует клеточного деления плоскости 1. Согласованное направленность клеточного деления имеет важное значение во многих стадиях развития и для тканей гомеостаза 2. В частности, регулируется позиционирование шпинделя митотический может привести к асимметричному распределению клеточного содержимого или даже производят дочерние клетки различных размеров 2. Митотическое сборка шпинделя и ориентация начинается в профазе и оркестровке сложным взаимодействием между сотрудничающими и антагонизма к Силе генераторов 3,4. Сформированные силы состоят из ЬПр и маневровые тяговые силы. Эти силы возникают как от шпинделя контактов с клеткой коры, а также внутри шпинделя, и может быть порождена динамики микротрубочек, а также молекулярных моторов и сшивающих (рисунок 1).
Толчок силы могут быть сформированы, когда микротрубочки растут против жестких структур, таких как клетки коры головного мозга. В зависимости от общей силы сопротивления , выделяемое внутри системы, это может привести к репозиции митотического веретена (низкие силы) или вызвать микротрубочек потери устойчивости или катастрофы (высокие силы) 5-8. Величина силы , которая может быть сгенерирована путем нажатия зависит от длины микротрубочек, так как длина является серьезным фактором , определяющим микротрубочки коробления 9. Кроме того, микротрубочки , которые происходят от одного центросоме может выдвинуть против другого центросоме, механизм , который был предложен для привода центросом разделения в начале профазы 3,10.
В рекламеусловие для толкая сил , возникающих при растущих микротрубочек, микротрубочки концы контактирование клетки коры головного мозга также может посредничать силы тяги 11. Исследования , проведенные в нескольких лабораториях, показали , что контролируемое активность корковых генераторов сила требуется для асимметричного расположения митотических веретен в естественных условиях 1. Существенное значение для этих тянущих сил Кора локализованы цитоплазматический динеин (далее именуемые как "динеин"), минус-конец , направленный микротрубочек мотор белка 8,12,13. Так , например, в почкующихся дрожжах, боковые взаимодействия коркового динеин с микротрубочками результате решетки в зависящих от двигателя микротрубочки , скользящей по коре 14. Тем не менее, корковых тянущие силы также могут быть получены с помощью способности динеин с образованием конечных пользователей на вложения в деполимеризации микротрубочек 8. Энергия , вырабатываемая микротрубочек усадки может привести к силам , которые , как правило , на порядок выше (~ 50 пН (ссылка 15 16)). Конец на присоединение корковой динеин к деполимеризующих микротрубочек способствует позиционированию веретена у почкующихся дрожжей 17 и C. Элеганс 13. Независимо от того , как мотор-зависимого скольжения и деполимеризация микротрубочек приводом корковых тянущие силы могут сотрудничать или взаимно исключают друг друга в естественных условиях является в настоящее время неизвестной.
В дополнение к микротрубочек толкающих сил и динеина опосредованную корковых тянущих сил, центросома позиционирование управляется изнутри митотического веретена многочисленными другими белками. Кинезин-5 двигателей, например, существуют как тетрамеры , которые могут поперечному сшиванию антипараллельных интерполяционных микротрубочек, что приводит к образованию наружу раздвижными сил 18-20. Члены кинезином-5 двигателя семейства требуются для центросом разделения и сборки биполярного веретена во всех эукариот изученных, за исключением C. Элеганс (обзор в ссылке 21).
Кроме того, диффундирующие сшиватели о / PRC1 семейства Ase1 также известны локализовать перекрывающихся микротрубочек области интерполяционных микротрубочек в естественных условиях и в пробирке 22-27. Силы , порожденные Ase1 приводом расширения перекрытия микротрубочки области достаточно велики , чтобы уравновешивать кинезином-14 , опосредованных скользящие силы в пробирке 28,29. В клетках, Ase1 / PRC1 необходим для стабильного формирования перекрывающихся микротрубочек областей в шпинделе midzone 25-27,30, предполагая , что силы , порожденные диффундирующих сшивающих может внести существенный вклад в шпинделе организации. И, наконец, силы из митотического хроматина и митотическую Кинетохоры влияют на сборку шпинделя и позиционирование с помощью различных путей 3. Так как эти компоненты не являются частью восстанавливающей анализов, описанных здесь, они не будут обсуждаться более подробно.
jove_content "> Различные теории существуют о том , как различные молекулярные компоненты и силы , описанные выше , сотрудничают в сборки веретена и позиционирования, но мы все еще далеки от количественного понимания. Помимо экспериментов в живых клетках, эксперименты в пробирке с очищенными компонентами обеспечивают мощный маршрут , чтобы помочь достичь этой цели. Здесь мы представляем визуальный путеводитель по адаптированной и расширенной версии недавно опубликованных методов (Roth и др. 31), в котором основные шпиндели реконструированной в капельки эмульсии вода-в-масле, начиная с минимальное количество компонентов. Используя микрожидкостных методы, сферические капли образуются с размерами, которые сопоставимы с делящихся клеток. в пределах этих капель, очищенные центросомы и тубулина могут быть объединены с целью изучения динамики астры микротрубочек, формирования сил и астры-астры взаимодействий. по введение корковых (например, динеин) и между полярными (например, Kinesin-5 / Ase1) Форс-генераторы, мывоссоздавать все более сложные веретенообразной структуры , подобные , которые начинают напоминать ситуацию в естественных условиях.Protocol
1. Приготовление микрофлюидики Chips
Примечание: Для снизу вверх изучения сборки веретена, сферические капельки эмульсии типа вода-в-масле используются. Эти водные микрокапель, отделенные от окружающей масляной фазы монослоем фосфолипидов и поверхностно-активного вещества. Эти эмульсии капли производятся внутри Микрожидкостных полидиметилсилоксана (PDMS) фишек. Изменения в канале геометрии и скорости потока могут быть использованы для размера мелодия капельным. В микрожидком конструкции, описанной здесь, капли генерируются с диаметром около 15 мкм, чтобы имитировать геометрическую удержание митотической клетки млекопитающего.
- Photomask Проектирование и изготовление пресс-форм
- Дизайн фотошаблона , содержащий три входных каналов 31. Впускной канал 1 соединяется с водной фазой, содержащей содержимое капельные (смотрите раздел 3 "Восстановление влагосодержания основные микротрубочки астры"). Впускной канал 2 подключается к масляной фазе (смотри раздел 2.1 "Липиды / масло-PHAсебе препарат "). Используйте впускной канал 3 для разбавления эмульсии капли с дополнительным липидного / масло-фазе до наблюдения ( по желанию) (рис 2а-б).
Примечание: Все входные каналы следуют пылевой фильтр (лабиринте 2 мкм каналов) для улавливания пыли, частиц PDMS и () агрегатов белков - и , чтобы предотвратить их блокируя микроканалов (рис 2d). Каналы имеют ширину 75 мкм и липидный / масляной фазы и водной фазы встречаются на широком перекрестке 12,5 мкм , где эмульсионного капли будут образовывать (рис 2С). - Заказать и получить отпечатанные фотошаблонов на пленочной подложке, с отрицательной полярности (фотошаблон будет темно с прозрачными проектируемых сооружений).
- Дизайн фотошаблона , содержащий три входных каналов 31. Впускной канал 1 соединяется с водной фазой, содержащей содержимое капельные (смотрите раздел 3 "Восстановление влагосодержания основные микротрубочки астры"). Впускной канал 2 подключается к масляной фазе (смотри раздел 2.1 "Липиды / масло-PHAсебе препарат "). Используйте впускной канал 3 для разбавления эмульсии капли с дополнительным липидного / масло-фазе до наблюдения ( по желанию) (рис 2а-б).
- Mold Изготовление
- Изготовить формы спин-покрытия СУ-8 3025 фоторезиста на 4 дюйма кремниевой пластины с помощью спин-(для нанесения покрытий 500 оборотов в минуту, 10 секунд, а затем 1800 оборотов в минуту, 45 сек) в среде чистой комнаты.
- Expose СУ-8 с покрытиемкремниевой пластины через фотошаблон. Разработка вафель в соответствии с инструкциями изготовителя для создания каналов ~ толщиной 40 мкм.
- Создание микрожидком чип
- Смешайте 10 частей PDMS предварительно полимера с 1 частью отверждения агента (всего ~ 40 гр) в лодке типа судна, используя пластиковый шпатель. Место ПДМС, содержащие лодочки сосуд в вакуумной камере в течение ~ 30 мин. для удаления пузырьков воздуха. Заверните алюминиевую фольгу вокруг пресс-формы, чтобы сформировать чашку с ~ 1 см выступающими вверх края.
- Налить PDMS (~ 75% от общего объема) в пресс-форму, оставить в вакуумной камере еще ~ 30 мин. (Для удаления пузырьков воздуха) и отверждения в течение 1 ч при 100 ° С в печи.
- Спин-пальто остальные ПДМС на предметные стекла (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 с при 4000 оборотов в минуту), с последующим отверждением в течение 1 ч при 100 ° С. Удалите пыль из предметные стекла с использованием сжатого воздуха / N 2 -поток, предварительная очистка не требуется.
Примечание: В PDMS покрытые предметные стекла могут быть использованы как для микрофонаrofluidic щепы и поточное ячейками (смотри также 2.2). - Осторожно лишить PDMS от пресс-формы с помощью лезвия бритвы и пробивки отверстий (0,5 мм для впускных отверстий, 0,75 мм для выхода) .Corona-лечить микрожидкостных чип и PDMS покрытием из предметного стекла с использованием лабораторного коронный поверхности протравливатель в течение нескольких секунд ,
- Поместите микрожидкостных чип на стекле (каналы лицевой стороной вниз) и выпекать чипы о / п при 100 ° С (рис 3а). Магазин микрожидкостных чипов в течение нескольких месяцев в пыли окружающей среды.
2. Микрожидкостных Setup
Примечание: вода-в-масле, как капельки эмульсии генерируются с использованием установки микрофлюидики и Микрожидкостных чипов, описанных выше. Состав липидной / масло-фазы можно варьировать в зависимости от потребностей эксперимента. Масляные солюбилизироваться липиды образуют монослой на границе раздела вода-масло с их полярными головными группами, с которыми сталкивается вода внутри. Для того, чтобы белки-мишени(Например , динеин) до границы капельным, низкие количества биотинил-фосфатидилэтаноламина (биотинил-PE) , липиды могут быть добавлены. Это позволяет набор биотинилированного динеин (смотрите раздел 4.1 "Dynein ориентации к капельной коры") через стрептавидин-опосредованной мультимеризацию. Капельки стабилизированы путем добавления поверхностно-активного вещества и хранится в ПДМС с покрытием проточных кювет.
- Липиды / масло Подготовительная фаза
- Смешать хлороформ-растворили 1,2-dioleoyl- Sn- глицеро-3-фосфо-L-серин (DOPS) и биотинил-PE липиды в 4: мольном соотношении 1 в стеклянной пробирке с использованием стекла пипец (широко прополоскать пипец хлороформом до того использование). Готовят всего ~ 250 мкг липидов, что приводит к концентрации липидов в ~ 0,5 мг / мл.
- Тщательно высушить липидной смеси с N 2 -потока и затем в вакуумной камере в течение ~ 1 ч. Растворение высушенных липидов в минеральном масле и 2,5% поверхностно-активного вещества до 0,5 мг / мл (~ сделать 500 мкл).
- Поместите образец липида / масло вУльтразвуковая ванна и гомогенат, в течение 30 мин. при 40 кГц, чтобы полностью растворить липиды.
- Подготовка Flow-элементная
- Спин-пальто PDMS (смотри также раздел 1.3) на покровных стекол (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 секунд при 4000 оборотах в минуту) и предметные стекла (5 сек при 100 оборотах в минуту с последующим 30 с 1500 оборотов в минуту) для того, чтобы внести деньги однородный слой ПДМС.
Примечание: Для получения оптимального качества изображения, не забудьте использовать покровные стекла с толщиной, которая соответствует объектива микроскопа. В этом случае: 1,5 (~ 0,17 мм). - Вылечить PDMS покрывающей стекла и стеклянные слайды в течение 1 ч при 100 ° С в печи. Сделать потока-клетки, тесно интервал (~ 2 мм) тонкие ломтики лабораторной герметизирующей пленки (~ 3 мм в ширину) на PDMS с покрытием из стекла горками. При хранении в среде без пыли, каналы, которые не были использованы могут быть использованы в другое время.
- Накройте проточного клетки с покровным и печатью PDMS покрытием путем плавления лабораторной герметизирующей пленки ~ 1 мин. при температуре 100 ° C, нажмитемягко (рис 3в). Закройте лаборатории Уплотнительная пленка -стекло-границы с Valap (рис 3в). Магазин флоу-клетки в течение нескольких месяцев в пыли окружающей среды.
- Спин-пальто PDMS (смотри также раздел 1.3) на покровных стекол (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 секунд при 4000 оборотах в минуту) и предметные стекла (5 сек при 100 оборотах в минуту с последующим 30 с 1500 оборотов в минуту) для того, чтобы внести деньги однородный слой ПДМС.
- Кубок Подготовка PDMS
- Для длительной обработки изображений, сделать чашку PDMS, пробивкой отверстие диаметром 4 мм в ломтиком PDMS (~ 3 мм толщиной)
- Корона-лечения PDMS срез и покровного стекла с покрытием PDMS и поместите их поверх друг друга. Выпечка чашки PDMS o / n (при 100 ° С) (рис 5а).
- Формирование Эмульсия-капелька
- Монитор образование капель на перевернутой светлого поля микроскопа. Подключить регулятор давления к микрожидком чип с использованием PEEK трубы (диаметр: 510 мкм (наружный) и 125 мкм (внутренний)) (рис.3). Заполните микрожидкостных чипы полностью с липидной / масло-фазы из впускного отверстия 2.
- Внедрение MRB80 на основе водную фазу (смотрите раздел 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры4;) от впускного 1. Контроль капельно-с изменяющимся давлением липид / масляными фазы и водной фазы для создания капель ~ 15 мкм в диаметре (рис 3b).
Примечание: С помощью этой установки, используйте ~ 800 мбар для липид / масло-фазы и ~ 200 мбар для водной фазы, чтобы создать капли требуемого размера. - После получения желаемого капельно-и необходимое количество (~ 10 мкл на пробу), собирают капли с выходным каналом и нагрузки в проточной ячейке (полностью заполнить проточные ячейки).
- Закройте концы потокорегулирующими клетки тщательно с использованием Valap (неполностью замкнутом проточном-клетки могут привести к обширному движению капель, затрудняя изображению их). Кроме того, предотвратить образование пузырьков воздуха, что приводит к движению капель.
- Промыть PEEK трубки широко изопропанолом до и после использования для предотвращения образца перекрестного загрязнения и засорения.
3. воссоздании Основные микротрубочек Астры
Примечание: содержание капельке можно варьировать в зависимости от потребностей эксперимента. Все буферы MRB80 на основе (80 мМ ТРУБЫ, 1 мМ EGTA, 4 мМ MgCl 2 (рН 6,8)), и все образцы готовят на льду. В общем, капли всегда содержат центросомами, компоненты, необходимые для полимеризации микротрубочек, система удаляющего кислород и блокирующего агента (смотри раздел 3.1). Микротрубочек сила-генераторы и необходимые кофакторы и ТАРГЕТИНГ факторы могут быть включены при желании (см разделы 4.1 и 4.2).
- Общие настройки для формирования астры в капель эмульсии (рисунок 3d)
- Готовят глюкозооксидазы (20 мг / мл глюкозооксидазы в 200 мМ DTT и 10 мг / мл каталазы) Смешать заранее и хранить в виде небольших аликвот при -80 ° С.
- Приготовьте 'блокирующий' смесь , содержащую каппа-казеин, бычий сывороточный альбумин (BSA), твин-20 и флуоресцентный декстран (как нейтральный маркер) (таблица 1) заранее и хранить в небольшом aliquoТ.С. при -80 ° С. Предотвращение повторных циклов замораживания-оттаивания. Убедитесь, что все компоненты свежеприготовленной.
- Очищают центросомами от лимфобластного линий KE37 клеток человека , как описано у Moudjou и др. 32 и хранить при температуре -150 ° C в виде небольших аликвот.
- Растаяйте центросомами при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в течение ~ 20 мин. перед использованием, чтобы обеспечить надлежащее нуклеации микротрубочек.
Примечание: Это способствует нуклеации микротрубочек во время эксперимента. - В то же время, подготовить 'анализа смеси', содержащий тубулин (флуоресцентной и «темный»), гуанозинтрифосфат (GTP), система поглотитель кислорода (глюкоза, глюкоза-оксидаза, каталаза и 1,4-дитиотреитола (DTT)), молекулярная сила генераторы (например , микротрубочки , двигатели / перекрестно сшивающие агенты), аденозинтрифосфата (АТФ) и АТФ-регенерирующей системы (фосфоэнолпируват (РЕР), пируват - киназы (ПК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)) на льду (смотри таблицу 2).
- Предварительно охладитьультрацентрифуга с воздушным приводом ротора на льду. Спин вниз образец в охлажденном ультрацентрифуга с воздушным приводом ротора (30 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 мин) .Add предварительно подогретым центросомах (оптимизировать количество центросомах стремиться капель, содержащих 1-2 центросомами).
- Использование комбинированной смеси для получения капель эмульсии с использованием методов, описанных в разделе 2.3.
| Компонент | концентрация Фото | Конечная концентрация (в тесте) | объем | Комментарий |
| Декстран-647nm | 75 мкМ | 3,75 Um (0,6 мкМ) | 5 мкл | |
| κ-казеина | 20 мг / мл | 12,5 мг / мл (2 мг / мл) | 62,5 мкл | |
| Твин-20 | 5% | 0,375% (0,06%) 7,5 мкл | ||
| БСА | 200 мг / мл | 12 мг / мл (1,9 мг / мл) | 6 мкл | |
| MRB80 | 19 мкл | |||
| 100 мкл окончательным | Хранить в 2 мкл аликвоты |
Таблица 1: Составляющие 'блокирующего Mix' Составляющими блокирующего смеси, необходимые для восстановления шпиндельных-подобных структур в капель эмульсии вода-в-масле.. Описание см Основной текст раздела 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры". Для получения дополнительной информации о материалах приведена в разделе "Материалы табл.
| Компонент | Фото concentratioN | Конечная концентрация | объем | Комментарий |
| Блокирующий смесь | 1,6 мкл | |||
| Tubulin | 500 мкМ | 30 мкМ | 0,6 мкл | |
| Tubulin-488/561 | 50 мкМ | 3 мкМ | 0,6 мкл | |
| GTP | 50 мМ | 5 мМ | 1,0 мкл | |
| Dynein-TMR | 178 нМ | 30 нмоль | 1,7 мкл | |
| стрептавидином | 5 мг / мл | 200 нМ | 0,4 мкл | Для коркового Dynein только |
| Kinesin-5 | 1,6 мМ | 80 нМ | 0,5 мкл | |
| АТФ | 25 мМ | 1 мМ | 0,4 мкл | Для двигателей только |
| PEP | 0,5 М | 25,6 мМ | 0,5 мкл | Для двигателей только |
| PK / LDH | 800 U / U 1100 | 23 U / 32 U | 0,3 мкл | Для двигателей только |
| Ase1-GFP | 400 нМ | 80 нМ | 2,0 мкл | |
| глюкоза | 2,5 М | 50 мМ | 0,3 мкл | Последний шаг |
| Глюкозо-оксидазы | 50x | 1.0x | 0,3 мкл | Последний шаг |
| MRB80 | Икс | |||
| 9 мкл Окончательный |
Таблица 2: Составляющие «пробирной Микс». Материалы табл.
4. Введение Шпиндель сборочно-факторы
Примечание: В анализах , описанных здесь, зеленый флуоресцентный белок (GFP) , -tagged усеченный вариант S. CEREVISIAE динеин использовался, искусственно димеризована с помощью амино-концевой глутатион S-трансферазы (GST) -tag 33. Этот белок очищают с помощью аффинной метки, который содержит две копии с белком А IgG-связывающий домен. Вариант, используемый здесь, помечен меткой тетраметилродамин (ПСР) на карбокси-концевой и N-концевой SNAP-тег используется для biotinylate очищенных белков. Для получения дополнительной информации построить см Рот и др 31. для получения более подробной очистки, см RecK-Петерсон и др. 33. GFP-биотин-динеин-TMR могут быть направлены на капельной-коры за счет образования биотин-стрептавидин комплексов , которые связывают динеин с биотинил-PE липиды (рис 3e).
- Dynein Ориентация на дроплета Cortex
- Включить GFP-биотин-Dynein-TMR в 'анализа смеси' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 30 нМ. Включают стрептавидин в 'анализа смесь' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 200 нМ.
Примечание: Dynein зависит от АТФ гидролиза для пошагового движения на микротрубочки. Таким образом, включают АТФ и систему АТФ регенерирующим (содержащий ПЭП и PK / LDH) в 'анализа смеси' (смотри таблицу 2).
Примечание: Рекомбинантный полной длины S. pombe GFP-Cut7 (кинезином-5) был любезно предоставлен в Diez лаборатории (Центр молекулярной биоинженерии, Technische Universitat Dresden, Дрезден, Германия), см. Рекомбинантный полный лength гистидин-меченый S. pombe GFP-Ase1 был любезно предоставлен из Янсонс лаборатории (Wageningen University, Вагенинген, Нидерланды) и добавляли к смеси для анализа '' при концентрации при 80 нМ.
- Включить GFP-биотин-Dynein-TMR в 'анализа смеси' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 30 нМ. Включают стрептавидин в 'анализа смесь' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 200 нМ.
5. обработки изображений
Примечание: В ходе эксперимента рост микротрубочек можно регулировать путем изменения температуры. При выборе условий формирования изображения, компромиссы должны быть сделаны между высоким качеством изображения и возможностью контроля шпинделя в сборе для долгого периода времени. Для сравнения кинетики формирования шпинделя при различных условиях, капли с различным содержанием могут быть смешаны и отображены в том же самом канале потока.
- Основные параметры обработки изображений
- Изображение в контролируемой температурой окружающей среды с использованием закрытой камере. Визуализация отдельных микротрубочек после ~ 30 мин при 26 ° С. В то время как изображения, способствуют росту микротрубочек путем повышения температуры до ~ 30 ° C.
Примечание: settings ниже являются специфическими для нашей установки микроскопа и может меняться в зависимости от различных систем и различных операционных программного обеспечения. Все анализы, описанные здесь, изображаются на моторном перевернутой системе с конфокальной головкой вращающимся диском и управляется с помощью программного обеспечения обработки изображений, таких как Андор IQ 3.1. Получить все изображения с целью иммерсионным 100X и EMCCD камеры. - Набор лазеров возбуждения 488, 561 и 641 нм с интенсивностью примерно ~ 10%. Перейти к панели '' захвата, нажмите на вкладку и слайд-лазер 'AOTF' интенсивности до 10%. Нажмите на ссылку "записи", чтобы сохранить настройки.
- Для г -projections, возьмите стеки с интервалом в 1 мкм (~ 20 изображений / капельных). Перейти к основному "камеры" панели, нажмите на кнопку "редактировать г 'и установите' Z 'шага до 1.0. Нажмите на" Далее ", чтобы сохранить настройки.
- Установить максимальную линейную ЭМ-усиления, нажав на вкладке "камеры" на панели "захвата" и переместите ползунок усиления EM 300. Установить экспозициюраз в 200 мс в той же вкладке. Нажмите на ссылку "записи", чтобы сохранить настройки.
- Изображение в контролируемой температурой окружающей среды с использованием закрытой камере. Визуализация отдельных микротрубочек после ~ 30 мин при 26 ° С. В то время как изображения, способствуют росту микротрубочек путем повышения температуры до ~ 30 ° C.
- Живая съемка
- Для живого изображения, с помощью элементов управления программного обеспечения делают Z -projections каждые 2 мин. на протяжении 1-2 ч за счет снижения времени экспозиции до ~ 100 мс. (как описано в разделе 5.1.4) и увеличить Z -intervals до 2 мкм (как описано в разделе 5.1.3). Установите временные ряды в главной панели "камеры", нажмите на кнопку "повтор т 'и установить до 2 мин. интервалы в течение общего времени 120 мин.
- Для живых анализов, используйте чашку PDMS вместо обычного проточные ячейки, чтобы гарантировать, что капли, как неподвижна, насколько это возможно.
- В сочетании с изображениями из 2-х условий
- Образуют капли, используя микрофлюидики и хранить на верхней части ПДМС с покрытием предметное стекло на льду. Это предотвращает нуклеации микротрубочек, пока второй набор капель не сформирован. Перед тем как производить второй набор капель, промойте PEEK трубки и микрожидкостных чип сMRB80 и полностью наполнить микрофлюидальный чип с липидной / масло-фазы.
- Сформировать капли с и без флуоресцентного декстрана (или с использованием декстрана с различными флуорофоров длины волны) для того, чтобы различать между каплями с различными цветами. После получения второй партии капель, осторожно смешать капли с помощью пипетки и загружают в единый поток клеток / PDMS чашки.
- Анализ изображений.
- Анализ изображений с помощью Фиджи (программное обеспечение с открытым исходным кодом доступны в Интернете) 34.
- Для живых тестов, конвертировать стеки в hyperstacks используя 'изображение' - 'hyperstacks' - 'стека HyperStack'. Установите правильное число Z-срезах и временных рамок.
- Для того чтобы сделать Z-проекции, выберите 'изображение' - 'стеки' - 'Z-проект ". Выберите проекцию 'Макс' интенсивности.
- Для 3D-реконструкций, сначала перейдите в "образ" - "Свойства" и установить правильный пиксель, пиксель, глубина высота системы воксельном и фрAME интервалы. Нажмите 'OK'. Выберите 'изображение' - 'стеки' - '3D-проект ", установите флажок" интерполировать "флажок и нажмите кнопку" OK ".
Representative Results
Методы, представленные в предыдущих разделах, позволяют воссоздание шпинделей-подобных структур с возрастающей сложностью, используя геометрическую удержание капель эмульсии вода-в-масле. В этом разделе описываются типичные результаты, которые качественно демонстрируют способность этих анализов.
Во время митоза, когда биполярный шпиндель собран, клетки округлить до формирования сфер с диаметром примерно 15 мкм, как измерено в клетках человека. Эта характерная форма митоза клетка обеспечивает геометрическую границу , что и ограничивает и направляет размер шпинделя и ориентацию 35,36. Микрожидком методы, обеспечивают уровень геометрического конфайнмента , который точно напоминает ситуацию , наблюдаемую в живых клетках и , следовательно , допускает снизу вверх реконструкцию митотических веретен в пробирке.
(рис 4а, левая панель). Примерно через 20-30 мин, первые микротрубочки становятся видимыми и центросома диффузия становится ограниченным, как микротрубочки растут против коры во всех направлениях. Астры с микротрубочками промежуточной длины (примерно 50% от диаметра капель) может (стерически) отталкиваются друг от друга, с микротрубочками толкающих друг против друга, остальные Центросомы и кора головного мозга. Это приводит к типичной 'биполярного' веретеновидной договоренности с двумя центросомах противостоящие друг другу (фиг.4А, средняя панель). Когда микротрубочки растут дольше, чем ~ 50% от капельной-диамметр, центросомы получить отодвинута еще дальше на противоположных границах капельке, с микротрубочек , растущих вдоль коры капли (рис 4а, правая панель). Важно отметить, что темпы роста микротрубочек в этих анализах, очень чувствительны к температуре и как тубулина-концентрации. Эти параметры будут, следовательно, сильно влияет на время, когда зарождение сначала наблюдается и при установившихся позиции астра достигаются.
В клетках коры головного мозга тянущие силы возникают за счет формирования несущих вложений между микротрубочки плюс-концами и Cortex-ассоциированных динеин. В клетках животных, эта ассоциация зависит от комплекса Gαi / LGN / NuMA, который является мишенью для плазменной мембраны с помощью N-концевого миристоилированию из Gαi 1. В этих восстанавливающих анализах, требование комплекса Gαi / LGN / NuMA обойдена путем прямого соединения с динеин биотинилированных липидов черезформирование биотинстрептавидин-биотин комплексов. Эти облигации являются относительно стабильными (K D ~ 10 -14 М) 37 и быстро образуют ( как правило , в течение 10 мин после образования эмульсии капель до микротрубочек зарождение становится очевидным) (4б). При наличии корковой динеин, Центросомы обычно сохраняют более центральное положение, в то время как при отсутствии динеин, Центросомы выталкиваются в противоположные стороны коры капли (рис 4в). Мы Причиной этого является результатом двух эффектов, которые предотвращают и противодействия микротрубочек толкая сил. (1) Dynein непосредственно способствует микротрубочек катастрофами, ограничивая тем самым длину микротрубочек и предотвращения чрезмерного микротрубочек потери устойчивости, и (2) корковых тянущие усилия приводят к чистому центрирующих сил на отдельных астры 8, которые противодействуют астра-астры силы отталкивания.
Диффундирующего сшивающий Ase1 индуцирует Forces , которые имеют тенденцию к увеличению зоны перекрытия анти-параллельных микротрубочек 29. В соответствии с этим, в присутствии Ase1 (и отсутствие динеин) Центросомы находятся близко друг к другу с Ase1 локализацией в комплекте интерполяционных микротрубочек (рис 4г). Члены семьи кинезином-5 приводов центросом разделение, обеспечивая толкающее усилие внутри шпинделя (см введение). В присутствии Cut7 (С. pombe кинезином-5 ортолог), Центросомы выталкиваются на противоположных сторонах капель эмульсии, даже в присутствии Ase1 (рис 4д). Объединив корковых и между полярными генераторов силы, уровень сложности может быть дополнительно увеличена в этих экспериментах, в конечном итоге приводит к исчерпывающему пониманию биполярной сборки митотического веретена. Подробное количественное описание этих результатов будет доступна в будущем (Roth и др., Рукопись в процессе подготовки).
(рис 5в). Это облегчает изучение как стационарного поведения и шпинделя кинетики сборки. Объединив капельки с различным содержанием в том же образце, то есть, например, можно непосредственно сравнить центросоме установку и монтаж шпинделя кинетику в каплях с и без корковых генераторов силы (рис 5b).
Рисунок 1: Силы , действующие на веретена Несколько силовоспроизводящую молекулы действуют на микротрубочки митотического веретена , чтобы способствовать формированию шпинделя и позиционирования.. Микротрубочки, которые растут в клетки коры порождают толкающую силу на центросоме. Кортикальная динеин (фиолетовый) захватывает деполимеризации микротрубочек и создает тяговое усилие на центросомах. В шпинделе, Kinesin-5 / Cut7 моторные белки обеспечивают наружу сила скольжения на анти-параллельных микротрубочек, в то время как сшиватели семейства PRC1 / Ase1 порождают противоположную наружу сила скольжения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Рис . 2: Микрожидкостных Chip Design (A) Дизайн 4 - дюймовый фотошаблон , содержащий 4 микрожидкостных чипов. (В) подробное представление одной микросхеме. Чипсы содержат один выпускной канал и три входных каналов с последующим пылевого фильтра. Впускной канал 1 содержит водную фазу, канал 2 липидного / масло-фазы и канал 3 может быть использован для разбавления образовавшиеся капли с дополнительной липид / масло-фазы. (C) , детальное представление о соединении , где липид / масло-фаза (прибывающий сверху и снизу) встречается с водной фазой (поступая с левой). На стыке, капли будут образовываться и течь в направлении выпускного канала справа. (D) Подробное представление пылевого фильтра с 2 мкм каналами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Методология Водно-в-масле Droplet формирования (А) Микрожидкостных чип и микрофлюидики трубки на ярко-поле микроскопа. Оба Водо- и липид / масло фазные трубы соединены с чипом входных отверстий 1 и 2, соответственно. (B) Ограничение на микрофлюидики чипе , где влаго- и липидные / масляные фазы встречаются. Изменяя давление, капли размер можно регулировать. (C) Дизайн PDMS покрытием потока клеток. После загрузки капель в проточной камере, открытые концы закрыты дополнительными Valap. (D) Схема формирования капель. Капельки используются для инкапсулирования центросомами, тубулина и дополнительные компоненты, необходимые для формирования веретена. (Е) Схема корково-динеин адресности. Биотинилированных (Bio) динеин предназначен для биотинилированных липидов через стрептавидином (ГНТО). 
Рис . 4: репрезентативные результаты шпинделя Reconstitutions с возрастающей сложностью (А) Максимальные проекции интенсивности капель , содержащих два центросомами , показывающие примеры коротких, промежуточных и длинных микротрубочек. Центросомах и микротрубочки визуализировали добавлением 10% HiLyte-488 меченых тубулина. Шкала бар = 10 мкм. (B) Локализация GFP-биотин-динеин-TMR в отсутствие (-, слева) и наличие (+, справа) стрептавидин (полоской). (C) микротрубочек позиционирование астры в отсутствие (-, слева) или в присутствии (+, справа) корковых GFP-биотин-динеин-TMR. (D) микротрубочек астры (левая панель, грееп) позиционирование в присутствии Ase1 (средняя панель, красный). (E) микротрубочек астры (левая панель, зеленый) позиционирование в присутствии Ase1 и Cut7 (кинезином-5) (средней панели, красный). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 5: Визуализация Aster позиционирования Динамика в пробирке (A) Конструкция чашки PDMS , что позволяет визуализацию капель в течение нескольких часов.. (Б) создания, хранения и обработки изображений капель (передача) , содержащие различное содержание, иллюстрированные отсутствии (слева) включение (справа) флуоресцентного декстрана (Alexa 647). (C) одной плоскости изображения в 60 мин покадровой (2 минутные интервалы) взяты из г-стека (2 мкм) расстояния от объявленияroplet содержит один центросому. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Методы, описанные здесь, присутствующие в последнее время усилия для восстановления основных митотических веретен в капельки эмульсии вода-в-масле. Изучение сборки веретена в пределах геометрических границ обеспечивает многочисленные преимущества. Важные механизмы обратной связи существуют между микротрубочек митотического веретена и геометрических ограничений, в которых они собраны. Микротрубочки может генерировать толкая силы, когда они растут в геометрической границы, что может привести к смещению митотического веретена. Кроме того, растет в физический барьер может вызывать микротрубочек катастрофах. Кроме того , сборка шпинделя в пределах ограниченной геометрии может привести к постепенному истощению отдельных компонентов, таких как тубулин, в свою очередь , непосредственно влияет на скорость роста микротрубочек 36. Все эти существенные детерминанты шпиндельного узла, которые могут быть исследованы с помощью анализов, описанных здесь.
Описанные анализы очень чувствительны к небольшой концентрации differeNCES компонентов капельке. Это случай для тубулина, где незначительные различия концентрации может привести к или слишком медленно или слишком быстрого роста микротрубочек. В этом случае, микротрубочки темпы роста часто могут по-прежнему быть скорректировано путем регулирования температуры в течение первой ~ 30 мин эксперимента. Митотическое сборка шпинделя и позиционирование также очень чувствительны к изменениям концентрации (корковый) силовых генераторов. Это, вероятно, зависит от концентрации, чистоты и активности очищенных компонентов и должна быть тщательно титруют для каждого вновь очищенного белка.
Кроме того, некоторые компромиссы должны быть сделаны в настройках обработки изображений, в зависимости от характера анализа. Первоначально высокие уровни растворимых флуоресцентных димеров тубулина затрудняют изображения отдельных микротрубочек. Поскольку микротрубочки становятся длиннее и растворимым тубулина медленно истощаются, отношение сигнал-шум постепенно становится все выше и позволяет визуализацию индивидуаль микротрубочки. В отличие от установок с открытыми системами, геометрическое ограничение предотвращает обмен флуоресцентных молекул и компонентов системы поглотитель кислорода внутри объемного резервуара, что приводит к значительным обесцвечиванием. Специально для контроля сборки веретена и позиционирование в течение долгого времени, требуется изображение с низкой интенсивности света, даже при наличии мощной системы удаляющего кислород.
Эти методы позволяют снизу вверх воссоздание упрощенных шпинделя подобных структур в лабораторных условиях . В дополнение к компонентам , представленных здесь, и многие другие факторы , как было описано , чтобы влиять на формирование биполярного веретена, позиционирование, ориентацию, шейпинг, 3 и т.д.. Эта система может быть расширена для изучения индивидуальных и комбинированных эффектов дополнительных генераторов силы. Важный вклад в формирование веретена, которые в настоящее время отсутствуют в этой системе являются митотических хромосомах. Митотический хроматин было показано,формирование прямого шпинделя (1) chromokinesins , который может генерировать так называемый "полярно-выталкивания силы '3, (2) формирование градиента RanGTP хроматином связанного RanGEF RCC1 38, (3) Кинетохоры , которые могут взаимодействовать с (деполимеризующим ) микротрубочки 39 и (4) сама хроматина, которая может функционировать в качестве механической пружины в-между противоположными микротрубочек 40.
Наконец, описанная система в настоящее время обеспечивает ограниченную временную и пространственную контроль за деятельностью и локализацию вводимых силовых генераторов. В клетках, многие шпинделей факторы сборки локализуются в определенных отсеках или активны в течение ограниченного временного окна. Ярким примером может служить деятельность динеин, которая специфически обогащается на задней стороне C. Элеганс одноклеточные стадии эмбриона содействовать асимметричный позиционирование шпинделя и деление клеток. В этой системе, мы в настоящее время изучает возможность имитации такого тemporal и асимметричные методы деятельности с использованием заимствованных из опто-генетических методов. Кроме того, как это имеет место для C. Элеганс эмбрионов и клеток с жесткой клеточной стенки, многие клетки не сгонять в митозе. Форма геометрической заключения будет иметь существенное влияние на силы , действующие на шпинделе 41. Поэтому он будет иметь важное значение для восстановления узла шпинделя и позиционирования в несферических капель , а также, потенциально с использованием более сложных микрожидкостных систем , которые позволяют обработка и хранение эмульсии капель 42,43. Наконец, в тканях, клетка-клетка и клетка-сигнализации субстрат и крепления обеспечивают внешние сигналы, которые могут быть переведены на направленный ориентации шпинделя, как это часто наблюдается в эпителиальных клетках и стволовых клеток. Все эти специализированные аспекты не были приняты во внимание в этом текущем исследовании , и может обеспечить будущие задачи по созданию в сторону более в естественных условиях -как reconstitutions митотического веретена АССАМБЛЕЯLY и позиционирование.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24 mm x 60 mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26 mm x 76 mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA - Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
- Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
- Williams, S. E., Fuchs, E.
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
- Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
- Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
- Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
- Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
- Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
- Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
- Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
- Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
- Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
- Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
- Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
- Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
- Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
- van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
- Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P.
- Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
- Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
- Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
- Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
- Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
- Roth, S., Laan, L., Dogterom, M.
- Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Green, N. M.
- Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
- Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
- Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
- Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
- Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
